Elementy Biotechnologii

WYKŁAD NR 4

Uniwersytet Warszawski
Wydział Chemii

Warszawa, 27.03.2005

Mikroorganizmy c.d.- przenoszenie energii.

*******

Rozwój procesu technologicznego - powiększanie

skali

Metody prowadzenia procesów biochemicznych.

Techniki hodowlane.

Procesy z unieruchomionymi komórkami.

Kierowanie aktywnością chemiczną

drobnoustrojów.

Kontrola procesu przemysłowego.

ELEMENTY BIOTECHNOLOGII

WYKŁAD NR 4

literatura wykorzystana do wykładu
K. Szewczyk: Technologia biochemiczna, Wydawnictwa
Politechniki Warszawskiej 1997
Aiba, Humprey, Millis: Inżynieria biochemiczna, WNT
Warszawa 1977.
S. Russel: Biotechnologia, PWN Warszawa 1990.
S. Małolepszy (red). Biotechnologia roślin, PWN 2001.

Przenoszenie energii

energia chemiczna

energia świetlna

Oddychanie - zamiana energii chemicznej na inne rodzaje energii

Utlenianie zw. organicznych - oderwanie elektronów (lub atomów
wodoru)

przypomnienie:

•

procesy aerobowe i anaerobowe

•

katabolizm i anabolizm

Źródła energii

wydzielanie energii

pochłanianie energii

podział mikroorganizmów według:

RODZAJU ŹRÓDŁA WĘGLA:

• organizmy autotroficzne (samożywne, bazują na CO

2

)

• organizmy heterotroficzne (cudzożywne, bazują na związkach

organicznych)

RODZAJU ŹRÓDŁA ENERGII:

•

organizmy chemotroficzne (rozkład zw. chemicznych)

•

organizmy fototroficzne (absorbcja promieniowania świetlnego)

RODZAJU DONORÓW ELEKTRONÓW I PROTONÓW:

•

organizmy fitotroficzne (ze zw. nieorganicznych)

•

organizmy organotroficzne (ze zw. nieorganicznych)

z poprzedniego wykładu:

FOTOAUTOTROFY

samożywne, korzystają z energii słonecznej
(glony, sinice, niektóre bakterie)
oczyszczanie ścieków, produkcja biomasy

CHEMOLITOTROFY

korzystają z energii zredukowanych związków
(bakterie metanowe, wodorowe, żelazowe, nitryfikujące,
siarkowe)
oczyszczanie ścieków, ługowanie metali

HETEROTROFY

korzystają ze związków organicznych
(większość bakterii i grzybów)
najpowszechniej wykorzystywane w biotechnologiach

Mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym

z poprzedniego wykładu:

z poprzedniego wykładu:

TYPY ODDYCHANIA
•

tlenowe

O

2

H

2

O

•

fermentacja

przemiana zw. organicznych

•

azotanowe

NO

3

-

NO

2

-

•

siarczanowe

SO

4

2-

S

2-

•

fermentacja metanowa

CO

2

CH

4

Mikroorganizmy o znaczeniu przemysłowym

ORGANIZMY

PROTOTROFICZNE
syntezują wszelkie niezbędne
substancje z pojedynczego źródła
pokarmu

AUKSOTROFICZNE
wymagają dodatku witamin,
aminokwasów lub innych
zw. organicznych

z poprzedniego wykładu:

energetyka katabolizmu

adenozyna

dwufosforan adenozyny (ADP)

trójfosforan adenozyny (ATP)

O

N

H

H

OH

H

OH

H

P

O

O

P

O

HO

O

O

O

P

O

O

O

N

N

N

NH

2

„wiązanie o dużej energii”

ATP ADP AMP

(monofosforan)

(rzadziej)

Każda komórka organizmu tworzy lub rozkłada około 10,000,000 cząsteczek ATP na sekundę

