Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej

Katedra Technologii Leków i Biochemii

Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt

IZOLACJA DNA Z TYTONIU

Wstęp.

Niemal cała ilość informacji dotyczącej budowy organizmu roślinnego, jego

rozwoju i funkcjonowania zawarta jest w jądrze komórkowym i zakodowana w DNA.

Tylko niewielka część tej informacji znajduje się również w DNA organelli

(mitochondrialnym, a u roślin zielonych – także w chloroplastowym). Informacja ta

jest przekazywana do nowo powstających komórek w wyniku replikacji DNA w czasie

podziału komórek merystematycznych, a podczas rozmnażania roślin – komórkom

generatywnym i następnym pokoleniom.

Biorąc pod uwagę najmniejszą ilość DNA znajdującego się w komórce rośliny

kwiatowej (Arabidopsis thaliana – 0,14 pg, co odpowiada 125 x 10

6

par zasad),

przeciętną masę cząsteczkową polipeptydu (50 kDa) i zakładając, że cały DNA pełni

funkcję kodującą, wyliczono, że mógłby on zawierać ponad 18 000 genów. Ilość DNA

w komórkach innych roślin wielokrotnie przekracza zawartość DNA u Arabidopsis,

toteż teoretycznie liczba genów jest dla nich znacznie większa. W rzeczywistości

liczba kodowanych (i ulegających ekspresji) genów nawet w roślinach o genomie

100-krotnie większym niż genom Arabidopsis nie przekracza 20 000. Jest to

skutkiem występowania u roślin 1) licznych genów w wielokrotnych powtórzeniach

(kopiach), 2) długich tzw. powtarzalnych (ang. repetitive) sekwencji DNA, które nie

mają zdolności kodowania, a w dużych genomach roślinnych stanowią do 60%

całkowitego DNA, oraz 3) intronów (sekwencji niekodujących) w strukturze genu.

Ponadto u wielu roślin występuje zjawisko poliploidalności, polegające na

zwielokrotnieniu liczby chromosomów, a tym samym – ilości DNA, bez powiększania

asortymentu kodowanych białek.

1

Tabela1. Wielkość genomu niektórych organizmów modelowych i roślin użytkowych,
które są przedmiotem badań molekularnych. W celu porównania zamieszczono
również wielkość genomu ludzkiego. Dane z początku 2001 roku.

Organizm

Przybliżona wielkość

genomu

(w milionach par zasad)

Zaawansowanie

sekwencjonowania

genomu

Wirusy

Bakterie

Drożdże – S. Cerevisiae

Nicień – C. Elegans

Arabidopsis thaliana

Drosophila melanogaster

Ryż

Kukurydza

Homo sapiens

Pszenica

0,3

4

12

100
125
200
700

2500
5000

15000

wiele zakończone
wiele zakończone

zakończone
zakończone

niemal zakończone

zakończone

częściowe
częściowe

zakończone

częściowe

Organizm modelowy to taki, który badany jest przez wielu naukowców ze względu

na jego cechy, które czynią go łatwym obiektem badań oraz jest on na tyle podobny

do innych organizmów, że wnioski wyciągnięte z jego badań mogą być szeroko

zastosowane. Kilka gatunków roślin było intensywnie badanych i z czasem stało się

układami modelowymi; najważniejszym jest ostatnio Arabidopsis thaliana, a inne

szeroko badane to kukurydza i ryż.

Arabidopsis thaliana (rzodkiewnik pospolity, arabidopsis) należy do rodziny

kapustowatych (Brassicaceae), jest małym i raczej niezbyt ważnym chwastem

rolnicznym. Ma wiele istotnych cech, które czynią go odpowiednim organizmem

modelowym do badania roślin:

• Małe rozmiary genomu, 120 000 kpz (w porównaniu z ryżem – 450 000 kpz,

czy z haploidalnym genomem kukurydzy – 4 500 000 kpz), umożliwiły

praktycznie całkowite zsekwencjonowanie genomu (Arabidipsis Genome

Project – AGP).

• Niewielkie rozmiary. Dużą liczbę roślin można łatwo hodować w komorach

hodowlanych lub szklarniach.

• Krótki cykl życiowy. Od wykiełkowania do wytworzenia nowych nasion mija

6 – 8 tygodni.

2

• Małe nasiona, ważące 20 µg każde, około 20 000 z każdej rośliny. Nasiona

można łatwo przechowywać i łatwo też uzyskiwać dużą liczbę roślin.

