Elementy Biotechnologii

WYKŁAD NR 2

Uniwersytet Warszawski
Wydział Chemii

Warszawa, 13.03.2005

Reakcje katalityczne i enzymatyczne.

Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych.

Kinetyka złożonych reakcji enzymatycznych.

Inhibicja enzymów.

Kinetyka układów oscylujących.

Biochemia, fizjologia i termodynamika wzrostu i metabolizmu

drobnoustrojów.

Wydajność i selektywność mikroorganizmów i enzymów.

ELEMENTY BIOTECHNOLOGII

WYKŁAD NR 2

literatura wykorzystana do wykładu
P. Kafarski, B. Lejczak: Chemia Bioorganiczna, PWN, Warszawa 1994
Aiba, Humprey, Millis: Inżynieria biochemiczna, WNT Warszawa 1977
J. Kączkowski: Podstawy Biochemii, rozdz. 5, WNT, Warszawa
Atkins: Chemia Fizyczna

definicje i pojęcia do przypomnienia

• szybkość reakcji chemicznej
• rzędowość reakcji
• cząsteczkowość reakcji
• wpływ temperatury na szybkość reakcji chemicznych
• energia aktywacji
• katalizator

Reakcje katalityczne i enzymatyczne

szybkość reakcji chemicznej

A P

v = -

=

d[A]

d[P]

d

τ

d

τ

v =

1 d[i]

ν

i

d

τ

A + 2B P

ν

A

= -1

ν

A

= -2

ν

p

= 1

reakcje I i II rzędu

rzędowość względem poszczególnych substratów i rzędowość całkowita

reakcje zerowego rzędu

rzędowość reakcji chemicznej

cząsteczkowość reakcji

Podstawy kinetyki chemicznej

wpływ temperatury na szybkość reakcji chemicznych

Podstawy kinetyki chemicznej

• teoria zderzeń aktywnych

• teoria stanu przejściowego

v = k(T) * f(c)

ln k

1/T

nachylenie
= -E

a

/R

równanie Arrheniusa:

lnk = lnA – E

a

/RT

-E

a

/RT

k = A e

A – czynnik przedwykładniczy

Energia aktywacji

Reakcje katalityczne

droga alternatywna:

• zbliżanie się cząsteczek do siebie

• rozrywanie wiązań

-E

a

/RT

k = A e

energia

współrzędna reakcji

substraty

produkty

E

a1

E

a2

Q

energia

współrzędna reakcji

substraty

produkty

E

a1

E

a2

Q

katalizator

• obniżenie E

a

• wzrost szybkości reakcji

katalizatory:

• homogeniczne

• heterogeniczne

Reakcje katalityczne

katalizatory homogeniczne

kataliza homogeniczna - jednofazowa

Substrat

S

Produkt

P

katalizator

X

S + X SX

SX P + X

k

1

k

-1

k

2

K= =

k

1

[SX]

k

-1

[S][X]

[X] = [X]

o

-[SX]

=

k

1

[SX]

k

-1

[S] ([X]

o

-[SX])

[SX]= [X]

o

k

1

[S]

k

1

[S] + k

-1

stężenie kompleksu przejściowego

= k

2

[SX] = k

2

[X]

o

k

1

[S]

k

1

[S] + k

-1

d[P]

d

τ

gdy k

2

< k

1

szybkość reakcji jest zależna
od szybkości rozpadu kompleksu przejściowego:

Reakcje katalityczne

katalizatory homogeniczne

Substrat

S

Produkt

P

katalizator

X

S + X SX

SX P + X

k

1

k

-1

k

2

gdy k

2

> k

1

szybkość reakcji jest zależna
od szybkości powstawania kompleksu przejściowego:

= k

2

[SX] = k

2

[X]

o

k

1

[S]

k

1

[S] + k

-1

+ k

2

d[P]

d

τ

stężenie kompleksu przejściowego

[SX] =

k

1

[S]

k

1

[S] + k

-1

+ k

2

= k

1

[S]([X]

o

-[SX]) – k

-1

[SX] – k

2

[SX] =0

d[SX]

d

τ

stan quasi-stacjonarny:

