2013-01-24

1

Wprowadzenie do genetyki sądowej

© 2013 | Pracownia Genetyki S

ą

dowej | Katedra i Zakład Medycyny S

ą

dowej

Materiały biologiczne

Inne:

włosy z cebulkami, paznokcie

mo

ż

liwa degradacja - tkanki utrwalone w formalinie/parafinie,

Materiały biologiczne:

prawidłowe zabezpieczanie

ś

ladów

Warunki

Materiały suche: temp. pokojowa, dost

ę

p powietrza

Ciecze, tkanki mi

ę

kkie: -20

o

C do -80

o

C (ko

ś

ci)

Metody

Krew na antykoagulant (-20

o

C) lub bibuła/płótno/FTA (+20

o

C)

Wymazy (-20

o

C lub + 20

o

C po wysuszeniu)

Wysuszenie / zapakowanie w papierow

ą

kopert

ę

;

temperatura pokojowa – niedopałki, znaczki, odzie

ż

(pobranie fragmentów lub w cało

ś

ci), włosy z cebulkami,

paznokcie wraz z materiałem znajduj

ą

cym si

ę

pod nimi

2013-01-24

2

Materiały biologiczne:

prawidłowe zabezpieczanie

ś

ladów

Powierzchnie wchłaniaj

ą

ce:

- wyci

ę

cie fragmentu (dywan)

- zabezpieczenie w cało

ś

ci (odzie

ż

)

Powierzchnie niewchłaniaj

ą

ce:

- zabezpieczenie na jałow

ą

wymazówk

ę

(d

ź

wignia zmiany biegów)

- zabezpieczenie fragmentu przedmiotu wraz z zaplamieniem (kawałek
stłuczonej szyby)
- zabezpieczenie w cało

ś

ci, je

ś

li gabaryty niezbyt du

ż

e

Materiały biologiczne - testy jako

ś

ciowe

A.

Ś

lina

– test niespecyficzny – test płytkowy (

α

-amylaza)

– test specyficzny – test immunochromatograficzny (

α

-amylaza)

– test odciskowy

B. Krew
– testy niespecyficzne (luminol, H

2

O

2

)

– test specyficzny – immunochromatograficzny (hemoglobina ludzka)

C. Sperma
– test niespecyficzny – UV / test bardziej specyficzny – Bluemaxx (te

ż

ś

lina i mocz)

– test specyficzny - immunochromatograficzny (obecno

ść

PSA)

Materiały biologiczne - testy jako

ś

ciowe

B. Krew
– test niespecyficzny - luminol

2013-01-24

3

DNA: j

ą

drowy i mitochondrialny

•

Sekwencje minisatelitarne – VNTR

Jednostka powtórzeniowa: od 9 do 100 bp / cała sekwencja kilka tysi

ę

cy bp

Bardzo wysoki stopie

ń

polimorfizmu

Polimorfizm wykrywany technikami: VNTR-RFLP lub VNTR-PCR

•

Sekwencje mikrosatelitarne – STR (krótkie powtórzenia tandemowe)

Motyw repetytywny: 2 – 6 bp

Du

ż

y polimorfizm;

gł. metoda analizy - PCR

Zró

ż

nicowanie sekwencji tandemowych

Praca w laboratorium genetycznym – etapy:

1. Izolacja

2. Pomiar st

ęż

enia DNA

3. Amplifikacja DNA metod

ą

PCR

4. Rozdział elektroforetyczny produktów PCR

-

analiza r

ę

czna – barwienie

ż

eli

-

analiza automatyczna – detekcja optyczna z wykorzystaniem
promieni lasera produktów znakowanych barwnikami
fluorescencyjnymi (analizator genetyczny)

5. Genotypowanie

2013-01-24

4

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’
5’

5’
3’

5’

94

o

C

Denaturacja nici
– p

ę

kanie wi

ą

za

ń

wodorowych

59

o

C

Przył

ą

czanie primerów do nici

72

o

C

Wydłu

ż

anie przez Polimeraz

ę

nici komplementarnej do nici
matrycy

5’ TCATAAGT 3’

3’ AGTATTCATTCATT 5’

5’

3’
5’

5’
3’

5’

P

P

5’

3’
5’

5’
3’

5’

P

P

PCR – zasada reakcji

Podwojenie ilo

ś

ci amplifikowanego fragmentu

DNA w ka

ż

dym cyklu: 1, 2, 4, 8,16, …

Multiplex PCR

Jednoczesna amplifikacja wielu loci w jednej reakcji PCR

Odpowiedni zestaw primerów w mieszaninie reakcyjnej
– unikni

ę

cie parowania si

ę

mi

ę

dzy sob

ą

Primery wyznakowane ró

ż

nymi barwnikami fluorescencyjnymi

- odseparowanie od siebie loci o podobnym zakresie masy (bp)