• Łatwo jest indukować mutacje (poddawać mutagenezie) za pomocą

czynników chemicznych lub promieniowania jonizującego.

• Łatwy obiekt do stosowania technik biologii molekularnej.

Totipotencja – w żywej komórce roślinnej somatycznej rośliny zawarta jest całość

informacji genetycznej. Jednak różne komórki i tkanki zawierają różne białka. Inaczej

mówiąc, różnice między komórkami (i tkankami) polegają na tym, że ulegają w nich

ekspresji różne zespoły genów. Dotyczy to jednak niewielkiej części materiału

genetycznego, genów kodujących białka organospecyficzne. Większość białek jest

identyczna we wszystkich organach rośliny. Na kilkanaście tysięcy różnych białek

syntetyzowanych w komórce roślinnej tylko kilkaset występuje wyłącznie w

komórkach wyspecjalizowanych organów i tkanek. Pełnią tam one rolę strukturalną,

katalityczną i regulacyjną, właściwą tylko dla tych organów i tkanek.

Genom chloroplastowy.

Plastydy mają pewien stopień autonomii genetycznej związanej z obecnością DNA w

tych organellach. DNA chloroplastowy wykazuje wiele cech wspólnych z materiałem

genetycznym organizmów prokariotycznych. Jego cząsteczka ma kształt kolisty i nie

zawiera białek histonowych. Pojedynczy chloroplast zawiera 200 – 300 identycznych

kopii DNA, które występują w grupach liczących od 5 do 20 cząsteczek, zazwyczaj w

połączeniu z wewnętrzną błoną osłonki lub błonami tylakoidów. Poznano całkowitą

sekwencję nukleotydów kolistego DNA chloroplastowego niektórych gatunków roślin

(tytoń, ryż) i wyjaśniono funkcję większości występujących tam genów. Oprócz

genów niektórych białek chloroplastowych, DNA plastydowy zawiera także geny

kodujące wszystkie rodzaje RNA chloroplastowego (mRNA, tRNA, rRNA)

uczestniczące w procesie translacji. Pojemność kodująca chloroplastowego DNA jest

stosunkowo niewielka. Waha się ona u roślin lądowych w zakresie 120 – 160 tys. par

zasad, ale w niektórych przypadkach liczba ta może przekraczać 200 tys. par zasad.

DNA chloroplastowy zawiera prawie zawsze obszar liczący ok. 22 – 26 tys. par

zasad, w którym część genów jest powtórzona (ang. inverted repeat), jednak

większość genów w cząsteczce występuje pojedynczo. Szacuje się, że genom

3

plastydowy zawiera geny dla około 120 białek, co stanowi niewielką część wszystkich

białek występujących w chloroplastach, zaś pozostałe białka kodowane są przez

genom jądrowy. Wiele białek chloroplastowych, jak np. karboksylaza

1,5-bisfosforybulozy, kluczowy enzym w procesie asymilacji CO

2

, powstaje w wyniku

współdziałania genomu plastydowego i jądrowego.

Genom mitochondrialny.

W macierzy mitochondrialnej roślin występuje wiele kopii kolistego DNA oraz

rybosomów charakterystycznych dla organizmów prokariotycznych (o stałej

sedymentacji 70S). Mitochondrialny DNA (mtDNA) koduje u roślin rRNA dla obu

podjednostek tych rybosomów, wszystkie tRNA biorące udział w biosyntezie białek

mitochondrialnych oraz niektóre białka mitochondrialne.

Wykonanie ćwiczenia.

Celem ćwiczenia jest izolacja DNA z liści tytoniu pochodzącego z hodowli in vitro.

Materiały i sprzęt

Zestaw do izolacji DNA z roślin Genomic Mini AX Plant ( A&A Biotechnology,
Gdańsk).


Przygotować na 1 podgrupę:

liście

tytoniu

50

mg

ciekły azot

10 ml

70% EtOH

2 ml

bufor TE (10mM Tris-zasada, 1mM EDTA, pH 8)

100

µl

probówki eppendorfa
probówki 15 ml z kolumną
pipety automatyczne
moździerz
łopatka metalowa
wirówka eppendorfa 12 – 14 000 obr./min.
łaźnia wodna na 50

o

C

worteks

4

Odczynniki do elektroforezy agarozowej:

1%

agaroza

0.35

g

agarozy/35

ml

TBE

1x

bufor TBEx5 :
(0,045 M Tris-zasada, 0,045 M kwas borowy, 0,001 M EDTA, pH 8)

50 ml

bromek etydyny 0,5

µg/ml

bufor obciążający LB (50% glicerol, 0,25% błękit bromofenolowy, 1 mM EDTA, pH 8)
marker wielkości DNA
bufor TE


cylinder miarowy 0,5 l i 100 ml
kolba Erlenmeyer’a 25 ml

aparat do elekroforezy poziomej
zasilacz do elektroforezy
naczynie do wybarwienia żelu
transiluminator UV


Izolacja DNA.

