Elementy Biotechnologii
WYKŁAD NR 2
Uniwersytet Warszawski
Wydział Chemii
Warszawa, 13.03.2005
Elementy Biotechnologii
WYKŁAD NR 2
Uniwersytet Warszawski
Wydział Chemii
Warszawa, 13.03.2005
Reakcje katalityczne i enzymatyczne.
Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych.
Kinetyka złożonych reakcji enzymatycznych.
Inhibicja enzymów.
Kinetyka układów oscylujących.
Biochemia, fizjologia i termodynamika wzrostu i metabolizmu
drobnoustrojów.
Wydajność i selektywność mikroorganizmów i enzymów.
ELEMENTY BIOTECHNOLOGII
WYKŁAD NR 2
literatura wykorzystana do wykładu
P. Kafarski, B. Lejczak: Chemia Bioorganiczna, PWN, Warszawa 1994
Aiba, Humprey, Millis: Inżynieria biochemiczna, WNT Warszawa 1977
J. Kączkowski: Podstawy Biochemii, rozdz. 5, WNT, Warszawa
Atkins: Chemia Fizyczna
definicje i pojęcia do przypomnienia
• szybkość reakcji chemicznej
• rzędowość reakcji
• cząsteczkowość reakcji
• wpływ temperatury na szybkość reakcji chemicznych
• energia aktywacji
• katalizator
Reakcje katalityczne i enzymatyczne
szybkość reakcji chemicznej
A P
v = -
=
d[A]
d[P]
d
τ
d
τ
v =
1 d[i]
ν
i
d
τ
A + 2B P
ν
A
= -1
ν
A
= -2
ν
p
= 1
reakcje I i II rzędu
rzędowość względem poszczególnych substratów i rzędowość całkowita
reakcje zerowego rzędu
rzędowość reakcji chemicznej
cząsteczkowość reakcji
Podstawy kinetyki chemicznej
wpływ temperatury na szybkość reakcji chemicznych
Podstawy kinetyki chemicznej
• teoria zderzeń aktywnych
• teoria stanu przejściowego
v = k(T) * f(c)
ln k
1/T
nachylenie
= -E
a
/R
równanie Arrheniusa:
lnk = lnA – E
a
/RT
-E
a
/RT
k = A e
A – czynnik przedwykładniczy
Energia aktywacji
Reakcje katalityczne
droga alternatywna:
• zbliżanie się cząsteczek do siebie
• rozrywanie wiązań
-E
a
/RT
k = A e
energia
współrzędna reakcji
substraty
produkty
E
a1
E
a2
Q
energia
współrzędna reakcji
substraty
produkty
E
a1
E
a2
Q
katalizator
• obniżenie E
a
• wzrost szybkości reakcji
katalizatory:
• homogeniczne
• heterogeniczne
Reakcje katalityczne
katalizatory homogeniczne
kataliza homogeniczna - jednofazowa
Substrat
S
Produkt
P
katalizator
X
S + X SX
SX P + X
k
1
k
-1
k
2
K= =
k
1
[SX]
k
-1
[S][X]
[X] = [X]
o
-[SX]
=
k
1
[SX]
k
-1
[S] ([X]
o
-[SX])
[SX]= [X]
o
k
1
[S]
k
1
[S] + k
-1
stężenie kompleksu przejściowego
= k
2
[SX] = k
2
[X]
o
k
1
[S]
k
1
[S] + k
-1
d[P]
d
τ
gdy k
2
< k
1
szybkość reakcji jest zależna
od szybkości rozpadu kompleksu przejściowego:
Reakcje katalityczne
katalizatory homogeniczne
Substrat
S
Produkt
P
katalizator
X
S + X SX
SX P + X
k
1
k
-1
k
2
gdy k
2
> k
1
szybkość reakcji jest zależna
od szybkości powstawania kompleksu przejściowego:
= k
2
[SX] = k
2
[X]
o
k
1
[S]
k
1
[S] + k
-1
+ k
2
d[P]
d
τ
stężenie kompleksu przejściowego
[SX] =
k
1
[S]
k
1
[S] + k
-1
+ k
2
= k
1
[S]([X]
o
-[SX]) – k
-1
[SX] – k
2
[SX] =0
d[SX]
d
τ
stan quasi-stacjonarny:
Reakcje katalityczne
przemysłowe katalizatory heterogeniczne
Substrat
S
Produkt
P
katalizator
X
ETAPY KATALIZY WIELOFAZOWEJ
•
dyfuzja S do X
•
chemisorpcja S na powierzchni X
•
przegrupowanie atomów i utworzenie P
•
desorpcja P z powierzchni X
•
dyfuzja P z powierzchni X
istotne: prędkości przepływu reagentów rozdrobnienie katalizatora
istotne: te same czynniki jak w etapie pierwszym
istotne: te same czynniki jak w etapie pierwszym
istotne: centra aktywne, temperatura chemisorpcji, rozwinięcie powierzchni
Reakcje katalityczne
przemysłowe katalizatory heterogeniczne
Substrat
S
Produkt
P
katalizator
X
AKTYWNOŚĆ KATALIZATORA
•
skład katalizatora
•
wielkość i charakter powierzchni
•
temperatura
•
odporność na uszkodzenia mechaniczne i termiczne
•
odporność na zatrucie
zatrucie odwracalne i nieodwracalne
chwilowa dezaktywacja
ustępuje po usunięciu
zanieczyszczeń
z przestrzeni reakcyjnej
trwała dezaktywacja
ustępuje po regeneracji;
czasem trzeba całkowicie
wymienić katalizator na nowy
trucizną katalizatora jest
substancja bardziej aktywna niż
reagent właściwy.
