2013-01-24
1
Wprowadzenie do genetyki sądowej
© 2013 | Pracownia Genetyki S
ą
dowej | Katedra i Zakład Medycyny S
ą
dowej
Materiały biologiczne
Inne:
włosy z cebulkami, paznokcie
mo
ż
liwa degradacja - tkanki utrwalone w formalinie/parafinie,
Materiały biologiczne:
prawidłowe zabezpieczanie
ś
ladów
Warunki
Materiały suche: temp. pokojowa, dost
ę
p powietrza
Ciecze, tkanki mi
ę
kkie: -20
o
C do -80
o
C (ko
ś
ci)
Metody
Krew na antykoagulant (-20
o
C) lub bibuła/płótno/FTA (+20
o
C)
Wymazy (-20
o
C lub + 20
o
C po wysuszeniu)
Wysuszenie / zapakowanie w papierow
ą
kopert
ę
;
temperatura pokojowa – niedopałki, znaczki, odzie
ż
(pobranie fragmentów lub w cało
ś
ci), włosy z cebulkami,
paznokcie wraz z materiałem znajduj
ą
cym si
ę
pod nimi
2013-01-24
2
Materiały biologiczne:
prawidłowe zabezpieczanie
ś
ladów
Powierzchnie wchłaniaj
ą
ce:
- wyci
ę
cie fragmentu (dywan)
- zabezpieczenie w cało
ś
ci (odzie
ż
)
Powierzchnie niewchłaniaj
ą
ce:
- zabezpieczenie na jałow
ą
wymazówk
ę
(d
ź
wignia zmiany biegów)
- zabezpieczenie fragmentu przedmiotu wraz z zaplamieniem (kawałek
stłuczonej szyby)
- zabezpieczenie w cało
ś
ci, je
ś
li gabaryty niezbyt du
ż
e
Materiały biologiczne - testy jako
ś
ciowe
A.
Ś
lina
– test niespecyficzny – test płytkowy (
α
-amylaza)
– test specyficzny – test immunochromatograficzny (
α
-amylaza)
– test odciskowy
B. Krew
– testy niespecyficzne (luminol, H
2
O
2
)
– test specyficzny – immunochromatograficzny (hemoglobina ludzka)
C. Sperma
– test niespecyficzny – UV / test bardziej specyficzny – Bluemaxx (te
ż
ś
lina i mocz)
– test specyficzny - immunochromatograficzny (obecno
ść
PSA)
Materiały biologiczne - testy jako
ś
ciowe
B. Krew
– test niespecyficzny - luminol
2013-01-24
3
DNA: j
ą
drowy i mitochondrialny
•
Sekwencje minisatelitarne – VNTR
Jednostka powtórzeniowa: od 9 do 100 bp / cała sekwencja kilka tysi
ę
cy bp
Bardzo wysoki stopie
ń
polimorfizmu
Polimorfizm wykrywany technikami: VNTR-RFLP lub VNTR-PCR
•
Sekwencje mikrosatelitarne – STR (krótkie powtórzenia tandemowe)
Motyw repetytywny: 2 – 6 bp
Du
ż
y polimorfizm;
gł. metoda analizy - PCR
Zró
ż
nicowanie sekwencji tandemowych
Praca w laboratorium genetycznym – etapy:
1. Izolacja
2. Pomiar st
ęż
enia DNA
3. Amplifikacja DNA metod
ą
PCR
4. Rozdział elektroforetyczny produktów PCR
-
analiza r
ę
czna – barwienie
ż
eli
-
analiza automatyczna – detekcja optyczna z wykorzystaniem
promieni lasera produktów znakowanych barwnikami
fluorescencyjnymi (analizator genetyczny)
5. Genotypowanie
2013-01-24
4
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
94
o
C
Denaturacja nici
– p
ę
kanie wi
ą
za
ń
wodorowych
59
o
C
Przył
ą
czanie primerów do nici
72
o
C
Wydłu
ż
anie przez Polimeraz
ę
nici komplementarnej do nici
matrycy
5’ TCATAAGT 3’
3’ AGTATTCATTCATT 5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
P
P
5’
3’
5’
5’
3’
5’
P
P
PCR – zasada reakcji
Podwojenie ilo
ś
ci amplifikowanego fragmentu
DNA w ka
ż