Odpoczywający człowiek zużywa (tworzy lub rozkłada) około 45 kg ATP dziennie

produkcja ATP przy użyciu energii z reakcji redoks (oksydatywna
fosforylacja)

przenośniki elektonów:
koenzymy:

NAD+ (dinukleotyd
nikotynamidoadeninowy)
jest koenzymem często
występującym w
dehydrogenazach. Z
substratu usuwa dwa
atomy wodoru (2H

+

i 2e

-

)

N

NH

2

O

R

N

NH

2

O

R

+2e + 2H

H

H

NAD

+

NADH

adenina

adenozyna

O

H

H

OH

H

OH

H

P

HO

O

O

P

O

HO

O

O

O

H

H

OH

H

OH

H

N

N

N

N

NH

2

przenośniki elektonów:
koenzymy:

NADP+ (fosforan dinukleotydu
nikotynamidoadeninowy)
występuje w dehydrogenazach. Z
substratu usuwa dwa atomy
wodoru (2H

+

i 2e

-

)

N

NH

2

O

R

N

NH

2

O

R

H

H

+2e + 2H

NADPH = fosforan NADH

O

H

H

OH

H

OH

H

P

HO

O

O

P

O

HO

O

O

O

H

H

OPO

2

2-

H

OH

H

N

N

N

N

NH

2

nikot

przenośniki elektonów:
koenzymy:

N

N

NH

N

O

O

H

3

C

H

3

C

R

N

N

NH

N

O

O

H

3

C

H

3

C

R

H

H

+ 2H

+

+ 2e

-

P

HO

O

O

P

O

HO

O

O

O

H

H

OH

H

OH

H

N

N

N

N

NH

2

N

N

NH

N

O

O

H

3

C

H

3

C

H

OH

OH

OH

H

FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy) koenzym

występujący w dehydrogenazach. Usuwa dwa
atomy wodoru (2H

+

and 2e

-

) tworząc FADH

2

.

• opracowanie technologicznej koncepcji procesu
• ustalenie liczby i rodzaju czynności jednostkowych
• badania doświadczalne
• obliczenia projektowe
• wstępna ocena ekonomiczna procesu

Z laboratorium do przemysłu:

Rozwój procesu technologicznego

Rozwój procesu (process development) prowadzenie procesu w skalach
pośrednich miedzy laboratoryjną a przemysłową:

Dlaczego stosuje się skale pośrednie?

•

sprawdzanie przydatności typów aparatu

– wybór najlepszych

•

uzyskanie danych o przebiegu czynności jednostkowej w większej skali

•

określenie wskaźników ruchowych aparatury

(szybkość parowania, zużycie mocy)

•

określenie wstępnych wskaźników technologicznych

(zużycie surowców głównych i pomocniczych, pary, energii elektrycznej)

•

ustalenie rodzaju materiałów na aparaturę i badania trwałości aparatury (korozja)

•

badanie skutków ruchu ciągłego

(badanie gromadzenia się zanieczyszczeń, aktywności katalizatorów)

•

badania dynamiki procesu, próby automatyzacji

Z laboratorium do przemysłu:

Rozwój procesu technologicznego

Skale procesu:

• instalacja laboratoryjna

0,01%

• instalacja ćwierćtechniczna

0,1%

• instalacja półtechniczna

1%

• instalacja techniczna doświadczalna 10 %
• instalacja techniczna produkcyjna

100%

instalacje pilotujące

Powiększanie skali reaktorów:

podobieństwo: geometryczne

hydrodynamiczne

(opory przepływu, mieszanie)

procesów przenoszenia ciepła

(rozkład temperatur)

procesów przenoszenia masy
chemiczne

Z laboratorium do przemysłu:

Rozwój procesu technologicznego

Powiększanie skali reaktorów:

względnie łatwe do przewidywania skutki powiększania skali:
rektyfikacja, sedymentacja, wymiana ciepła

trudne do przewidywania:
krystalizacja, operacje w układach wielofazowych

badania doświadczalne + modele matematyczne

dostarczają parametrów opisu

elementarnych zjawisk
fizycznych i chemicznych

wykorzystują parametry dostarczone
w badaniach doświadczalnych
problem: modele mogą być zależne od skali procesu

proces odwrotny: pomniejszanie skali

(do testowania innowacji)