1. Około 50 mg świeżej masy roślinnej (liści tytoniu) umieścić w probówce

eppendorfa i wstawić probówkę do lodu.

2. Następnie tkankę roślinną przenieść do moździerza i ucierać energicznie i

szybko z 10 ml ciekłego azotu.

3. Przenieść utartą masę roślinną z powrotem do eppendorfa i dodać 0.9 ml

zawiesiny lizującej LS oraz 20 µl roztworu Proteazy.

4. Całość wymieszać i inkubować w 50

o

C przez 30 minut. Próbkę należy od

czasu do czasu mieszać.

5. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15 sek. A następnie

wirować 5 minut przy 14 000 obr./min.

6. Po wirowaniu pobrać supernatant i nanieść go na kolumnę umieszczoną w

probówce 15 ml. Poczekać aż lizat przejdzie przez kolumnę.

7. Następnie dwukrotnie przepłukać kolumnę poprzez dodanie 1.5 ml roztworu

płuczącego K2. Za każdym razem poczekać aż roztwór wypłynie z kolumny.

8. Dodać do kolumny 0.25 ml roztworu elucyjnego K3 i poczekać aż wypłynie z

kolumny.

9. Przenieść kolumnę do nowej probówki eppendorfa 2 ml, która posiada

odpowiednie żeberka pozwalające na łatwe umieszczenie w probówce i
eluować DNA przez dodanie do kolumny 1 ml roztworu elucyjnego K3.

10. Do eluatu zawierającego DNA dodać 0.8 ml mieszaniny precypitacyjnej PM.

Całość wymieszać i wirować 10 minut przy 12 000 obr./min.

11.

Po odwirowaniu zlać supernatant (na dnie powinien być widoczny
jasnoniebieski osad DNA) o dodać do probówki 0.5 ml 70% EtOH. Próbkę
wymieszać i wirować 3 minuty przy 12 000 obr./min.

12. Po wirowaniu zlać supernatant i odessać za pomocą pipety resztki etanolu.

Następnie próbkę suszyć pod wyciągiem około 10 minut.

13. Osad zawiesić w 20

µl buforu TE, inkubować przez 5 minut w 50

o

C, schłodzić

i przechowywać w zamrażarce.

5

Rozdział elektroforetyczny wyizolowanego DNA.

1. Próbkę z DNA wyjąć z zamrażarki i pozostawić w temperaturze pokojowej.
2. 1% żel agarozowy umieścić w aparacie do elektroforezy pionowej i wlać

odpowiednią ilość buforu TBEx1. W tym celu bufor TBEx5 rozcieńczyć: 100 ml
TBEx5 i 400 ml wody redestylowanej.

3. Sprawdzić czy studzienki w żelu są prawidłowo utworzone.
4. Do próbek z DNA dodać 5 µl buforu obciążającego LB i próbki zwirować przez

1 minutę przy 5 tys. obr./min.

5. Nanieść po 25 µl zawartości każdej próbki do studzienki oraz po 25 µl

markera wielkości DNA.

6. Rozdział DNA przeprowadzić przy stałym napięciu 50 V przez 3 godziny.
7. Żel wybarwić bromkiem etydyny (100

µl/200 ml wody redestylowanej) przez ½

godziny, przepłukać dwukrotnie wodą destylowaną i oglądać na
transiluminatorze UV.

Przygotowanie sprawozdania.

1. Opisać procedurę izolacji DNA z komórki roślinnej i wyjaśnić cel każdego

etapu i rolę każdego czynnika.

2. Porównać genom mitochondrialny komórki roślinnej i zwierzęcej.
3. Podać przykłady wielkości genomów mitochondrialnych i chloroplastowych dla

różnych organizmów.

Literatura uzupełniająca:

1. Fizjologia roślin. J. Kopcewicz, S. Lewak, PWN 2002.
2. Biologia roślin. Krótkie wykłady. A.J. Lack, D.E. Evans, PWN 2003.
3. Genomy. T.A. Brown, PWN 2001.

6