IZOLACJA DNA z kom. zwierzêcej

Wydział Chemiczny Politechniki Gda

skiej

Katedra Technologii Leków i Biochemii

Kultury tkankowe i komórkowe ro

lin i zwierz

Izolacja DNA z komórki zwierz

cej

Izolacja i oczyszczanie DNA jest kluczowym etapem wi

kszo

ci procedur stosowanych

w biologii molekularnej, diagnostyce i innych badaniach. Głównym celem tego etapu jest

uzyskanie wysokiej jako

ci i czysto

ci materiału biologicznego, niezale

nie od

ródła jego

pochodzenia. Wybór odpowiedniej metody izolacji zale

•

od rodzaju badanego kwasu nukleinowego jaki chcemy uzyska

(DNA genomowe,

mitochondrialne, plazmidowe, RNA itd.),

•

pochodzenia (ro

linne, zwierz

ce, bakteryjne, wirusowe itd.),

•

rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy izolacj

(z tkanek, organu, hodowli

komórkowej itd.),

•

oczekiwanych rezultatów (czysto

ść

, jako

ść

, czas izolacji itd.)

•

przeznaczenia (PCR, klonowanie, itd.).

Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku których otrzymuje si

DNA:

biologicznie aktywne, chemicznie stabilne oraz wolne od RNA i białek. Jednak

e ze

wzgl

du na wielko

ść

i wra

liwo

ść

chromosomalnego DNA praktycznie niemo

liwa jest jego

izolacja w formie niezmienionej. Cz

ęść

DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom.

Podczas izolacji DNA z komórki nale

y wzi

ąć

pod uwag

nast

puj

ce parametry,

warunkuj

ce zachowanie natywnej struktury DNA:

1. ph:

•

zania

wodorowe

pomi

dzy komplementarnymi ła

cuchami s

stabilne

rodowisku o pH = 4 ÷ 10

•

zania fosfodiestrowe w szkielecie DNA s

trwałe w zakresie pH = 3 ÷ 12

•

zania N-glikozydowe z zasadami purynowymi (adenin

i guanin

) ulegaj

hydrolizie przy pH < 3

2. temperatura:

•

istniej

znaczne ró

nice w stabilno

ci termicznej wi

wodorowych w podwójnej

spirali, ale wi

kszo

ść

DNA ulega rozpleceniu w temperaturze 80÷90 °C

•

zania N-glikozydowe i fosfodiestrowe s

trwałe do 100°C

3. siła jonowa :

•

DNA jest bardziej trwały i rozpuszczalny w roztworach soli

•

w st

ęŜ

eniu soli mniejszym ni

0,1M osłabiaj

zania wodorowe pomi

dzy

komplementarnymi ła

cuchami;

4. warunki komórkowe:

•

przed uwolnieniem DNA konieczne jest rozbicie

ciany komórkowej (komórki

grzybowe, bakteryjne i in.) i liza błon komórkowych (komórki zwierz

ce i in.);

łatwo

ść

rozbicia

ciany zale

y od rodzaju organizmu, w niektórych przypadkach

konieczne jest intensywne ucieranie lub działanie ultrad

kami (komórki dro

tytoniu), podczas gdy w innych (E. coli) mo

liwa jest enzymatyczna hydroliza

ciany

komórkowej

•

w komórce wyst

puje kilka enzymów, które hydrolizuj

DNA; najistotniejszymi z nich

deoksyrybonukleazy, które hydrolizuj

zania fosfodiestrowe

•

natywny DNA wyst

puje w komórkach w kompleksie z białkami (histony, helikazy,

polimerazy i in.), białka te musz

oddzielone podczas ekstrakcji;

5. odporno

ść

mechaniczna DNA:

•

łagodne manipulowanie nie zawsze jest mo

liwe podczas izolacji DNA; ucieranie,

wytrz

sanie, mieszanie i inne czynno

ci mechaniczne mog

spowodowa

rozszczepienie DNA, zwykle nie powoduje to zniszczenia drugorz

dowej struktury

DNA, ale zmniejsza długo

ść

steczki (fragmentacja).

Etapy izolacji DNA

Niezale

nie od zastosowanej procedury wi

kszo

ść

metod opiera si

na kilku

podstawowych i niezmiennych etapach izolacji:

Etap 1. Wst

pne przygotowanie materiału biologicznego do izolacji DNA

oczyszczenie, homogenizacja, zawieszenie w buforze

Materiałem wyj

ciowym do izolacji DNA mo

e by

niemal ka

dy materiał biologiczny

(tkanka, organ, zawiesina komórkowa i in.). W zale

ci od rodzaju, jak i pochodzenia

materiału, wst

pne przygotowanie mo

e obejmowa

oczyszczenie z ró

nego rodzaju

zanieczyszcze

zewn

trznych, po

ywki i pozostało

ci innych komórek (przemywanie

buforami stabilizuj

cymi ), rozdrobnienie i homogenizacj

, a nast

pnie zawieszanie

jednolitej masy komórkowej w odpowiednim buforze.