Oszcz

ę

dno

ść

czasu i materiałów (degradacja DNA)

Potrzeba niewielkiej ilo

ś

ci DNA (2,5ul)

Du

ż

a siła dyskryminacji zestawu

np.15 loci

Jednoczesna amplifikacja kilku loci na DNA matrycowym

Rozdział produktów PCR w zale

ż

no

ś

ci od wielko

ś

ci

Markery Y-STR

-

dziedziczenie w linii m

ę

skiej

-

ustalenie pochodzenia geograficznego
(brak materiału referencyjnego)

2013-01-24

5

SNPs – Single Nucleotide Polymorphisms

A C T A T T G A C A C G

A C T A T T G A C A C G

A C T A T T G A T A C G

-

przydatno

ść

przy analizie zdegradowanego j

ą

drowego DNA

-

dziedziczenie w linii odmatczynej

mtDNA

Zasady wył

ą

czania ojcostwa

U dziecka pojawia si

ę

nowa cecha,

nieobecna u pozwanego o ojcostwo

m

ęż

czyzny ani u matki

Dziecko nie dziedziczy

ż

adnej

cechy po pozwanym o ojcostwo

m

ęż

czy

ź

nie

i

lub

2013-01-24

6

Prawdopodobie

ń

stwo ojcostwa

Ocenia, ile razy bardziej prawdopodobne jest

ojcostwo badanego pozwanego

w porównaniu do

ojcostwa losowo wybranego m

ęż

czyzny

dla konkretnego wyniku ekspertyzy

Warto

ść

dowodowa analizy

Szansa ojcostwa

- PI

Ł

ą

czna szansa ojcostwa

–

PI c

Zasada iloczynu – „PRODUCT RULE”

PI c

=

PI 1 lokus

x

PI 2 lokus

x

PI 3 lokus

x

.......

Warto

ść

dowodowa analizy

Opiniowanie w analizie ojcostwa

POTWIERDZENIE

Z PRAWDOPODOBIE

Ń

STWEM

>99,9999%

(PI>1 000 000)

EKSPERTYZA DNA

WYŁ

Ą

CZENIE

MINIMUM

4 NIEZGODNO

Ś

CI

2013-01-24

7

Analiza porównawcza

uzyskanego profilu DNA

Niezgodno

ść

Analiza statystyczna -

CZ

Ę

STO

Ś

CI POPULACYJNE

Zgodno

ść

OPINIA

P r a w d o p o d o b i e

ń

s t w o

przypadkowej zgodno

ś

ci

Warto

ść

dowodowa analizy

STRUKTURA GENETYCZNA POPULACJI

odpowiednio liczna

kojarzenie losowe
brak doboru naturalnego
brak selekcji, mutacji i migracji

STAN DYNAMICZNEJ RÓWNOWAGI

Cz

ę

sto

ść

wyst

ę

powania ró

ż

nych genotypów w

populacji jest stała i zale

ż

na jedynie od cz

ę

sto

ś

ci

wyst

ę

powania alleli w populacji

prawo Hardy’ego i Weinberga

Warto

ść

dowodowa analizy

AA = a

2

CZ

Ę

STO

Ś

CI GENOTYPÓW

BB = b

2

AB = 2ab



HWE w populacji

Je

ż

eli allel „a” w lokus A ma cz

ę

sto

ść

a

a allel „b” w lokus B ma cz

ę

sto

ść

b

Warto

ść

dowodowa analizy

2013-01-24

8

1

= 1 PROFIL NA .... OSÓB

CZ

Ę

STO

ŚĆ

PROFILU

PRAWDOPODOBIE

Ń

STWO PRZYPADKOWEJ ZGODNO

Ś

CI

Warto

ść

dowodowa analizy

ILOCZYN CZ

Ę

STO

Ś

CI GENOTYPÓW = CZ

Ę

STO

ŚĆ

PROFILU

tzw. przydatno

ść

do bada

ń

ojcostwa

Jest to odsetek niesłusznie pozwanych

o ojcostwo m

ęż

czyzn, którzy zostan

ą

wykluczeni w toku analizy

PE - SIŁA WYŁACZENIA

tzw. szansa zró

ż

nicowania osób

Jest to prawdopodobie

ń

stwo,

ż

e dwie losowo

wybrane osoby z populacji nie b

ę

d

ą

miały

takiego samego zestawu cech

PD - SIŁA DYSKRYMINACJI