Giełda wejściówka 2 Biolo-Molo

METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ W DIAGNOSTYCE

- etapy hybrydyzacji
denaturacja nici (100*C lub pH>13) → przyłączanie wyznakowanej sondy → detekcja

- Western blotting – białko na membranę

1. elektroforeza (w żelu) białek = rozdział białek

2. elektrotransfer – przekładamy białka z żelu na (nitrocelulozę) membranę
3. immunodetekcja – dodajemy mleko, bo ono blokuje miejsca gdzie nie ma białka, a dopiero potem

przeciwciała:

→

p. pierwszorzędowe (specyficzna dla białka)

→

p. drugorzędowe (przeciw pierwszorzędowym) połączone z enzymem

o

rozdział białek na żelu poliakrylowym

o

podgrzewamy

o

dodajemy SDS – znosi ładunki własne białek, ale nadaje ładunek (–) aby białka wędrowały wg masy

o

nanosimy na żel, najszybciej wędrują krótkie fragmenty, najdłużej długie

o

białko przenosi się z żelu na membranę przy przyłożonym napięciu

o

przeciwciałami I-rzędu identyfikujemy białka na membranie, przeciwciała II-rzędu łączą się z
przeciwciałami II-rzędu

o

należy dodać jeszcze substraty dla tego enzymu z przeciwciał II rzędowych,

o

obserwujemy świecenie

- dopasować metodę hybrydyzacji do materiału

–

Southern – DNA;

–

Northern – mRNA;

–

Western – białko;

–

Eastern – Kamiński

- dlaczego PCR ulega zahamowaniu na koniec?
Dlatego, że nici DNA same się nie rozpletą.

- co można wykryć metodą PCR?
PCR jest stosowana do otrzymywania zwiększonej ilości DNA przed jego dalszą analizą np. za pomocą RFLP
lub SSCP. Technikę tą używa się w kryminalistyce, ale także do ustalenia nosicielstwa zmutowanego genu (np.
mukowiscydoza), w badaniach nad rakiem, w diagnostyce chorób zakaźnych i pasożytniczych oraz
antropologii.

- co jest potrzebne do przeprowadzenia PCR?
Próbka DNA, termostat, startery, polimeraza DNA.

- dopasować nazwy do skrótów – LOH, MDR, SSCP, FISH
LOH - loss of heterozygosity - utrata heterozygotyczności. Mutacja jednego z alleli jest wrodzona, objawy
ujawniają się gdy dojdzie do somatycznej mutacji drugiego.
MDR - multiple drug resistance protein - białko oporności wielolekowej. Zbudowane jest z dwóch
homologicznych połówek, połączonych domeną regulatorową. Należy do rodziny białek ABC.
SSCP - single strand conformation polimorphism - polimorfizm konformacji pojedynczych nici DNA. Jest to
metoda skriningowa. Porównanie konformacji jednoniciowych struktur. Daje 50% prawdopodobieństwo
znalezienia mutacji. Ta metoda nie wykrywa mutacji punktowych, służy np. do diagnostyki mukowiscydozy.
Rozplecione nici Dna przyjmują konformację charakterystyczną, po mutacji będzie inna konformacja i będzie
to można wykryć w zelu agarozowym po elektroforezie).
FISH - fluorescent in situ hybridization - fluorescencyjna hybrydyzacja In situ. Jest techniką cytogenetyczną,
służącą do wykrywania w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą
fluorescencyjnych sond DNA.

- czym jest i w jaki sposób powstaje chromosom Philadelphia?
Jest to translokacja pomiędzy chromosomem 9 i 22 (t(9;22)(q34;q11)). Powoduje ona powstanie genu
fuzyjnego bcr-abl. Fragment bcr (ang. breakpoint cluster region), znajdujący się na chromosomie 22 w rejonie
q11, zostaje połączony z genem abl znajdującym się na chromosomie 9 w rejonie q34. Aktywuje to onkogen
prowadzący do powstania przewlekłej białaczki szpikowej.

- opisać FISH
a) usunięcie cytoplazmy i utrwalenie jąder komórkowych na szkiełku
b) naniesienie fluorescencyjnej sondy na preparat
c) krótkotrwała denaturacja i kilkugodzinna hybrydyzacja
d) usunięcie nadmiaru niezhybrydyzowanej sondy (płukanie) i zabarwienie jąder komórkowych
e) analiza preparatu pod mikroskopem fluorescencyjnym

- opisać PCR

Zasada metody PCR (cykliczne (25 – 40 krotne) powielenie procesu amplifikacji wybranych sekwencji DNA
a) denaturacja DNA (95

°

C)

b) swoiste przyłączenie starterów do 3’ końcowego amplifikowanego fragmentu (55-70

°

C)

c) synteza i wydłużanie nowych łańcuchów DNA do miejsc wyznaczonych przez startery (72

°

C)

Starter – ok. 20 nukleotydowe sekwencje DNA, określa już długość otrzymanego produktu.
Dopiero po trzecim cyklu otrzymujemy konkretne fragmenty, które nas interesują, czyli produkty

produktów pożądanej długości (2 takie cząsteczki)

- opisać krótko PCR-ASO
Na przykładzie badania przesiewowego niedokrwistości sierpowatorkwinkowej
a) liza krwinek białych w celu otrzymania zdenaturowanego DNA
b) namnożenie regionu beta-globiny przy użyciu PCR
c) naniesienie namnożonego DNA na filtry połączone ze specyficznymi oligonukleotydami komplementarnymi
do badanego genu
d) po uwidocznieniu się krążków na błonie rentgenowskiej genotyp można bezpośrednio odczytać z filtrów