dym cyklu: 1, 2, 4, 8,16, …
Multiplex PCR
Jednoczesna amplifikacja wielu loci w jednej reakcji PCR
Odpowiedni zestaw primerów w mieszaninie reakcyjnej
– unikni
ę
cie parowania si
ę
mi
ę
dzy sob
ą
Primery wyznakowane ró
ż
nymi barwnikami fluorescencyjnymi
- odseparowanie od siebie loci o podobnym zakresie masy (bp)
Oszcz
ę
dno
ść
czasu i materiałów (degradacja DNA)
Potrzeba niewielkiej ilo
ś
ci DNA (2,5ul)
Du
ż
a siła dyskryminacji zestawu
np.15 loci
Jednoczesna amplifikacja kilku loci na DNA matrycowym
Rozdział produktów PCR w zale
ż
no
ś
ci od wielko
ś
ci
Markery Y-STR
-
dziedziczenie w linii m
ę
skiej
-
ustalenie pochodzenia geograficznego
(brak materiału referencyjnego)
2013-01-24
5
SNPs – Single Nucleotide Polymorphisms
A C T A T T G A C A C G
A C T A T T G A C A C G
A C T A T T G A T A C G
-
przydatno
ść
przy analizie zdegradowanego j
ą
drowego DNA
-
dziedziczenie w linii odmatczynej
mtDNA
Zasady wył
ą
czania ojcostwa
U dziecka pojawia si
ę
nowa cecha,
nieobecna u pozwanego o ojcostwo
m
ęż
czyzny ani u matki
Dziecko nie dziedziczy
ż
adnej
cechy po pozwanym o ojcostwo
m
ęż
czy
ź
nie
i
lub
2013-01-24
6
Prawdopodobie
ń
stwo ojcostwa
Ocenia, ile razy bardziej prawdopodobne jest
ojcostwo badanego pozwanego
w porównaniu do
ojcostwa losowo wybranego m
ęż
czyzny
dla konkretnego wyniku ekspertyzy
Warto
ść
dowodowa analizy
Szansa ojcostwa
- PI
Ł
ą
czna szansa ojcostwa
–
PI c
Zasada iloczynu – „PRODUCT RULE”
PI c
=
PI 1 lokus
x
PI 2 lokus
x
PI 3 lokus
x
.......
Warto
ść
dowodowa analizy
Opiniowanie w analizie ojcostwa
POTWIERDZENIE
Z PRAWDOPODOBIE
Ń
STWEM
>99,9999%
(PI>1 000 000)
EKSPERTYZA DNA
WYŁ
Ą
CZENIE
MINIMUM
4 NIEZGODNO
Ś
CI
2013-01-24
7
Analiza porównawcza
uzyskanego profilu DNA
Niezgodno
ść
Analiza statystyczna -
CZ
Ę
STO
Ś
CI POPULACYJNE
Zgodno
ść
OPINIA
P r a w d o p o d o b i e
ń
s t w o
przypadkowej zgodno
ś
ci
Warto
ść
dowodowa analizy
STRUKTURA GENETYCZNA POPULACJI
odpowiednio liczna
kojarzenie losowe
brak doboru naturalnego
brak selekcji, mutacji i migracji
STAN DYNAMICZNEJ RÓWNOWAGI
Cz
ę
sto
ść
wyst
ę
powania ró
ż
nych genotypów w
populacji jest stała i zale
ż
na jedynie od cz
ę
sto
ś
ci
wyst
ę
powania alleli w populacji
prawo Hardy’ego i Weinberga
Warto
ść
dowodowa analizy
AA = a
2
CZ
Ę
STO
Ś
CI GENOTYPÓW
BB = b
2
AB = 2ab
HWE w populacji
Je
ż
eli allel „a” w lokus A ma cz
ę
sto
ść
a
a allel „b” w lokus B ma cz
ę
sto
ść
b
Warto
ść
dowodowa analizy
2013-01-24
8
1
= 1 PROFIL NA .... OSÓB
CZ
Ę
STO
ŚĆ
PROFILU
PRAWDOPODOBIE
Ń
STWO PRZYPADKOWEJ ZGODNO
Ś
CI
Warto
ść
dowodowa analizy
ILOCZYN CZ
Ę
STO
Ś
CI GENOTYPÓW = CZ
Ę
STO
ŚĆ
PROFILU
tzw. przydatno
ść
do bada
ń
ojcostwa
Jest to odsetek niesłusznie pozwanych
o ojcostwo m
ęż
czyzn, którzy zostan
ą
wykluczeni w toku analizy
PE - SIŁA WYŁACZENIA
tzw. szansa zró
ż
nicowania osób
Jest to prawdopodobie
ń
stwo,
ż
e dwie losowo
wybrane osoby z populacji nie b
ę
d
ą
miały
takiego samego zestawu cech
PD - SIŁA DYSKRYMINACJI