1

Cz.2_ GENETYKA_Laboratorium_2012

1. IZOLACJA PLAZMIDOWEGO DNA BAKTERII

Opracowano szereg metod oczyszczania plazmidowego DNA bakterii

, z których każda obejmuje

trzy etapy: -

hodowlę bakterii (namnażanie plazmidów)

-

lizę bakterii, (rozpuszczenie)

- oczyszczanie plazmidowego DNA.

Plazmidy izoluje się najczęściej z hodowli płynnych, w których podłoże uzupełnione jest

odpowiednim antybiotykiem, którego gen oporności znajduje się na plazmidzie. We wszystkich

metodach izolacji plazmidowego DNA wykorzystuje się dwie istotne różnice pomiędzy DNA

genomowym a DNA plazmidowym bakterii: -

DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA

plazmidu, - podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale

zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang. covalently closed

circle).

Odwirowane komórki bakteryjne poddawane są lizie. Bakterie ulegają lizie pod wpływem

detergentów (SDS, Sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalników organicznych, roztworów

alkalicznych (liza alkaliczna) lub w

ysokiej temperatury (liza termiczna). Stosowany może być

również lizozym - enzym trawiący ścianę komórkową bakterii (nie działa w pH<8.0). W metodzie lizy

alkalicznej bufor o wysokim pH zawierający NaOH i SDS powoduje całkowitą lizę komórki jak

również denaturację genomowego DNA, natomiast plazmidowy DNA w formie CCC zostaje

zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach. W przypadku otrzymywania plazmidowego DNA

metodą termiczną, czynnikiem denaturującym jest wysoka temperatura, w której DNA genomowy i

pla

zmidowy zachowują się podobnie jak w wysokim pH.

Następny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu DNA od związanych z nim białek.

Zwykle stosuje się do tego celu nasycony buforem roztwór fenolu lub jego mieszaninę z

chloroformem i alkoholem izoamylowy

m. Białka można również usunąć przez trawienie ich

proteinazami (zwykle proteinazą K). Usunięcie kwasu RNA przeprowadza się enzymatycznie,

inkubując próbki z RNazą (wolną od DNazy), przez sączenie molekularne lub wirowanie w

gradiencie gęstości. W metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cząsteczki DNA ulegają denaturacji,

natomiast superzwinięte formy CCC plazmidu są po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH

roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan amonu) prowadzi do renaturacji jedynie DNA

pla

zmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytrąca się w postaci

serowatego osadu. Z odbiałczonych próbek DNA wytrącany jest alkoholem etylowym lub

izopropanolem w obecności octanu potasowego, sodowego lub amonowego.

Wszystkie metody otrzym

ywania plazmidowego DNA, z wyjątkiem lizy alkalicznej, wymagają

oddzielenia tego DNA od DNA genomowego w gradiencie chlorku cezu w obecności bromku

etydyny. Wykorzystuje się tu fakt, że bromek etydyny intensywniej interkaluje do zdenaturowanego

DNA genomow

ego niż do DNA plazmidowego, powodując częściowe rozwinięcie helisy DNA i

2

wydłużenie cząsteczki, co powoduje zmniejszenie jej gęstości pławnej. Różnica w gęstości

pomiędzy formą CCC a liniową i kolistą OC (ang. open circle) wynosi około 0.04 g/ml i jest

wy

starczająca do oddzielenia superzwiniętego DNA podczas wirowania w gradiencie gęstości

chlorku cezu w obecności bromku etydyny. Pasmo superzwiniętego DNA układa się poniżej pasma

utworzonego przez liniowe fragmenty chromosomowego DNA oraz formy liniowej i OC plazmidu.

Cząsteczki RNA mają największą gęstość i zbierają się na dnie probówki wirowniczej, zaś białka

pozostają w górnej warstwie roztworu.

Oczyszczanie plazmidowego DNA przeprowadzić można również metodą wirowania lizatów

komórkowych w gradiencie alkalicznej sacharozy (w środowisku alkalicznym formy liniowe i OC

ulegają rozdzieleniu na pojedyncze nici i sedymentują 3-4 razy wolniej niż niezdenaturowana

superzwinięta forma CCC), stosując wymieniacze jonowe (np. kolumienki Qiagen) lub filtrację na

żelach.

PYTANIA

1.

Jakie są etapy izolacji plazmidowego DNA bakterii

2.

Jakie są różnice miedzy DNA genomowym a plazmidowym bakterii?

3.

