1
ćwiczenie 1
IZOLACJA CAŁKOWITEGO DNA
Izolacja
całkowitego DNA jest zasadniczym etapem wielu eksperymentów biologii molekularnej, takich jak test
PCR, konstrukcja bibliotek genomowych, hybrydyzacja, RFLP itp. Znanych jest wiele technik izolacji DNA z
badanego materiału. Zastosowana metoda izolacji powinna zapewniać uzyskanie preparatu DNA o wysokiej
czystości i niskim stopniu degradacji. Ze względu na bardzo duże rozmiary DNA chromosomalnego, który łatwo
ulega fragmentacji, po izolacji uzyskujemy zazwyczaj fragmenty o długości od kilkudziesięciu do kilkuset tysięcy
par zasad. Dokonując wyboru odpowiedniej metody należy uwzględnić następujące kryteria.
1. Rodzaju organizmu, z którego zamierzamy izolować DNA, np. zwierzęta, rośliny, bakterie, wirusy.
a. DNA roślin. Głównym utrudnieniem podczas izolacji DNA z tkanek roślinnych jest obecność polisacharydów,
będących inhibitorami wielu enzymów stosowanych w pracach z DNA. Standardowe metody oczyszczania,
takie jak: ekstrakcja fenolem, wytrącanie alkoholem, nie usuwają polisacharydów z roztworu DNA. Dlatego dla
tkanek roślinnych opracowano specjalne procedury izolacji DNA oparte na działaniu CTAB
(Cetyltrimethylammonium bromide) - bromku cetylotrimetyloaminowego. CTAB jest detergentem, który
degraduje białka i błony komórkowe, a ponadto umożliwia oddzielenie DNA od polisacharydów. W obecności
wysokiego stężenie NaCl (ponad 0,7M) CTAB tworzy kompleksy z DNA, które utrzymują się w roztworze. Po
obniżeniu stężenia NaCl (poniżej 0,4 M) kompleksy CTAB/DNA ulegają wytrąceniu tworząc zawiesinę. Jej
odwirowanie umożliwia oddzielenie kompleksów DNA/CTAB (osad) od polisacharydów (roztwór).
b. DNA zwierząt. W przypadku izolacji DNA zwierząt głównym problemem jest usunięcie znacznej ilości białek,
które są obecne w tkankach. W tym celu często wykorzystuje się trawienie proteinazą K (enzym proteolityczny)
oraz ekstrakcję fenolem i chloroformem. W wielu badaniach diagnostycznych, DNA izolowane jest z krwi
pacjentów. W tym przypadku, w celu zwiększenia wydajności izolacji, na wstępnym etapie z preparatu często
usuwa się erytrocyty, które pozbawione są jąder komórkowych.
2. Typ organelli komórkowych, z których ma być izolowany DNA, np. jądra komórkowe, mitochondria,
chloroplasty. Jeżeli chcemy wyizolować DNA obecny w danym przedziale komórkowym, konieczny jest
dodatkowy etap wstępny, podczas którego wykonujemy frakcjonowanie materiału biologicznego w celu
rozdzielenia poszczególnych organelli. W tym przypadku wykorzystujemy fakt, że różne typy organelli mają
różną gęstość, co umożliwia ich rozdzielenie podczas wirowania w gradientach sacharozowych lub
perkolowych. Ponadto bufory o odpowiednio dobranym składzie mogą być wykorzystane do specyficznej lizy
poszczególnych organelli np. detergent Triton X-100 w niektórych buforach umożliwia lizę mitochondriów i
chloroplastów nie niszcząc jąder komórkowych.
3. Przeznaczenie izolowanego DNA, czyli jaka ilość i jakość wyizolowanego DNA jest konieczna do dalszych
eksperymentów.
a. Wydajność. Przed przystąpieniem do izolacji należy zawsze wziąć pod uwagę to czy ilość DNA, jaką jesteśmy
w stanie uzyskać po izolacji daną techniką, będzie wystarczająca dla dalszych prac. Jeżeli celem izolacji jest np.
wykonanie amplifikacji PCR, wówczas ze względu na dużą czułość tej reakcji, do jednego testu wystarczy ok.