Z laboratorium do przemysłu:

Rozwój procesu technologicznego

Powiększanie skali bioreaktorów

:

zapotrzebowanie mocy na jednostkę objętości mieszaniny
objętościowy współczynnik wnikania tlenu

stężenie

produktu

moc na jednostkę objętości cieczy
lub objętościowa szybkość wnikania tlenu

zakres korzystny
dla powiększania skali

Przenoszenie wyników hodowli laboratoryjnych na skalę przemysłową

:

hodowla szczepu przemysłowego

pierwsza selekcja

przechowanie kultury

druga selekcja
(kolby wstrząsane)

przechowanie kultury

trzecia selekcja (

liofilizacja próbek)

skala półtechniczna

skala przemysłowa

test produkcyjny

Z laboratorium do przemysłu:

Rozwój procesu technologicznego

PODSUMOWANIE

:

1. Powiększanie skali bioprocesów dotyczy:

nowych procesów
znanych procesów ale z ulepszonymi szczepami lub pożywkami

2. Instalacja powinna stanowić jak najwierniejszą kopię

instalacji przemysłowej

3. Trzy stadia przenoszenia danych:

laboratoryjna (kolby wstrząsane 0.5-1 L)
półtechniczna (zbiorniki do 3 m

3

)

przemysłowa

4. Problemy operowania inokulatem w dużej skali

Kontrola procesu przemysłowego

aparatura pomiarowa i regulacyjna

efektywna regulacja procesu
1.

BADANIA

procesu w aparaturze z ciągłym monitorowaniem

wszystkich istotnych parametrów

2.

KORELACJA

obserwacji z istniejąca wiedzą o mechanizmach

regulacji procesów komórkowych

3.

ODTWORZENIE

pożądanych warunków regulacji w reaktorze

(pętla sprzężenia zwrotnego)

często stosuje się tylko punkt 3: np. gdy dokładne mechanizmy nie są znane,

bada się tylko wpływ różnych warunków na szybkość i wydajność procesu

selekcja szczepów, wywoływanie mutacji
dobór pożywek,

optymalne efekty ekonomiczne w biotechnologii

dobór optymalnych drobnoustrojów

regulacja warunków procesu

badania metabolizmu i regulacji przebiegu procesu

dobór i konstruowanie odpowiedniej

aparatury do kontroli metabolitów regulacyjnych

Metody prowadzenia procesów biochemicznych

hodowle

podział wg sposobu prowadzenia procesu

okresowe

ciągłe

okresowe z ciągłym

dozowaniem pożywki

HODOWLA OKRESOWA:

załadowanie pożywki do bioreaktora
sterylizowanie pożywki wraz z
reaktorem
zaszczepienie materiału
posiewowego
prowadzenie namnażania
mikroorganizmów

substrat

czas

st

ęż

enie

biomasa

adaptacja

przyspieszenie
wzrostu

wzrost
wykładniczy

hamowanie
wzrostu

faza
stacjonarna

Metody prowadzenia procesów biochemicznych

HODOWLA PÓŁOKRESOWA:
hodowla okresowa z ciągłym dozowaniem pożywki do bioreaktora

dwa sposoby prowadzenia:
•stałe natężenie dopływu pożywki
•zmienne natężenie zasilania

(stałe stężenie substratu limitującego wzrost, trzeba wtedy zwiększać dopływ pożywki w
miarę wykładniczego przyrostu biomasy)