- czym jest TGGE?
TGGE - Temperature Gradient Gel Electrophoresis - Elektroforeza DNA w gradiencie temperatury.
Wykorzystanie gradientu temperatury umożliwia wprowadzenie dodatkowego kryterium separacji opartego na
różnicach konformacyjnych rozdzielanych makrocząsteczek. Zastosowanie tej metody umożliwia między
innymi rozdział fragmentów DNA o identycznej długości, różniących się jedynie jedną parą zasad. Fragment
DNA wędrując przez żel przesuwa się również wzdłuż gradientu temperatury, co powoduje jego stopniową
denaturację. Im wcześniej/szybciej podwójna nić DNA ulega rozwinięciu tym wolniej fragment przesuwa się
przez żel. Ponieważ pierwszorzędowa struktura DNA ma zasadniczy wpływ na jego temperaturę topnienia,
fragmenty różniące się tylko jedną parą zasad mogą być precyzyjnie rozdzielone.

- opisać test ASO
Hybrydyzacja miedzy powielonymi fragmentami dna, w których poszukuje się danej mutacji, a dwoma
różnymi sondami molekularnymi (długości 15-20 nukleotydów). Jedna sonda jest komplementarna do
sekwencji prawidłowej badanego dna, druga do sekwencji zmutowanej. Obecność sygnału po hybrydyzacji z
sonda komplementarna do sekwencji prawidłowej oznacza brak mutacji i vice versa.

- na czym polega polimorfizm mikrosatelit i gdzie jest takowywykorzystywany?
Mikrosatelity to sekwencje zawierające zmienną liczbę tandemowych powtórzeń kilkunasto- lub
kilkudziesięcio nukleotydowego motywu. W zależności od ilości powtórzeń fragment taki ma
charakterystyczną długość. Może ona być badana tą samą metodą PCR wraz z elektroforezą, połączoną z
hybrydyzacją z wyznakowaną sondą. Liczba powtórzeń decyduje o długości fragmentu, co z kolei wpływa na
szybkości jego przemieszczania się podczas elektroforezy.
Wykorzystanie: ustalanie ojcostwa, analiza w ekspertyzie dla sadow, badanie śladów biologicznych w
kryminalistyce

- co to jest blotting?
Bloting DNA to transfer DNA z żelu agarozy na błonę/filtr w najczęściej w celu hybrydyzacji z próbką
komplementarnego znakowanego DNA. Błona wykonana jest na ogół z nitrocelulozy lub nylonu. Przejście
DNA z żelu na membranę przyspiesza podciśnienie pod membraną. Po transferze z żelu DNA jest wiązany z
membrana poprzez przez naświetlanie UV lub zapieczenie w mikrofalówce lub suszarce.

- co może służyć jako źródło DNA?
DNA może być uzyskane niemal z każdej ludzkiej tkanki. Źródła DNA z miejsca przestępstwa mogą
obejmować krew, nasienie, tkanki, włosy, a także ślinę.

- czym są startery w reakcji PCR?
Starter – ok. 20 nukleotydowe sekwencje DNA, określa już długość otrzymanego produktu.
Startery (primery), czyli krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do
fragmentów matrycy, znajdujących się na obu końcach interesującego nas genu. Wyróżniamy dwa typy
starterów: starter przedni (forward) – jego sekwencja musi być taka sama jak sekwencja powielana; starter
wsteczny (reverse) – jego sekwencja musi być komplementarna do powielanej.

- rozwiń nazwę PCR i powiedz, skąd wynika nazwa
Polymerase Chain Reaction – łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w
warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki.

- kolejne etapy PCR (Denaturacja - Przyłączanie – Wydłużanie)
było w opisie PCR

- wymień badania, które pozwolą na diagnozę mutacji punktowych DNA
Technika southern, Metoda PCR-RFLP – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych, PCR-HDA
(heterodupleks), test ASO

- do czego w PCR sekwencyjnym są potrzebne dideoksynukleotydy?
dideoksyrybonukleotydy (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), czyli zmodyfikowane pochodne
deoksyrybonulektydów, które pozbawione są grupy 3’OH – niezbędnej do utworzenia wiązania z kolejnym
nukleotydem w syntetyzowanym łańcuchu DNA. Polimeraza DNA, która katalizuje reakcję tworzenia nowych
nici DNA na bazie wzorca DNA matrycowego nie rozróżnia struktury deoksy- i dideoksyrybonukleotydów,
dlatego też może je wbudowywać do powstających nici wymiennie. Jeżeli polimeraza włączy zwykły
deoksyrybonukleotyd to możliwe jest utworzenie wiązania z kolejnym nukleotydem i reakcja nie zostaje
zatrzymana. Natomiast użycie przez polimerazę dideoksyrybonukleotydu powoduje zahamowanie dalszej
syntezy (następuje tzw. terminacja łańcucha), gdyż brak wolnej grupy 3’OH uniemożliwia tworzenie dalszych
wiązań. Każdy z czterech dideoksyrybonukleotydów ma przyłączony inny fluorochrom, który emituje światło
innej barwy.

- składniki PCR sekwencyjnego
składniki: matryca DNA, polimeraza DNA, bufor zapewniający odpowiednie warunki reakcji oraz starter
wyznaczający początek odcinka, który ma być zsekwencjonowany, a także składniki budulcowe
nowosyntetyzowanej nici, czyli cztery rodzaje deoksyrybonukleotydów w postaci trójfosforanów (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP).

- jakie cechy możemy uwidocznić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym?
Wielkość badanej substancji, skład substancji, kształt czasteczek.