50-500ng DNA. Taką ilość DNA można uzyskać np. z wymazów nabłonka błon śluzowych. Jeżeli natomiast
przygotowujemy materiał genetyczny do wykonania testu hybrydyzacji, musimy uzyskać co najmniej 10
μg
DNA. Takie ilości DNA najczęściej izoluje się z krwi.
b. Czystość. Niektóre eksperymenty wymagają DNA o wysokim stopniu czystości. Istotne jest to, aby izolowany
DNA nie zawierał domieszek obcego DNA ani żadnych innych zanieczyszczeń chemicznych. Aby uniknąć
obecności obcego DNA w preparacie zaleca się stosowanie do izolacji sprzętu jednorazowego użytku. Dokładne
oczyszczenie DNA od innych składników komórkowych można natomiast uzyskać poddając preparat
dodatkowym etapom oczyszczania, np. z wykorzystaniem wirowania w gradiencie CsCl.
Izolacja DNA obejmuje zazwyczaj następujące, zasadnicze etapy.
1. Fizyczne zniszczenie struktury tkankowej i komórkowej materiału biologicznego, tzw. homogenizacja. Etap
ten często wykonuje się rozcierając materiał biologiczny w ciekłym azocie. Kryształki lodu, tworzące się w
tkankach podczas gwałtownego zamrażania, niszczą ściany i inne struktury komórkowe uwalniając zawartości
komórek.
2. Uwolnienie DNA. DNA chroniony jest w komórce w różnych błonowych strukturach subkomórkowych, np.
jądro, mitochondria, chloroplasty a ponadto występuje w kompleksach z różnymi białkami, np. z histonami. W
celu degradacji błon komórkowych i białek, do buforów ekstrakcyjnych dodawane są różne detergenty, np.
SDS, CTAB, izotiocjanian guanidyny. Detergenty tę umożliwiają również eliminacje enzymów
nukleolitycznych (endo-, exonukleazy), które po uwolnieniu ze struktur subkomórkowych mogłyby zniszczyć
DNA.
2
3. Usunięcie zdegradowanych elementów komórkowych. Do usuwania białek stosujemy trawienie proteinazą
K, oraz z ekstrakcję fenolem i chloroformem. Lipidy usuwamy dzięki ekstrakcji chloroformem. Ekstrakcję
chloroformem wykonujemy przeważnie bezpośrednio po ekstrakcji fenolem, gdyż chloroform oprócz lipidów i
białek usuwa z fazy wodnej również resztki fenolu. Polisacharydy usuwamy wytrącając DNA CTABem.
Polifenole, które w postaci utlenionej tworzą wiązania kowalencyjne z DNA, usuwane są dzięki obecności PVP
(poliwinylopirolidon) w buforze ekstrakcyjnym. RNA trawimy RNazą lub wytrącamy z wykorzystaniem LiCl.
4. Oddzielenie DNA od związków użytych na wcześniejszych etapach izolacji, czyli detergentów, soli,
inhibitorów. Składniki te, po spełnieniu swojej funkcji, muszą zostać dokładnie usunięte z preparatu, gdyż ich
obecność w preparacie uniemożliwiałaby późniejsze wykorzystanie DNA do prac wykonywanych z enzymami,
np. enzymami restrykcyjnymi, polimerazami, kinazami. Sole i detergenty usuwamy wytrącając DNA w etanolu
lub izopropanolu. W celu zwiększenia wydajność wytrącania DNA, do preparatu dodajemy dodatkowo octan
amonu lub sodu.
5. Przygotowanie DNA do przechowywania. DNA przechowywany jest w postaci roztworu wodnego lub
buforach typu TE. Bufory te zawierają Tris, odpowiedzialny za utrzymanie stałego pH roztworu, a także EDTA,
który wiąże jony dwuwartościowe, np. Mg
2+
, Ca
2+
, Mn
2+
, Zn
2+
, Jony te są kofaktorami wielu enzymów
nukleolitycznych stanowiących zagrożenie dla przechowywanego DNA. DNA w buforach TE należy
przechowywać w +4 lub –20
o
C.
IZOLACJA DNA Z LIŚCI
Tab.1 Bufory używane do izolacji DNA roślinnego
bufor I
(homogenizacyjny)
bufor II
(10x)
bufor III
(precypitacyjny)
bufor IV
bufor TE
10/1
2 % CTAB
10 % CTAB
1 % CTAB
10 mM Tris -HCl
1,4 M NaCl
0,7 M NaCl
1 M NaCl
1 mM EDTA
100 mM Tris -HCl
50 mM Tris -HCl
10 mM Tris -HCl
20 mM EDTA
10 mM EDTA
1 mM EDTA
1
%
PVP
2% β-merkaptoetanol
Odczynniki i sprzęt:
- ciekły azot
- bufory (tab.1)
- chloroform-
alk.izoamylowy (24/1)
- chloroform
- 98% etanol,
- 75% etanol
-
buf TE
10/1
- Buf. elektroforetyczny
TAE
- agaroza
- obciążacz LB
- nożyczki,
- moździerz,
- probówki eppendorfa
- tipsy
- mikrowirówka
- sprzęt do elektroforezy
agarozowej
Postępowanie:
1. Siewki przepłukać sterylną wodą, pociąć i umieścić w
czystym, schłodzonym moździerzu.