•powtarzalna hodowla półokresowa

(częściowe opróżnienie reaktora, pozostałość jest wykorzystana do namnożenia nowego
materiału - zalety: skrócenie cyklu produkcyjnego)

zalety:

większa elastyczność prowadzenia hodowli
możliwość kontrolowania stęż. substratu
możliwość automatyzacji

wady:

konieczność jałowego dozowania pożywki
możliwość degeneracji szczepu

substrat

czas

st

ęż

enie

biomasa

Metody prowadzenia procesów biochemicznych

HODOWLA CIĄGŁA:
w fermentorze przepływowym zasilanym pożywką

dopływ pożywki = odpływ mieszaniny pofermentacyjnej

warunki ustalone:

szybkość odprowadzania biomasy = szybkość przyrostu biomasy

preferowane są komórki szybko rosnące

warto stosować gdy:

wysokie stężenie substratu hamuje wzrost drobnoustrojów,
dla otrzymywania biomasy lub metabolitów pierwotnych (szczepy do otrzymywania
metabolitów wtórnych są zazwyczaj zbyt powolne, i są wypierane przez mutanty szybciej
rosnące)

nie warto stosować gdy:

gdy produkt działa hamująco na wzrost komórek (np. fermentacja etanolowa, butanolowo-
acetonowa)

Metody prowadzenia procesów biochemicznych

HODOWLA CIĄGŁA Z RECYRKULACJĄ BIOMASY:

bioreaktor

separator

pożywka

część biomasy

recyrkulacja

biomasy

eluat
zawierający produkt

bioreaktor

ekstraktor

(dializer)

ekstrakt

rozpuszczalnik

gdy produkty metabolizmu hamują
wzrost mikroorganizmów:
kaskada reaktorów

stosowana w fermentacji etanolowej,

lub usuwanie produktów ze środowiska
reakcji

odparowanie pod obniżonym ciśnieniem (dla hodowli

beztlenowych), ekstrakcja,

Metody prowadzenia procesów biochemicznych

hodowle
wgłębne

zawiesina drobnoustrojów
w ciekłej pożywce

hodowle

w podłożach ciekłych

w podłożach stałych

hodowle
powierzchniowe

wzrost grzybów na
powierzchni pożywki

hodowle
z unieruchomionym
materiałem
biologicznym

materiał na nośnikach

hodowle grzybów
na pożywkach
stałych

(np. na ziarnach zbóż,
odpadkach celulozowych)

podział wg stanu fizycznego pożywki

Metody prowadzenia procesów biochemicznych

HODOWLA Z UNIERUCHOMIONYM MATERIAŁEM BIOLOGICZNYM:

gdy celem jest otrzymanie metabolitów lub przeprowadzenie przemiany za
pomocą enzymów:

XVII wiek- produkcja octu za pomocą Acetobacter na wiórach drewnianych

od XIX w. - zastosowanie filtrów biologicznych (zawierających mikroflorę) do oczyszczania ścieków,

•unieruchamianie komórek
•unieruchamianie enzymów

wady hodowli wgłębnych:

straty materiału biologicznego,
konieczność oddzielania biomasy od płynu pohodowlanego,
ograniczone możliwości zastosowania procesów ciągłych

Metody prowadzenia procesów biochemicznych

HODOWLA Z UNIERUCHOMIONYM MATERIAŁEM BIOLOGICZNYM:

metody unieruchamiania materiału biologicznego:
sorpcyjne: wiązanie kowalencyjne lub niekowalencyjne na powierzchni

ciała stałego

(szkło porowate, węgiel drzewny, wióry, Al

2

O

3

, silikażel,

celuloza i pochodne, bawełna , nylon, pianki, gąbki)
wady: możliwość desorpcji

zamykanie w siatce polimeru: unieruchomienie wewnątrz żeli

(

polisacharydy: alginiany, karaginiany, agar, żel poliakryloamidowy

)

wady: możliwość możliwa znaczna utrata aktywności, duże opory przepływu

substratów)

zamykanie wewnątrz półprzepuszczalnych membran:

membrany kolagenowe lub z octanu celulozy

tworzenie aglomeratów:

dodatek substancji precypitujących (np. polielektrolitów)