Reakcje katalityczne

przemysłowe katalizatory heterogeniczne

Substrat

S

Produkt

P

katalizator

X

ETAPY KATALIZY WIELOFAZOWEJ

•

dyfuzja S do X

•

chemisorpcja S na powierzchni X

•

przegrupowanie atomów i utworzenie P

•

desorpcja P z powierzchni X

•

dyfuzja P z powierzchni X

istotne: prędkości przepływu reagentów rozdrobnienie katalizatora

istotne: te same czynniki jak w etapie pierwszym

istotne: te same czynniki jak w etapie pierwszym

istotne: centra aktywne, temperatura chemisorpcji, rozwinięcie powierzchni

Reakcje katalityczne

przemysłowe katalizatory heterogeniczne

Substrat

S

Produkt

P

katalizator

X

AKTYWNOŚĆ KATALIZATORA

•

skład katalizatora

•

wielkość i charakter powierzchni

•

temperatura

•

odporność na uszkodzenia mechaniczne i termiczne

•

odporność na zatrucie

zatrucie odwracalne i nieodwracalne

chwilowa dezaktywacja
ustępuje po usunięciu
zanieczyszczeń
z przestrzeni reakcyjnej

trwała dezaktywacja
ustępuje po regeneracji;
czasem trzeba całkowicie
wymienić katalizator na nowy

trucizną katalizatora jest
substancja bardziej aktywna niż
reagent właściwy.
najczęściej związki tlenowców i
azotowców
(N, P, As, O, S, Se, Te)

Reakcje katalityczne

przemysłowe katalizatory heterogeniczne

Cechy idealnego katalizatora przemysłowego

•

aktywny

•

selektywny

•

termoodporny

•

odporny na zatrucie

•

wytrzymały mechanicznie

•

łatwy do regeneracji

•

tani

Rodzaje katalizatorów kontaktowych
czyste substancje: Pt, Ni, Fe

2

O

3

, Al

2

0

3

, AlCl

3

, V

2

O

5

, Cr

2

O

3

, WO

3

i inne

częściej są to mieszaniny związków

Reakcje katalityczne

przemysłowe katalizatory heterogeniczne

katalizator przemysłowy:
właściwy katalizator + aktywator + nośnik

zwiększa aktywność katalizatora
np. zwiększa liczbę centrów aktywnych,
polepsza termoodporność,
tworzy połączenia o wyjątkowej aktywności

zwiększa powierzchnię i wytrzymałość
katalizatora
np. krzemionka, wyroby szamotowe,
siarczan baru

katalizatory szkieletowe -
nikiel Raneya

masa cząsteczkowa:

od 9000 (acylofosfataza) - 60 jednostek aminokwasowych

do 155 000 (podjednostka

β polimerazy RNA) (1000 reszt aminokwasowych)

ENZYMY
(biokatalizatory, fermenty, zaczyny)

BIAŁKA PROSTE LUB ZŁOŻONE BĘDĄCE KATALIZATORAMI
REAKCJI CHEMICZNYCH ZACHODZĄCYCH W UKŁADACH
BIOLOGICZNYCH

ENZYM ZŁOŻONY = część białkowa + grupa prostetyczna (niebiałkowa)

apoenzym + koenzym

Reakcje enzymatyczne

spośród wielu substancji tylko
nieliczne (zazwyczaj jedna)
ulega reakcji katalizowanej
przez enzym

CENTRUM AKTYWNE

miejsce zawierające odpowiednio rozmieszczone grupy funkcyjne
biorące bezpośredni udział w procesie katalizy

specyficzność

substratowa

typu reakcji

spośród wielu reakcji zachodzi
tylko jedna, katalizowana przez
enzym

budowa centrum aktywnego:
kształt:

pofałdowanie łańcucha polipeptydowego

grupy funkcyjne:

