1 |

S t r o n a

Materiały dydaktyczne Katedry Biochemii i Neurobiologii WIMiC AGH

Przygotowano dla kursu: Biochemia, rok akademicki 2011-2012

Izolacja kofeiny z różnych produktów spożywczych.

Cele ćwiczenia:

1. Nabycie umiejętności prowadzenia prostych analiz laboratoryjnych stosowanych w

biochemii, chemii organicznej, biotechnologii oraz procesach produkcyjnych.

2. Zapoznanie się z technikami szacowania wydajności oczyszczania wybranego składnika z

różnych surowców.

3. Nabycie umiejętności bieżącego przetwarzania danych płynących z eksperymentów oraz

pracy we wzajemnie komunikujących się, niewielkich zespołach.

4. Określanie wydajności procesów chemicznych zachodzących podczas oczyszczania substancji.

Przebieg ćwiczenia:

Ćwiczenie wykonywane jest w trzech grupach. Przed każdą z grup stoją odmienne zadania. Właściwa
współpraca i organizacja pracy zarówno w grupach, jak i interakcje pomiędzy grupami są gwarancją
prawidłowo wykonanych założeń ćwiczenia.

Warunki wykonania ćwiczenia:

Każda osoba wykonująca ćwiczenie MUSI posiadać okulary ochronne, dwie pary rękawiczek
nitrylowych lub lateksowych oraz fartuch. Brak wymienionych skutkują brakiem możliwości
przystąpienia do ćwiczenia.

Zakres materiału do samodzielnego przygotowania:

1. Kofeina: własności alkaloidu, występowanie, działanie na organizm człowieka,

rozpuszczalność, metody ekstrakcji z surowców naturalnych

2. Zagadnienia związane z ekstrakcją typu ciecz-ciecz (warunki, współczynnik podziału, prawo

podziału Nernsta)

3. Spektrofotometria: wykonywanie krzywej wzorcowej, wybór analitycznej długości fali,

absorbancja kofeiny

4. Techniki zagęszczania próbki (szczególnie liofilizacja – co to za proces, do czego służy?)
5. Własności dichlorometanu.

2 |

S t r o n a

Materiały dydaktyczne Katedry Biochemii i Neurobiologii WIMiC AGH

Przygotowano dla kursu: Biochemia, rok akademicki 2011-2012

GRUPA 1

Podstawowe zadania:

1. Wykonanie krzywej wzorcowej stężeń kofeiny w dichlorometanie.
2. Oszacowanie wydajności procesu ekstrakcji kofeiny z roztworu wodnego do dichlorometanu.

Przebieg ćwiczenia dla grupy 1

Przygotowanie krzywej wzorcowej:

1. Rozpuścić otrzymaną naważkę czystej chemicznie kofeiny w dichlorometanie w ten sposób,

by finalne stężenie wynosiło 0,1 mg/ml (100 ug/ml)

2. Wykonać pięć rozcieńczeń otrzymanego roztworu w dichlorometanie w ten sposób, by

finalnie uzyskać stężenia z tabeli poniżej. Objętość każdego z roztworów wzorcowych
powinna wynosić 1 ml (rozcieńczanie prowadzić w probówkach typu eppendorf pamiętając o
wysokiej lotności dichlorometanu).

3. Zmierzyć absorbancję każdego z roztworów wzorcowych przy pomocy spektrofotometru i

kiuwety kwarcowej dla analitycznej długości fali 255 nm.

4. Wykreślić (w przybliżeniu) zależność stężenia kofeiny od absorbancji przy 255 nm.

Tabela 1 – dane niezbędne dla przygotowania krzywej wzorcowej stężenia kofeiny.

Stężenie

(ug/ml)

Objętość r-ru 0,1

mg/ml (100 ug/ml)

Objętość

rozpuszczalnika

Absorbancja dla 255 nm

10

25

50

75

100

Krzywa wzorcowa

λ

Wykres zależności stężenia kofeiny od absorbancji

2,0

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

ug/ml

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

3 |

S t r o n a

Materiały dydaktyczne Katedry Biochemii i Neurobiologii WIMiC AGH

Przygotowano dla kursu: Biochemia, rok akademicki 2011-2012

Określenie wydajności procesu ekstrakcji

1. Rozpuścić otrzymaną naważkę kofeiny (około 5 mg) w gorącej wodzie (~80°C) o objętości

około 50 ml.

2. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej lub niższej (możliwe użycie łaźni lodowej).
3. Wykonać ekstrakcję do dichlorometanu (UWAGA – temperatura wrzenia dichlorometanu to

około 40°C, pamiętać o wychłodzeniu roztworu wodnego!), w tym celu:

a. Roztwór przelać do rozdzielacza
b. Dodać 2 ml dichlorometanu i delikatnie wytrząsać
c. Odstawić na statyw i odczekać do rozdzielenia faz
d. Fazę organiczną przelać do probówki polietylenowej 5 ml, po czym powtórzyć kroki

3a.-3c.

e. Jeśli do probówki dostała się pewna ilość fazy wodnej – usunąć pipetą

4. Pobrać niewielką objętość otrzymanego roztworu, rozcieńczyć 50-100x i oznaczyć

absorbancję roztworu

5. Odnieść otrzymaną absorbancję do wykreślonej krzywej wzorcowej i oszacować finalne

stężenie kofeiny w całej objętości dichlorometanu uwzględniając rozcieńczenie.