2. Materiał zalać ciekłym azotem i rozetrzeć bardzo
dokładnie na proszek.
3. Przenieść ok. 100mg roztartej tkanki do probówki
eppendorfa.
4. Zalać tkankę 0,5 ml buf. I (homogenizacyjnego) i
ekstrahować próbę przez ok. 30 min. w temp +65
o
C.
Bufor przed użyciem powinien również zostać
podgrzanego do +65
o
C. Podczas inkubacji kilkukrotnie
delikatnie zamieszać próbę.
5. Dodać 1 obj. mieszaniny chloroform-alk.izoamylowy
(24:1), a następnie całość delikatnie wytrząsać przez 1-
2 minuty do uzyskania jednolitej biało-zielonej emulsji.
6. Preparat wirować w mikrowirówce przez 5 minut.
7. Fazę wodną (górną), która zawiera DNA, przenieść do
nowej probówki. Probówkę z fazą dolną (chloroform z
białkami i lipidami) usunąć.
8. Do fazy wodnej dodać 1/10 objętości buf. II,
podgrzanego do 65
o
C i delikatnie wymieszać.
9. Całość ponownie ekstrahować 1 obj. mieszaniny
chloroform-alk. izoamylowy przez 1-2 minuty.
Wirować jak w punkcie 5.
10. Do fazy wodnej dodać 2 obj. buf. III (precypitacyjnego).
Zmniejszenie stężenia NaCl w próbie spowoduje wytrącenie
się kompleksów CTAB/DNA, co umożliwi ich oddzielenie
od polisacharydów. Całość po wymieszaniu inkubować
przez 10 minut w temp. pokojowej.
11. Wytrącone kompleksy CTAB/DNA odwirować w
mikrowirówce przez 10 min. przy 12 tyś. rpm.
12. Po wirowaniu usunąć supernatant (polisacharydy). W celu
rozbicia kompleksów CTAB/DNA osad rozpuścić w 50
μl buf. IV i pozostawić próbę na ok. 5 min. w temp. +65
0
C.
13. Wytrącić DNA dodając 2 obj. 98% etanolu. Próbę
inkubować przez 5 min. w -20
o
C.
14. Preparat wirować w mikrowirówce przez 10 minut przy 12
tyś. rpm.
15. Usunąć supernatant zawierający CTAB a do osadu (DNA)
dodać 100
μl 75% etanolu w celu wypłukania resztek
używanych buforów. Całość wirować 5 min przy 12 tyś.
rpm.
16. Po wirowaniu dokładnie usunąć supernatant i wysuszyć
osad. DNA rozpuścić w 20
μl buforu TE
10/1
.
17. 10
μl uzyskanego preparatu połączyć z 2 μl buforu LB
(obciążacz z zawierający barwnik) i całość nałożyć na 1%
żel agarozowy. Po elektroforezie ocenić ilość i jakość
uzyskanego preparatu.
3
IZOLACJA DNA Z WYMAZÓW
1. Przygotowanie buforu homogenizacyjnego.
400
μl buforu (12mM Tris-HCl pH8,0; 6mM
EDTA; 0,5% SDS) przenieść do probówki
eppendorfa i uzupełnić Proteinazą K (20mg/ml)
do stężenia 50
μg/ml. Całość zamieszać.
2. Sterylną wymazówką pobrać wymaz z jamy
ustnej pocierając 5-10 razy bawełnianym
wacikiem wewnętrzną część policzka.
3. Część wymazówki z wacikiem odciąć i umieścić
w przygotowanym buforze. Całość przenieść do
bloku grzejnego. Próbę inkubować 1-3 godz. w
temp. 55
o
C, w celu zlizowania komórek i
strawienia białek.
4. Po inkubacji wyjąć wacik, wyciskając z niego
nadmiar płynu do pozostałej części homogenatu.