reszty boczne aminokwasów, kationy Zn, Cu, Mg, Mn, Co, Mo, Fe, Ni

dinukleotyd nikotynamidoadeninowy

N

NH

2

O

R

N

NH

2

O

R

+2e + 2H

H

H

NAD

+

NADH

O

H

H

OH

H

OH

H

P

HO

O

O

P

O

HO

O

O

O

H

H

OH

H

OH

H

N

N

N

N

NH

2

NADPH = fosforan NADH

O

H

H

OH

H

OH

H

P

HO

O

O

P

O

HO

O

O

O

H

H

OPO

2

2-

H

OH

H

N

N

N

N

NH

2

nikot

N

NH

2

O

R

N

NH

2

O

R

+2e + 2H

H

H

NAD

+

NADH

Przykłady reakcji przebiegających z udziałem
nukleotydów nikotynoadeninowych

C-OH

C O + 2H

+

+ 2e

-

dehydrogenaza alkoholowa
dehydrogenaza mleczanowa
dehydrogenaza jabłczanowa

C-ONH

2

C O + NH

4

+

+ H

+

+ 2e

-

dehydrogenaza glutaminowa

C-CH

2

-COOH

C-CH

2

-COOH + 2H

+

+ 2e

-

O

OH

dehydrogenaza izocytrynianowa

C-CH

3

+ CO

2

O

dehydrogenaza
6-fosfoglukonianowa

+ 2H

+

+ 2e

-

H C + H

2

O

O

dehydrogenaza aldehydowa

HO C

O

+ 2H

+

+ 2e

-

C C

H H

dehydrogenaza aldehydowa

C C

model klucza i zamka

model indukowanego dopasowania się enzymu

model indukowanego dopasowania się enzymu na przykładzie
heksokinazy

specyficzność enzymów:
1. Swoistość kierunku działania- zdolność enzymu do katalizowania
tylko jednej z wielu termodynamicznie możliwych reakcji
2. Specyficzność substratowa -możliwość wyboru tylko jednego
substratu (specyficzność absolutna) lub grupy podobnych
strukturalnie substratów (specyficzność grupowa)
3. Specyficzność przestrzenna (stereochemiczna)

KLASY ENZYMÓW

1. Oxydoreduktazy

(reakcje redoks)

dehydrogenazy, oksydazy, reduktazy, peroksydazy,
katalazy, oksygenazy, hydroksylazy

transaldolaza, transketolaza, acylo-, metylo-,
glukonylo- i fosforylo transferazy, kinazy, fosfomutazy

esterazy, glikozydazy, peptydazy, tiolazy, fosfolipazy,
amidazy, dezamidazy

syntetazy, karboksylazy

dekarboksylazy, aldolazy, ketolazy, hydratazy,
dehydratazy, syntazy, liazy

racemazy, epimerazy, mutazy

6. Ligazy

(reakcje łączenia dwu cząsteczek)

2. Transferazy

(przenoszenie grup funkcyjnych)

3. Hydrolazy

(hydroliza)

4. Liazy

(dodanie / usunięcie grup - tworzenie podwójnego
wiązania)

5. Izomerazy

(przekształcenia wewnątrzcząsteczkowe)

k

-1

+ k

2

[S][E]

k

1

[ES]

= = K

M

stała Michaelisa

Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych

[E] = [E]

o

-[SE]

k

1

[S]([E]

o

-[SE]) = k

-1

[SE] + k

2

[SE]=(k

-1

+ k

2

)[SE]

stan stacjonarny

jeśli [S] >> [E]

[S][E] [S]([E]

o

-[SE])

[ES] [ES]

K

M

= =

[E]

o

K

M

[ES] [S]

= +1 = V

max

maksymalna szybkość reakcji

V

max

= k

2

[E]

o

Substrat

S

Produkt

P

enzym

E

S + E SE

P + E

k

1

k

-1

k

2

model Michealisa-Menten

1/K

M

– powinowactwo enzymu do substratu

wartości K

M

dla wybranych enzymów oddechowych metabolizujących cukry

maltaza

ok 10

-1

mol /dm

3

sacharaza

ok 10

-2

mol /dm

3

mleczan dehydrogenazy

ok 10

-4

mol /dm

3

Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych

V

max

/2

V

max

[S]

=

V

max

d[P]

d

τ

1+

K

M

[S]

gdy S

8

to: v

V

max

v =

gdy v = 0.5 V

max

to [S]=K

M

K

M

Substrat

S

Produkt

P

enzym

E

S + E SE

P + E

k

1

k

-1

k

2

model Michealisa-Menten

Wykres Lineweavera - Burka

Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych

=

K

M

1 1

V

max

[S] V

max

+

1
v

Substrat

S

Produkt

P

enzym

E

S + E SE

P + E

k

1

k

-1

k

2

model Michealisa-Menten

1/V

max

1/v

1/[S]

-1/K

M

możliwość jednoznacznego wyznaczenia K

M

i V

max

Kinetyka złożonych reakcji enzymatycznych

Substrat

S

Produkt

P

enzym

E

S + E SE

P + E’

k

1

k

-1

k

2

reakcja właściwa

regeneracja formy
pierwotnej

E’ + a E-b

E + b

k

3

k

4

dla enzymatycznego utleniania glukozy przez oksydazę glukozową:
S = glukoza, P =

δ-lakton, a =O

2

, b = H

2

O

2

,

E i E’ = postać utleniona i zredukowana enzymu

S + E (SE)