6. Określić procentową wydajność ekstrakcji kofeiny do fazy organicznej.
7. Wykonać liofilizację fazy organicznej

4 |

S t r o n a

Materiały dydaktyczne Katedry Biochemii i Neurobiologii WIMiC AGH

Przygotowano dla kursu: Biochemia, rok akademicki 2011-2012

GRUPA 2

Podstawowe zadania:

1. Ekstrakcja kofeiny z dostarczonej kawy
2. Określenie zawartości kofeiny w kawie z uwzględnieniem wydajności procesu ekstrakcji

obliczonego przez grupę 1

Przebieg ćwiczenia dla grupy 2

1. Otrzymany proszek (zhomogenizowane ziarna kawy, masa 5 gramów) zalać gorącą wodą w

objętości około 50 ml.

2. Mieszaninę mieszać okresowo, utrzymując ją w temperaturze około 80°C w łaźni wodnej

przez około 5 minut.

3. Wychłodzić mieszaninę do temperatury pokojowej.
4. Przesączyć przez lejek Büchnera z filtrem nitrocelulozowym posługując się pompką wodną.
5. Wykonać ekstrakcję do dichlorometanu (UWAGA – temperatura wrzenia dichlorometanu to

około 40°C, pamiętać o wychłodzeniu roztworu wodnego!)

a. Roztwór wodny przelać do rozdzielacza
b. Dodać 2 ml dichlorometanu i delikatnie wytrząsać okresowo odprowadzając gaz
c. Odstawić na statyw i odczekać do rozdzielenia faz
d. Fazę organiczną przelać do probówki polietylenowej 5 ml, po czym powtórzyć kroki

3a.-3c.

e. Jeśli do probówki dostała się pewna ilość fazy wodnej zwirować i zebrać pipetą
f. Faza organiczna prawdopodobnie będzie mętna. Przepipetować kilkukrotnie po czym

zwirować w ten sposób, by otrzymać klarowny roztwór dichlorometanu.

6. Pobrać niewielką objętość otrzymanego roztworu, rozcieńczyć 50-100x i oznaczyć

absorbancję roztworu

7. Odnieść otrzymaną absorbancję do krzywej wzorcowej wykreślonej przez grupę 1 i

oszacować finalne stężenie kofeiny w całej objętości dichlorometanu uwzględniając
rozcieńczenie.

8. Obliczyć stężenie kofeiny w otrzymanej próbce kawy uwzględniając wydajność ekstrakcji

oszacowaną przez grupę 1

9. Wykonać liofilizację ekstraktu.

5 |

S t r o n a

Materiały dydaktyczne Katedry Biochemii i Neurobiologii WIMiC AGH

Przygotowano dla kursu: Biochemia, rok akademicki 2011-2012

GRUPA 3

Podstawowe zadania:

1. Ekstrakcja kofeiny z „napoju energetycznego” (N-Gine, Tiger, Red Bull, inny)
2. Określenie zawartości kofeiny w napoju z uwzględnieniem wydajności procesu ekstrakcji

obliczonego przez grupę 1

Przebieg ćwiczenia dla grupy 3

1. Odmierzyć około 40 ml napoju do probówki typu Falcon (V=50 ml) i odgazować (wytrząsanie

a potem zastosowanie homogenizatora ultradźwiękowego, parametry homogenizacji: moc
100%, przerwy około 20% czasu homogenizacji, czas 5 minut).

2. Wychłodzić roztwór do temperatury pokojowej (homogenizator ultradźwiękowy nagrzewa

roztwory homogenizowane).

3. Wykonać ekstrakcję do dichlorometanu (UWAGA – temperatura wrzenia dichlorometanu to

około 40°C, pamiętać o wychłodzeniu roztworu wodnego!)

a. Napój przelać do rozdzielacza
b. Dodać 2 ml dichlorometanu i delikatnie wytrząsać okresowo odprowadzając gaz
c. Odstawić na statyw i odczekać do rozdzielenia faz
d. Fazę organiczną przelać do probówki polietylenowej 5 ml, po czym powtórzyć kroki

3a.-3c.

e. Jeśli do probówki dostała się pewna ilość fazy wodnej – usunąć pipetą

4. Pobrać niewielką objętość otrzymanego roztworu, rozcieńczyć 50-100x i oznaczyć

absorbancję roztworu

5. Odnieść otrzymaną absorbancję do krzywej wzorcowej wykreślonej przez grupę 1 i

oszacować finalne stężenie kofeiny w całej objętości dichlorometanu uwzględniając
rozcieńczenie.

6. Obliczyć stężenie kofeiny w jednostkowej objętości napoju uwzględniając wydajność

ekstrakcji oszacowaną przez grupę 1

7. Wykonać liofilizację ekstraktu.