5. Próbę poddać ekstrakcji fenolowej jedną
objętością mieszaniny fenol/chloroform, tzn. do
jednej objętości homogenatu dodać 0,5 objętość
fenolu a następnie 0,5 objętości chloroformu. Do
ekstrakcji DNA używamy fenol o pH
obojętnym. Uwaga - fenol jest substancją
szkodliwą, dlatego tą część pracy należy
wykonywać w rękawiczkach zachowując
ostrożność.
6. Próbę ostrożnie wytrząsać przez 3 min, a
następnie wirować w mikrowirówce przez 5
min. przy obrotach 12 tyś. RPM.
7. Po wirowaniu zebrać warstwę wodną, czyli
górną - zawierającą DNA i przenieść ją do
świeżej probówki eppendorfa a następnie dodać
do niej jedną objętość chloroformu.
8. Całość ekstrahować 2 min a następnie wirować
jak w p.6.
9. Fazę wodną przenieść do świeżej probówki
eppendorfa a następnie wytrącić DNA etanolem.
Wytrącanie wykonujemy dodając do
wytrącanego roztworu 0,2 obj. 10M octanu
amonu i 2,5 obj. (w odniesieniu do całości) 95-
100% etanolu. Po zamieszaniu próbę wytrącamy
5-10 min w –20
o
C.
10. Wytrącony DNA odwirować w mikrowirówce
stosując obroty 12 tyś RPM przez 10 min.
11. Ostrożnie usunąć supernatant a do osadu DNA
dodać schłodzony 75% etanol i całość zamieszać
tak, by etanol przepłukał wnętrze probówki
eppendorfa z osadem. Osad ponownie wirować
w mikrowirówce przez 5 min, przy obrotach 12
tyś. RPM.
12. Supernatant ostrożnie i bardzo dokładnie usunąć
a następnie wysuszyć osad delikatnie ogrzewając
probówkę.
13. Osad rozpuścić w 20
μl buforu TE
10/1
zawierającego RNazę A o stężeniu 100
μg/ml.
14. Po rozpuszczeniu osadów, 10
μl preparatu
połączyć z buforem LB (obciążacz z zawierający
barwnik) i nałożyć na żel elektroforetyczny w
celu sprawdzenia jakości uzyskanego DNA.
4
Tab.1. Bufory do izolacji DNA z krwi
Bufor do lizy erytrocytów
pH 7,4 (na 1000 m l)
Bufor do trawienia białek
SE pH 8,0 (na 1000 ml)
8,29 g NH
4
Cl
4,39 g NaCl
1,0 g KHCO
3
0,34 g EDTA
0,034 g EDTA
Odczynniki i sprzęt
- bufory Tab. 1
- EDTA 10%
- SDS 20 %
- proteinaza K 20
mg/ml.
- fenol
- chloroform-
alk.izoamylowy
(24/1)
- octan amonu 10M
- 98% etanol,
- 75% etanol
- buf. TE
10/1
- probówki
eppendorfa,
- tipsy
- mikrowirówka
- sprzęt do
elektroforezy
agarozowej.
Etap I
1. Po pobraniu krwi dodać do probówki 10% EDTA
(pH 8,0) w ilości 100
μl/10 ml krwi. EDTA
uniemożliwia tworzenie się skrzepów krwi.
2. Do 10 ml krwi dodać 30 ml buforu do lizy
erytrocytów. Całość wymieszać i inkubować w
lodzie 30 min. mieszając co najmniej 4x.
3. Wirować 15 min. przy 12 000 rpm w +4
o
C.
4. Usunąć supernatant, probówkę odwrócić postawić
na bibule w celu osuszenia osadu.
5. Dodać 10 ml zimnego buforu do lizy, wymieszać
na worteksie.
6. Wirować 15 min. przy 12 000 rpm w +4
o
C.
7. Usunąć supernatant, (powtórzyć pkt. 4 i 5 aż do
uzyskania białego osadu).
8. Osad rozpuścić w 5 ml zimnego buforu SE,
mieszając na worteksie.
9. Dodać 250 ml 20 % SDS oraz 12,5 ml proteinazy
K o stężeniu 20 mg/ml.
10. Wymieszać i pozostawić na noc w +55
o
C.
Etap II
1. Do preparatu dodać 1 obj. fenolu i wytrząsać próbę
przez ok. 2 min.
2. Całość wirować 5 min. w temp. pokojowej.
3. Zebrać fazę wodną (z DNA) i dodać do niej 1 obj.
mieszaniny fenol/chloroform (1/1). Całość
ekstrahować 2 min. i wirować jak w p.11.