Etap 2. Dezintegracja i liza komórek oraz uwolnienie DNA do roztworu, w którym jest

on rozpuszczalny i zabezpieczony przed degradacj

rozbicie

ciany i błony komórkowej

Dezintegracj

komórek prowadzi si

w zale

ci od rodzaju komórek i tkanek, np. poprzez

homogenizacj

(mi

kkie tkanki zwierz

ce), sonifikacj

(zawiesiny komórek), rozcieranie

(komórki ro

linne, bakteryjne), liz

detergentami (komórki z hodowli komórkowej), liz

enzymatyczn

(komórki bakteryjne, dro

owe)

uwolnienie DNA i innych komponentów wewn

trzkomórkowych do roztworu

Destrukcji błon zewn

trznych towarzyszy uwolnienie DNA oraz innych komponentów

wewn

trzkomórkowych. St

d bardzo istotne jest zachowanie odpowiednich warunków, aby

kwas nukleinowy nie uległ uszkodzeniom. Do rozpuszczenia DNA i lizy komórek słu

roztwór soli, najcz

ęś

ciej NaCl, zawieraj

cy Tris-HCl i EDTA. DNA, b

c zwi

zkiem

jonowym jest bardziej stabilny i rozpuszczalny w roztworze NaCl ni

w wodzie destylowanej.

Tris-HCl ma za zadanie utrzyma

stałe, lekko zasadowe pH roztworu, co zmniejsza

oddziaływania elektrostatyczne pomi

dzy DNA a zasadowymi białkami. EDTA wi

ąŜ

e jony

metali Cd

, Mg

,Mn

, które mogłyby tworzy

sole z anionowymi grupami fosforanowymi

DNA oraz hamuje działanie deoksyrybonukleaz, które wymagaj

dla swojej aktywno

obecno

ci jonów Mg

lub Mn

inaktywacja enzymów nukleolitycznych

Uwalniaj

cy si

z komórki kwas nukleinowy jest nara

ony na działanie degraduj

ce nukleaz

– enzymów katalizuj

cych hydroliz

1- i 2-niciowych kwasów nukleinowych (endo-, egzo-,

detoksy-, rybonukleazy i in.), przecinaj

cych wi

zania fosfodiestrowe. Unieczynnienie ich

prowadzi si

silnymi enzymami proteolitycznymi (np. proteinaz

K).

Etap 3. oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych komponentów komórkowych

dysocjacja kompleksów DNA – białko

Celem zniesienia oddziaływa

jonowych pomi

dzy naładowanymi dodatnio histonami

i innymi białkami a ujemnie naładowanym szkieletem DNA stosuje si

ró

nego rodzaju

detergenty oraz sole. Sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS) wi

ąŜ

e si

z białkami i nadaje im

silnie anionowy charakter, a tak

e działa jako czynnik denaturuj

cy deoksyrybonukleazy

i inne białka. Łagodnie alkaliczne

rodowisko (pH = 8,0) zmniejsza oddziaływania

elektrostatyczne pomi

dzy DNA a zasadowymi histonami i polikationowymi aminami,

przyczynia si

tak

e do zmniejszenia aktywno

ci nukleaz i denaturacji innych białek. Za

sole w wysokich st

ęŜ

eniach (NaCl, NaClO4 lub inn

sól) zapewniaj

całkowit

dysocjacj

kompleksów DNA-białko i usuwaj

zwi

zane kationowe poliaminy;

oddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych komponentów komórkowych

Całkowite odbiałczanie roztworu, przeprowadza si

poprzez ekstrakcj

rozpuszczalnikami

organicznymi, np. mieszanin

chloroformu i alkoholu izoamylowego, a nast

pnie

odwirowanie. W rezultacie powstaj

trzy warstwy: górna faza wodna, zawieraj

kwasy

nukleinowe, dolna faza organiczna i w

skie pasmo zdenaturowanego białka na granicy faz.

Chloroform powoduje powierzchniow

denaturacj

białek. Alkohol izoamylowy redukuje

pienienie i stabilizuje granic

fazow

, gdzie koncentruje si

białko. Górna, wodna faza,

zawieraj

ca kwasy nukleinowe jest nast

pnie oddzielana i DNA jest wytr

cany poprzez

dodanie etanolu.

Etap

zag

szczenie

preparatu

DNA

usuni

cie

zanieczyszcze

małocz

steczkowych

uzyskanie roztworu DNA o po

Ŝą

danej czysto

ci i g

sto

Po ekstrakcji kwasy nukleinowe znajduj

, przewa

nie w du

ym rozcie

czeniu, w fazie

wodnej, zanieczyszczonej małocz

steczkowymi zwi

zkami. Dodaj

c rozpuszczalnik

organiczny (np. etanol lub izopropanol) zmniejsza si

polarno

ść

rodowiska, co powoduje

zmniejszenie rozpuszczalno

ci DNA, posiadaj

cego struktur

jonow

i DNA tworzy

nitkowate osady, które mo

na zebra

poprzez odwirowanie. RNA w obecno

ci alkoholu

etylowego zwykle nie str

ca si

tak jak DNA i wyst

puje jedynie jako drobne

zanieczyszczenie, za

przy precypitacji izopropanolem pozostaje w roztworze. Efektywno

ść

wytr

cania kwasów nukleinowych zwi

ksza si

poprzez dodatek soli (np. NaCl, CH

COOH,

LiCl, MgCl, czy CH

COONH

Po wytr

ceniu i przemyciu 70 % etanolem, DNA pozostawia si

do wyschni

cia i nast

pnie

zawiesza w małej obj

ci buforu o niskiej sile jonowej (np. bufor TE) lub w wodzie.