Jak usuwa się białka, genomowe DNA i RNa z próby

4. Narysuj wynik

wirowania gradiencie chlorku cezu w obecności bromku etydyny w trakcie lizy

alkalicznej

ENZYMY RESTRYKCYJNE. MAPY RESTRYKCYJNE

Enzymy restrykcyjne (ang. restriction enzymes) są enzymami izolowanymi z bakterii, zdolnymi do

rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA. Enzymy

rest

rykcyjne typu II wymagają jako substratu dwuniciowej cząsteczki DNA, zawierającej co najmniej

jedną sekwencję rozpoznawaną przez dany enzym, oraz jonów magnezu. DNA zostaje przecięte w

obrębie lub w okolicy palindromowej sekwencji rozpoznawanej. Sekwencja palindromowa w

genetyce oznacza taką sekwencję DNA, dla której sekwencja komplementarna jest identyczna (przy

założeniu, że obie sekwencje czytamy z uwzględnieniem polarności nici; zgodnie z przyjętym

obyczajem -

od końca 5' do 3'):

5' A A T T 3'
3' T T A A 5'

5' A G G C C T 3'
3' T C C G G A 5'

Niektóre enzymy produkują "lepkie końce" 3'. Wszystkie natomiast pozostawiają grupę fosforanową

na końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'. "Lepkie końce" mają duże znaczenie przy

klonowaniu genów: sekwencje "lepkich końców" powstałych w wyniku działania tego samego

enzymu są komplementarne. W obecności enzymu ligazy można takie cząsteczki ponownie

połączyć ze sobą kowalencyjnie. Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych opiera się na literowych

skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii, a druga i trzecia od gatunku.

Następna litera oznacza szczep lub typ, a kolejne enzymy z danego typu lub szczepu otrzymują

liczby rzymskie.

Enzymy pochodzące z różnych szczepów, ale rozpoznające te same sekwencje DNA, nazywają się

izoschizomerami.

3

Zdarza się, że dwa enzymy wytwarzają takie same "lepkie końce", mino że rozpoznają różne

sekwencje DNA. Enzym BamHI produkuje końce GATCC (rozpoznaje sekwencję GGATCC), zaś

enzym BglII, wytwarzający takie same "lepkie końce", rozpoznaje sekwencję AGATCT. Umożliwia

to klonowanie DNA strawionego BamHI w wektorze strawionym BglII, ale nie każdy sklonowany

odcinek DNA będzie mógł być wycinany enzymem BglII.

Do pojedynczej reakcji trawienia używa się zwykle 0,2 - 1 ug DNA w roztworze o objętości 20 ul lub

mniejszej. Bufory do trawień przygotowuje się w postaci 10-krotnie stężonych roztworów różniących

się między sobą zawartością soli. Jeżeli DNA ma być strawiony dwoma enzymami wymagającymi

różnych buforów, najpierw przeprowadza się trawienie w buforze o niższej soli, a następnie

podwyższa się stężenie soli w mieszaninie przez dodanie odpowiedniej objętości stężonego NaCl.

Inkubację preparatów DNA z enzymami restrykcyjnymi prowadzi się w temperaturze 37

o

C w czasie

1 godziny lub dłużej. Przerwanie reakcji (zwykle niekonieczne) można przeprowadzić przez

termiczną inaktywację enzymu (15 minut, 65

o

C) lub dodając EDTA pH 8.0 do końcowego stężenia

10 mM (chelatacja jonów magnezu). Źródłem informacji o enzymach restrykcyjnych (ich

termostabilności i wymaganiach co do stężenia soli) są katalogi firm produkujących te enzymy (np.

New England Biolabs, Promega). Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która trawi

kompletnie 1 ug DNA faga l (ok. 50 kb) w czasie 1 godziny w 37oC.

Podstawową cechą produktów trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi jest to, że otrzymywane

fragmenty DNA dają się rozdzielić na żelach w taki sposób, że w każdym prążku na żelu znajdują

się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Fakt ten pozwala na precyzyjną

obróbkę DNA, m.in. konstruowanie map restrykcyjnych badanego DNA (mapa restrykcyjna

wskazuje miejsca cięte przez enzymy restrykcyjne). Analizując na żelach produkty trawienia danego

DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi, stosowanymi pojedynczo i w kombinacjach, można ustalić

wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Oprócz

tego, DNA pocięty enzymami restrykcyjnymi można poddawać ligacji z wektorem i tworzyć

zrekombinowane (zawierające sklonowany DNA) plazmidy. Aby wyznaczyć wielkość nieznanych

fragmentów DNA, stosuje się standardy wielkości (cząsteczki DNA o znanej wielkości, poddawane

elektroforezie w tym samym żelu co cząsteczki badane).

PYTANIA

1. Narysuj

wymyśloną sekwencje DNA palindromowi i nie palindromowi

2.

Czy różne enzymy restrykcyjne mogą produkować takie same lepkie końce

3. Co oznacza jedna jednostka enzymu restrykcyjnego?
4.

Czy w jednej reakcji można używać więcej niż jednego enzymu

4

Ćwiczenia praktyczne

1.

Otrzymywanie DNA plazmidowego na małą skalę (minilizaty) za pomoca zastawu do

izolacji Plazmid Mini

Przed przystąpieniem do ćwiczeń przeczytaj ze zrozumieniem całą instrukcje do zestawu (plik

PDF).