Metody prowadzenia procesów biochemicznych

HODOWLA Z UNIERUCHOMIONYM MATERIAŁEM BIOLOGICZNYM:

wpływ unieruchomienia na materiał biologiczny

możliwość dezaktywacji enzymów poprzez:
•zatrucie (np. monomerami)
•utworzenie konfiguracji nieaktywnej
•związanie z nośnikiem w pozycji w której niedostępne jest centrum aktywne
•uszkodzenia mechaniczne, działanie naprężeń
•brak odpowiednio szybkiej wymiany pomiędzy powierzchnią
unieruchomionego materiału a rdzeniem cieczy (możliwe np. różnice pH,
odprowadzanie metabolitów)

ZASTOSOWANIE:
•w aparatach o działaniu okresowym lub, głównie, w ciągłym

Metody prowadzenia procesów biochemicznych

HODOWLA W PODŁOŻU STAŁYM:

grzyby strzępkowe lub promieniowce tworzą grzybnię

zastosowanie:
produkcja preparatów enzymatycznych
produkcja przypraw (np. sos sojowy)

zalety:
•prostota aparatury,
•możliwość uzyskania wyższych stężeń produktów
•wykorzystywanie surowców odpadowych

wady:
trudność w utrzymaniu jednolitych warunków wzrostu
możliwość przegrzewania podłoża
występowanie gradientów temperatury

biotransformacje przez rosnące komórki:

zaszczepianie komórek na odpowiednie podłoże + dodatek substratu

biotransformacje przez komórki w fazie stacjonarnej:

namnażanie komórek, wirowanie, dodawanie buforu z substratem

(zalety: niezależność wzrostu i biotransformacji, brak efektu hamującego substratu,
możliwość regulacji stężenia biomasy, łatwiejsze oczyszczanie produktów)

biotransformacje przez zarodniki:

wytworzenie zarodników, oddzielenie od grzybni, dodanie do roztworu
substratu

(zalety: nie jest konieczne aseptyczne prowadzenie procesu biotransformacji)

biotransformacje przez unieruchomiony materiał biologiczny:

komórki drobnoustrojów, roślinne, zwierzęce, zarodniki, enzymy

(zalety: możliwe prowadzenie procesu w sposób ciągły)

PROCESY BIOTECHNOLOGICZNE

biotransformacje

reakcje enzymatyczne -
jedna ściśle określona
przemiana chemiczna
np. utlenianie, redukcja,
hydroliza itd.

hodowle

pożądany produkt powstaje
jako efekt pierwotnego lub
wtórnego metabolizmu

Kontrola procesu przemysłowego

aparatura pomiarowa i regulacyjna

1.

Kontrola parametrów fizycznych

temperatura
ciśnienie
moc mieszania
powstawanie piany
natężenie przepływu gazów i cieczy
zmętnienie roztworu
lepkość

2.

Kontrola parametrów chemicznych

pH
potencjał redoks
stężenie rozpuszczonych gazów O

2

, CO

2

,

stężenie O2 w gazach wylotowych
pociom prekursora oraz szybkość jego dozowania
poziom węglowodanów (węgiel) i szybkość dozowania
poziom białka (azot) i szybkość dozowania
poziom jonów mineralnych (Mg

2+

, K

+

, Ca

2+

, Na

+

, Fe

3+

, SO

4

2-

, PO

4

3-

)

RNA
DNA
NAD, NADH
ATP, ADP, AMP

przyrządy do pomiarów parametrów środowiska fermentacyjnego

Kontrola procesu przemysłowego

aparatura pomiarowa i regulacyjna

temperatura:

termometry rtęciowe, termopary, termistory,
termometry oporowe
ciśnienie:
manometry membranowe,

moc mieszania:

watomierze podłączone do silnika (pomiar
przybliżony),
czujniki tensometryczne, dynamometry
torsyjne

powstawanie piany:

czujniki elektrochemiczne
mechaniczne łamacze piany

(odśrodkowe

urządzenia odpieniające)

dodawanie środków przeciwpieniących

(emulsje

silikonowe, oleje mineralne)