1

(SE)

2

P + E

k

1

k

-1

k

2

k

3

inny przykład:

Inhibicja enzymów

E

E + Inh E-Inh

+S

+Inhibitor

EI

inhibicja kompetytywna (współzawodnicza)

ES

P + E

inhibicja niekompetytywna (niewspółzawodnicza)

E

+S

+Inhibitor

EI

ES

E-I-S

P + E

WPŁYW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

•

kataliza przez zbliżenie reagujących cząsteczek

•

kataliza przez utworzenie kowalencyjnych produktów
pośrednich z enzymem

•

kataliza kwasowo-zasadowa

•

kataliza przez deformację cząsteczki substratu

•

kataliza jonami metali

aktywność enzymu
IU - International Units
lub

µmol powstającego produktu na minutę

w 30

o

C

aktywność molekularna- liczba obrotów
liczba moli substratu reagująca w ciągu
1 minuty z 1 molem centrów aktywnych
w 30

o

C.

Wpływ czasu reakcji na aktywność enzymu

[P]

czas reakcji

V

pocz

WPŁYW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

Wpływ temperatury na aktywność enzymu

temperatura maksymalna

temperatura optymalna

temperatura

V

reakcji

sz

ybk

oś

ć r

ea

kc

ji c

he

mi

cz

ne

j

sta

biln

ość

bia

łka

WPŁYW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

•

wpływ pH

V

max

pH optymalne

pH

1. dla skrajnych wartości

pH zachodzi denaturacja

2. protonowanie/deprotonowanie
centrum aktywnego

WPŁYW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

•

wpływ stężenia substratu

V

max

[S]

c

[S]

kataliza
nieefektywna

kataliza
efektywna

krytyczne stężenie substratu

szybkość
wzrostu
bakterii

stężenie substratu

S

1

S

2

Zooglera ramigera

Sphaerotilus natans

niższe stężenia substratu:
bakteria z enzymami o wyższym K

s

(niższym K

M

) wzrasta szybciej (ma

wyższe powinowactwo do substratu)
dla wyższych stężeń substratu: K

M

nie jest decyduje o szybkości wzrostu

µ

max

[S]

K

s

+[S]

µ=

µ - właściwa szybkość

wzrostu

µ

max

- maksymalna

właściwa
szybkość wzrostu

K

s

- stała równowagi

enzym-substrat

Równanie Monoda

Biochemia i fizjologia wzrostu mikroorganizmów

MIKROORGANIZMY

•

bakterie

•

grzyby (np. drożdże, Aspergillus)

•

glony jednokomórkowe

•

pierwotniaki

metabolizm - wszelkie reakcje zachodzące w komórce

KATABOLIZM
duże i skomplikowane
cząsteczki są przekształcane na
mniejsze i prostsze
(pozyskiwana jest energia)

ANABOLIZM
mniejsze i prostsze cząsteczki
są przekształcane na większe i
skomplikowane
(energia jest zużywana)

ANABOLIZM:
powstają zarówno główne składniki komórki:

(np. białka, kwasy nukleinowe, cukry, lipidy)

oraz ich prekursory i inne produkty przejściowe:

(np. aminokwasy, puryna, pirymidyny,
kwasy tłuszczowe, cukty, fosforany)

efekt energetyczny - endotermiczny
procesy anaboliczne muszą wymagają obecności reduktorów

Skąd pochodzi energia potrzebna do przebiegu procesów anabolicznych?

z procesów KATABOLICZNYCH (np. utlenianie węglowodanów do CO2)

energetyka katabolizmu

energetyka katabolizmu

adenozyna

dwufosforan adenozyny (ADP)

trójfosforan adenozyny (ATP)

O

N

H

H

OH

H

OH

H

P

O

O

P

O

HO

O

O

O

P

O

O

O

N

N

N

NH

2

„wiązanie o dużej energii”

P

OH

O

C

OH

OH

O

+ ATP

C

+ ADP

ATP ADP AMP

(monofosforan)

(rzadziej)

warunki aerobowe
oksydatywna fosforylacja

N

NH

2

O

R

N

NH

2

O

R

+2e + 2H

H

H

NAD

+

NADH

adenozyna

NADPH + 3ADP + 3(nieorg. fosfor) + 1/2 O

2

NADP

+

+ 3ATP + H

2

O

NADH + 3ADP + 3(nieorg. fosfor) + 1/2 O

2

NAD

+

+ 3ATP + H

2

O

NADH - dinukleotyd nikotynamidoadeninowy
NADPH - fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego

warunki anaerobowe

oksydatywna fosforylacja nie może zachodzić

fosforylacja na poziomie substratu (substrate level phosphorylation)
znacznie większa ilość substratu musi być zużyta