Odczynniki i aparatura:

-

pipety automatyczne i jednorazowe końcówki

-

probówki szklane (10 ml) zawierające

całonocna kulturę bakteryjną (LB Amp+)
- woda
-

probówki Eppendorfa,

-

mikrowirówka,

-

pisaki do probówek/ ręczniki

papierow/stojaki/alkohol do sterylizacji miejsca
pracy, rękawiczki

Wykonanie: postępuj zgodnie z protokołem izolacji z uwzględnieniem dwóch pierwszych kroków

(nie opisanych w protokole)

1.

rozlać hodowle bakteryjną do probówek Eppendorfa i zwirować bakterie w mikrowirówce przez 1

minutę (2 x 1.5 ml),

2.

odsączyć pipetą pożywkę do sucha,

P

odpisz swoje próby (tak żeby je rozpoznać do trawienia za tydzień)

2. Trawienie plazmidu pRS 416 enzymami restrykcyjnymi i sporządzanie mapy restrykcyjnej

(planowanie na lab.II, przeprowadzanie reakcji na lab.III)

Odczynniki i aparatura:

Mapa plazmidu

- enzymy - dostepna z ZGE (ApaI; BamHI; Bsp68I (NruI); Bsu15I (ClaI); Eco147I (StuI);

Eco321 (EcoRV); EcoRI; HindIII; NcoI; NdeI; NotI; NsbI (MstI); PaeI (SphI); PvuI; PvuII;

SacI; Sali; ScaI; SmaI; SmiI (SwaI); XbaI; XhoI)

- bufory,

-

katalogi enzymów restrykcyjnych (podane temperatury inkubaji, bufory i dezaktywacje)

1. Zaplanuj ciecie restrykcyjne wybranymi dwoma enzymami restrykcyjnymi pojedynczo i

oboma na raz.

2.

Na podstawie katalogów dobierz bufory, temperaturę inkubacji i dezaktywacji.

Dostosuj do wybranych enzymów podany poniżej typowy protokół:

Zmieszaj

w eppendorfie w podanej kolejności:

1µl 10x Buffer
6.5µl H2O
2µl DNA
0.5µl Enzyme
Inkubuj przez 1h w 37oC

3.

Na postawie mapy oszacuj wielkość powstałych po cięciu fragmentów plazmidu.

4.

Narysuj jak będzie wyglądał żel po elektroforezie

5

Źródło:http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/yeast_plasmids/pRS416/

3.

Reakcja trawienia enzymami restrykcyjnymi (lab.III)

Odczynniki i aparatura:

- plazmid pRS416 (4898 bp

) o stężeniu ok. 3 ug/ul, (po izolacji)

-

probówki Eppendorfa,

-

pipety, końcówki do pipet

- bufory i enzymy restrykcyjne

Wykonaj reakcję zgodnie z protokołem opracowanym na Lab.II (dostosuj go do własnych

enzy

mów i buforów).

Reakcję przygotowuje się na lodzie!!!!!

6

4. Eektroforeza agarozowa -

sprawdzenie cięcia restrykcyjnego (Lab.IV)

Odczynniki i aparatura:

- plazmid nie

pocięty

- plazmid

pocięty

-

standard wielkości DNA,

-

obciążnik do prób (niebieski)

-

probówki Eppendorfa,

- aparat do elektroforezy (laboratoria 3)
Gotowy zel agarozowy zawierający barwnik
DNARed

-

do strawionych próbek oraz do markera wielkości DNA dodać 1/10 objętości barwnika do

elektroforezy,

-

nanieść próbki do studzienek na żelu przy pomocy pipety automatycznej (Uwaga! Minimalna ilość

DNA, którą widać na żelu w postaci prążka, wynosi około 10 ng. Nie należy przekraczać 200 ng

DNA w prążku),

-

prowadzić elektroforezę w buforze TBE przy napięciu nie przekraczającym 5 V/cm,

-

sfotografować żel na transiluminatorze w świetle UV,

-

oszacować na podstawie krzywej wielkości trawionych fragmentów DNA i porównac z planowana

przez siebie.

Przygotowanie dr Dominika Włoch-Salamon na podstawie:

http://arete.ibb.waw.pl/docs/Skrypt-dla-fakultetu-99.html

RAPORT

Zaplanuj ciecie restrykcyjne wybranymi dwoma enzymami restrykcyjnymi pojedynczo i oboma na

raz. Na podstawie katalogów dobierz bufory, temperaturę inkubacji i dezaktywacji.

1. Wypisz dostosowany

do wybranych enzymów podany poniżej typowy protokół:

Zmieszaj w eppendorfie w podanej kolejności:
1µl 10x Buffer
6.5µl H2O
2µl DNA
0.5µl Enzyme
Inkubuj przez 1h w 37oC

2.

Podaj wielkości fragmentów DNA powstałych po cięciach zaplanowanych przez Ciebie

3.

Narysuj jak będzie wyglądał żel po elektroforezie