Kontrola procesu przemysłowego

aparatura pomiarowa i regulacyjna

natężenie przepływu cieczy i gazu:

rotametry (położenie pływaka sprzężone z
układem regulującym - przetworniki
pojemnościowe lub indukcyjne)

zmętnienie:

pomiary turbidymetryczne, spektrofotometryczne

(problem wyboru próbek reprezentatywnych, problem
osadzanie sie skupisk kultur bakteryjnych na czujniku)

lepkość:

lepkościomierze

(trudności: mierzona lepkość zależy od rodzaju metody)

konduktometryczne wskaźniki poziomu:

Kontrola procesu przemysłowego

aparatura pomiarowa i regulacyjna

pH:

elektrody odporne na warunki sterylizacji (160

o

C),

osłony zabezpieczające,

problem czystości czujnika w czasie długotrwałego stosowania

potencjał redoks:

elektroda platynowa
regulacja przez dostarczanie gazowych N

2

, O

2

lub cystyny, kw.

askorbinowego, tioglikolanu sodu,

Kontrola procesu przemysłowego

aparatura pomiarowa i regulacyjna

stężenie rozpuszczonego O

2

:

odporny na sterylizację czujnik O

2

- polarograficzny Beckmana (katoda: Au , anoda: Ag)
- woltametryczny Mackeretha (katoda: Ag, anoda: Pb)

katoda: O

2

+ 2H

2

O + 4e

-

4OH

-

anoda: metal

metal

n+

+ ne

-

Kontrola procesu przemysłowego

aparatura pomiarowa i regulacyjna

skład gazu wylotowego:

analizatory CO

2

(podczerwień)

analizatory O

2

(czujniki paramagnetyczne, adsorpcja w wodzie)

metabolity pośrednie:

układ NAD/NADH

2

metoda fluorymetryczna

układ ATP-ADP-AMP

analiza enzymatyczna i fluorymetryczna

inne pomiary:
C, N, P, S, Mg, K, Ca, Na, Fe, regulatory wzrostu, prekursory

elektrody enzymatyczne (glukoza, mocznik)
elektrody jonoselektywne (NH

4

+

, Mg

2+

, Na

+

, Ca

2+

, PO

4

3-

itp)

pomiary stopnia zmutowania, monitorowanie infekcji

problem:
konieczność sterylizacji czujników
osadzanie się kultur bakteryjnych na czujnikach

Kontrola procesu przemysłowego

aparatura pomiarowa i regulacyjna

złożone układy pomiarowe umożliwiają bilansowanie:

pomiar

informacja

pH

tworzenie się kwaśnych produktów

O

2

rozpuszczony

szybkość przenikania tlenu

O

2

w gazie wylotowym

natężenie przepływu gazu

szybkość pobierania tlenu

CO

2

w gazie wylotowym

natężenie przepływu gazu

szybkość wydzielania CO

2

szybkość poboru O

2

szybkość wydzielania CO

2

współczynnik oddechowy

poziom cukru
szybkość dozowania cukru
szybkość wydzielania CO

2

wydajność i gęstość biomasy

współczynnik oddechowy - miara jednostkowej aktywności komórkowej w bioreaktorze

Kontrola procesu przemysłowego

aparatura pomiarowa i regulacyjna

regulacja bezpośrednia -
ciągła obserwacja środowiska fermentacyjnego
i reagowanie na jego zmiany
(np. oksystaty - gdy tlen jest czynnikiem
kontrolującym szybkość wzrostu, regulacja
dostarczania i dozowania tlenu utrzymuje
ustalone i pożądane warunki pracy bioreaktora)

regulacja pośrednia -
stabilizacja dopływu mediów oraz objętości
zawiesiny w aparacie
(chemostaty - reaktory z regulowanym
dopływem substratów lecz nie monitorujące
parametrów wewnętrznych)