4. Do zebranej fazy wodnej dodać 1 obj.
chloroformu, ekstrahować 2 min. a następnie
wirować jak w p.11.
5. DNA zawarte w fazie wodnej wytrącić dodając 0,2
objętości octanu amonu i 2 obj. 95 % etanolu.
Wytrącony DNA wirować 10 min. w +4
0
C.
Usunąć supernatant.
6. Osad przepłukać w 75% etanolu a po ponownym
odwirowaniu wysuszyć i rozpuścić w 20
μl buf. TE
10/1
.
7. Sprawdzić DNA na 0,8% żelu agarozowym.
5
Firmowe zestawy do oczyszczania kwasów nukleinowych
W celu ułatwienia prac związanych z badaniem kwasów nukleinowych, firmy biotechnologiczne sprzedają
specjalne kolumny do izolacji i oczyszczania DNA i RNA. Systemy te na ogół oparte są zdolności złóż
krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych, takich
jak chlorowodorek guanidyny lub izothiocjanian guanidyny. Sole chaotropowe, powodują również rozpad błon
komórkowych i denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych. Chaotropy ang. chaotropes, czyli
,,czyniące chaos'' są to substancje, które w roztworach wodnych wprowadzają silne zaburzenia w sieci wiązań
wodorowych. W oparciu o tą zasadę opracowano systemy wykorzystywane do następujących celów:
-
izolacja plazmidowego DNA,
-
izolacja całkowitego DNA
-
izolacja całkowitego RNA
-
elucja DNA z żeli agarozowych i poliakryloamidowych
-
oczyszczanie kwasów nukleinowych po reakcjach enzymatycznych, takich jak: PCR, restrykcja,
znakowanie.
Do sprzedawanego sprzętu firmy dołączają szczegółowe opisy odpowiednich procedur. Generalna zasada
wykorzystania większości systemów obejmuje następujące etapy:
1) wstępne przygotowanie oczyszczanego kwasu nukleinowego. W przypadku DNA plazmidowego jest
to ekstrakt bakteryjny pozbawiony DNA genoforowego. W przypadku DNA całkowitego roślin lub
zwierząt jest to ekstrakt białkowy uzyskany w wyniku rozbicia tkanek w buforze zawierającym
stężone sole chaotropowe. Preparaty agarozy zawierające eluowany DNA powinny zostać poddane
stopieniu. Mieszaniny zawierające DNA po reakcjach enzymatycznych powinny zostać wzbogacone o
odpowiednie stężenie buforu chaotropowego.
2) nałożenie preparatu na kolumny. W zależności od skali, w jakiej przeprowadza się oczyszczanie, mogą
to być tzw. minikolumny (rys. 1), w których przepływ roztworu przez membranę zawierającą złoża
krzemionkowe uzyskuje się w wyniku wirowania całej kolumny w mikrowirówce, lub większe
kolumny, w których roztwór przepływa grawitacyjnie. Złoża, przez które przechodzi roztwór,
wychwytują specyficzne dla nich kwasy nukleinowe, tzn. DNA lub RNA, a pozostałe składniki
roztworu, stanowiące zanieczyszczenie dla badanych prób, zostają zebrane w probówce znajdującej się
poniżej filtra.
3) płukanie preparatu. W celu dokładnego odpłukania resztek zanieczyszczeń związanych z filtrem,
kolumienki przepłukuje się kilkukrotnie roztworami zawierającymi sole chaotropowe lub buforami
zawierającymi etanol.
4) wymywanie kwasów nukleinowych z kolumny. Po usunięciu wszystkich zanieczyszczeń i osuszeniu
membrany, ze złoża odpłukuje się oczyszczone kwasy nukleinowe, nakładając na kolumnę
odpowiednią ilość wody, lub buforu TE. Zebrane z kolumny preparaty oczyszczonego DNA lub RNA,
na ogół nadają się do bezpośredniego wykorzystania do dalszych prac badawczych.
minikolumna
filtr
probówka
zbiorcza
Rys.1
Używanie standaryzowanych systemów do oczyszczania kwasów nukleinowych posiada następujące
zalety w porównaniu do analogicznych technik, wykonywanych metodami tradycyjnymi:
-
czas trwania eksperymentu zostaje znacznie skrócony
-
wydajność i czystość prób oczyszczonych tą drogą są wyższe
-
metody te eliminują konieczność pracy z substancjami szkodliwymi, np. fenolem, chloroformem
-
uzyskiwane wyniki są w wysokim stopniu powtarzalne