NADH + X

NADP

+

+ XH

2

przykłady:

kwas mlekowy w mięśniach po dużym wysiłku fizycznym
kwas mlekowy z bakterii mlekowych
glicelor produkowany przez drożdże gdy blokowana jest synteza etanolu
wytwarzanie kwasu mrówkowego, etanolu, 2,3-butanodiolu, butanolu, acetonu, kwasu propionowego

fakultatywne (warunkowe)
beztlenowce -

dostosowują

sie zarówno do warunków
tlenowych jak i beztlenowych

GLUKOZA

drożdże beztlenowe

drożdże tlenowe

powstają:
CO

2

, H

2

O,

nowe drożdże (dużo)

powstają:
niewiele energii,
substancje redukujące
nowe drożdże (niewiele)

METABOLIZM

tlenowy

(aerobowy)

źródło węgla CO

2

utlenianie,

wydajne wydzielanie energii

beztlenowy

(anaerobowy)

dysproporcjonowanie

mniejsza wydajność uzysku energii

O

2

proces

metaboliczny

biomasa

utleniacz

reduktor

C

s

H

t

O

u

N

v

P

w

S

x

K

y

Mg

z

substrat węglowy
C

m

H

n

O

p

N

q

źródłó azotu
NH

3

K

+

/PO

4

3-

/Mg

2+

/SO

4

2-

etc.

zredukowany
metabolit węglowy,

H

2

O

O2,
utleniony
metabolit węglowy

METABOLIZM

pierwotny

tropofaza

podczas zbalansowanego wzrostu

(dostarczany nadmiar pożywienia)

wtórny

idiofaza

gdy nie ma dostatecznej ilości

pożywienia

substancje wytworzone podczas
idiofazy z acetylokoenzymuA:
cytryniany, kwasy tłuszczowe,
poliketydy, chinony, terpeny,

sterole i inne.

czas

metabolit

pierwotny

metabolit

wtórny

biomasa

(wzrost

komorki)

tropofaza

idiofaza

spadek tempa wzrostu

WYDAJNOŚĆ WZROSTU MIKROORGANIZMÓW

MOLOWA WYDAJNOŚĆ WZROSTU (Y

s

)

wydajność suchej masy komórek na mol substratu

WSPÓŁCZYNNIK KONWERSJI WĘGLA (WKC)

wydajność suchej masy komórek na 1 gram węgla
zawartego w substracie.

substrat

organizm

Ys

WKC

metan

Methylomonas sp.

17.5

1.46

metanol

Methylomonas sp.

16.6

1.38

etanol

Candilla utilis

31.2

1.30

glicerol

Klebsiella pneumoniae

31.2

1.30

glukoza

Escherichia coli

aerobowo

95.0

1.32

anaerobowo

25.8

0.36

Saccharomyces cerevisiae
aerobowo

90

1.26

anaerobowo

21

0.29

heksadekan

Yarrowia (Candida) lypolitica

203

1.06

SZYBKOŚĆ WZROSTU MIKROORGANIZMÓW

zależy od:

• rodzaju źródła węgla
• ścieżek metabolicznych
• obecności innych substratów
• wymagań energetycznych do asymilacji np. azotu
• wydajności tworzenia ATP
• obecności inhibitorów
• obecności jonów
• transportu substratów i produktów
• stanu fizjologicznego mikroorganizmu

SZYBKOŚĆ WZROSTU MIKROORGANIZMÓW - UKŁADY OSCYLUJĄCE

zjawiska oscylacyjne o podłożu enzymatycznym - sprzężenia zwrotne

grupa
amino
kwasowa

enzym

metabolit

substrat

metabolit

akty

wac

ja

rep

res

ja

regulacja genetyczno - metaboliczna

substrat

A

1

A

2

aktywacja wsteczna

aktywacja

substrat

A

1

A

2

aktywacja wsteczna

inhibicja

np. wolno tłumione oscylacje
zawartości NADH

2

w zawiesinie

komórek drożdzy w środowisku
beztlenowym

zwiększenie strumienia glukozy
przepływającej przez błonę komórkową

maleją stężenia fosforanów glukozy

ADP aktywuje fosfofruktokinazę

maleje stężenie ADP