Wykonanie

wiczenia

Celem

wiczenia jest izolacja DNA z komórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego.

Materiały i sprz

Zestaw do izolacji DNA z tkanek i linii komórkowych Genomic Mini AX Tissue

(A&A Biotechnology).

Materiały i sprz

•

komórki nowotworowe

1x10

•

70% EtOH

0,5ml

•

bufor TE

0,1ml

•

probówki Eppendorfa

•

probówki 15ml z kolumn

•

pipety automatyczne

•

wirówka Eppendorfa 12 000 – 14 000 obr/min

•

termoblok

•

worteks

Izolacja DNA z wykorzystaniem zestawu Genomic Mini AX Tissue (A&A Biotechnology)

1. Do pelletu komórek nowotworowych doda

0,9ml zawiesiny lizuj

cej LS (

uwaga

zawiesin

nale

y wymiesza

przez kilkukrotne odwracanie butelki) oraz 40µl Proteazy

LS składa si

Tritonu X-100

Chlorowodorku guanidyny

Bufor MOPS

2. Cało

ść

wymiesza

i inkubowa

w 50°C przez 30 min. Probówk

nale

y miesza

czasu do czasu przez worteksowanie.

3. Po inkubacji próbk

intensywnie worteksowa

przez 15 sek., a nast

pnie wirowa

5 min.

przy 10 000 – 14 000 obr./min.

4. Podczas wirowania nanie

ść

na kolumn

0,8ml roztworu równowa

acego K1. Poczeka

roztwór wypłynie z kolumny.

5. Pobra

supernatant

(na dnie powinien znajdowa

zwarty osad stanowi

cy mieszanin

niezlizowanego materiału oraz drobinek pochodz

cych z mieszaniny lizuj

cej)

i nanie

ść

go na kolumn

umieszczon

w probówce 15 ml. Poczeka

lizat przejdzie przez

kolumn

6. Nast

pnie dwukrotnie przepłuka

kolumn

przez dodanie 1,5 ml roztworu płucz

cego

K2. Za ka

dym razem poczeka

roztwór wypłynie z kolumny.

Skład roztworu K2:

0,8M NaCl

15% izopropanol

Bufor MOPS

7. Doda

do kolumny 0,25 ml roztworu elucyjnego K3 i poczeka

wypłynie z kolumny

(krok ten ma na celu zmniejszenie całkowitej obj

ci eluatu, gdy

martwa obj

ść

kolumny wynosi 0,3ml)

Skład roztworu K3:

1,2M NaCl

15% izopropanol

bufor Tris-HCl, pH=8,0

8. Przenie

ść

kolumn

do nowej probówki 2 ml, która posiada odpowiednie

eberka

pozwalaj

ce na łatwe umieszczenie w probówce i eluowa

DNA przez dodanie do

kolumny 1 ml roztworu elucyjnego K3.

9. Do eluatu zwieraj

cego DNA doda

0,8 ml mieszaniny precypitacyjnej PM. Cało

ść

wymiesza

i wirowa

10 min. przy 12 000 obr./min (

uwaga

: roztwór PM zawiera

dodatkowo wzmacniacz precypitacji, dlatego przed u

yciem nale

y go wymiesza

przez

kilkukrotne odwracanie butelki).

Skład PM:

izopropanol

akrylami liniowy (wzmacniacz precypitacji)

10. Po odwirowaniu zla

supernatant (

na dnie powinien by

widoczny jasnoniebieski osad

DNA)

i doda

do probówki 0,5 ml 70% EtOH, w celu wytr

cenia DNA. Próbk

wymiesza

i wirowa

3 min. przy 12 000 obr./min.

11. Po odwirowaniu zla

supernatant i trzymaj

c probówk

w pozycji odwróconej, przytkn

ąć

sam

cówk

pipety (bez pipety) do dna i

cianek probówki celem kapilarnego

usuni

cia resztek alkoholu. Nast

pnie suszy

odwrócon

do góry dnem probówk

przez

5 min. w temp. pokojowej.

12. Osad zawiesi

w 20

l buforu TE

(niebieska barwa osadu pozwala kontrolowa

proces

rozpuszczania DNA)

OPRACOWANIE WYNIKÓW

1. Opisa

procedur

izolacji DNA z komórki zwierz

cej i wyja

cel ka

dego etapu

i rol

dego odczynnika.

Scharakteryzowa

inny ni

Arabidopsis thaliana ro

linny organizm modelowy.

Wymieni

główne ró

nice mi

dzy genomem komórki ro

linnej i zwierz

cej.