najczęściej związki tlenowców i
azotowców
(N, P, As, O, S, Se, Te)
Reakcje katalityczne
przemysłowe katalizatory heterogeniczne
Cechy idealnego katalizatora przemysłowego
•
aktywny
•
selektywny
•
termoodporny
•
odporny na zatrucie
•
wytrzymały mechanicznie
•
łatwy do regeneracji
•
tani
Rodzaje katalizatorów kontaktowych
czyste substancje: Pt, Ni, Fe
2
O
3
, Al
2
0
3
, AlCl
3
, V
2
O
5
, Cr
2
O
3
, WO
3
i inne
częściej są to mieszaniny związków
Reakcje katalityczne
przemysłowe katalizatory heterogeniczne
katalizator przemysłowy:
właściwy katalizator + aktywator + nośnik
zwiększa aktywność katalizatora
np. zwiększa liczbę centrów aktywnych,
polepsza termoodporność,
tworzy połączenia o wyjątkowej aktywności
zwiększa powierzchnię i wytrzymałość
katalizatora
np. krzemionka, wyroby szamotowe,
siarczan baru
katalizatory szkieletowe -
nikiel Raneya
masa cząsteczkowa:
od 9000 (acylofosfataza) - 60 jednostek aminokwasowych
do 155 000 (podjednostka
β polimerazy RNA) (1000 reszt aminokwasowych)
ENZYMY
(biokatalizatory, fermenty, zaczyny)
BIAŁKA PROSTE LUB ZŁOŻONE BĘDĄCE KATALIZATORAMI
REAKCJI CHEMICZNYCH ZACHODZĄCYCH W UKŁADACH
BIOLOGICZNYCH
ENZYM ZŁOŻONY = część białkowa + grupa prostetyczna (niebiałkowa)
apoenzym + koenzym
Reakcje enzymatyczne
spośród wielu substancji tylko
nieliczne (zazwyczaj jedna)
ulega reakcji katalizowanej
przez enzym
CENTRUM AKTYWNE
miejsce zawierające odpowiednio rozmieszczone grupy funkcyjne
biorące bezpośredni udział w procesie katalizy
specyficzność
substratowa
typu reakcji
spośród wielu reakcji zachodzi
tylko jedna, katalizowana przez
enzym
budowa centrum aktywnego:
kształt:
pofałdowanie łańcucha polipeptydowego
grupy funkcyjne:
reszty boczne aminokwasów, kationy Zn, Cu, Mg, Mn, Co, Mo, Fe, Ni
dinukleotyd nikotynamidoadeninowy
N
NH
2
O
R
N
NH
2
O
R
+2e + 2H
H
H
NAD
+
NADH
O
H
H
OH
H
OH
H
P
HO
O
O
P
O
HO
O
O
O
H
H
OH
H
OH
H
N
N
N
N
NH
2
NADPH = fosforan NADH
O
H
H
OH
H
OH
H
P
HO
O
O
P
O
HO
O
O
O
H
H
OPO
2
2-
H
OH
H
N
N
N
N
NH
2
nikot
N
NH
2
O
R
N
NH
2
O
R
+2e + 2H
H
H
NAD
+
NADH
Przykłady reakcji przebiegających z udziałem
nukleotydów nikotynoadeninowych
C-OH
C O + 2H
+
+ 2e
-
dehydrogenaza alkoholowa
dehydrogenaza mleczanowa
dehydrogenaza jabłczanowa
C-ONH
2
C O + NH
4
+
+ H
+
+ 2e
-
dehydrogenaza glutaminowa
C-CH
2
-COOH
C-CH
2
-COOH + 2H
+
+ 2e
-
O
OH
dehydrogenaza izocytrynianowa
C-CH
3
+ CO
2
O
dehydrogenaza
6-fosfoglukonianowa
+ 2H
+
+ 2e
-
H C + H
2
O
O
dehydrogenaza aldehydowa
HO C
O
+ 2H
+
+ 2e
-
C C
H H
dehydrogenaza aldehydowa
C C
model klucza i zamka
model indukowanego dopasowania się enzymu
model indukowanego dopasowania się enzymu na przykładzie
heksokinazy
specyficzność enzymów:
1. Swoistość kierunku działania- zdolność enzymu do katalizowania
tylko jednej z wielu termodynamicznie możliwych reakcji
2. Specyficzność substratowa -możliwość wyboru tylko jednego
substratu (specyficzność absolutna) lub grupy podobnych
strukturalnie substratów (specyficzność grupowa)
3. Specyficzność przestrzenna (stereochemiczna)
KLASY ENZYMÓW
1. Oxydoreduktazy
(reakcje redoks)
dehydrogenazy, oksydazy, reduktazy, peroksydazy,
katalazy, oksygenazy, hydroksylazy
transaldolaza, transketolaza, acylo-, metylo-,
glukonylo- i fosforylo transferazy, kinazy, fosfomutazy
esterazy, glikozydazy, peptydazy, tiolazy, fosfolipazy,
amidazy, dezamidazy
syntetazy, karboksylazy
dekarboksylazy, aldolazy, ketolazy, hydratazy,
dehydratazy, syntazy, liazy
racemazy, epimerazy, mutazy
6. Ligazy
(reakcje łączenia dwu cząsteczek)
2. Transferazy
(przenoszenie grup funkcyjnych)
3. Hydrolazy
(hydroliza)
4. Liazy
(dodanie / usunięcie grup - tworzenie podwójnego
wiązania)
5. Izomerazy
(przekształcenia wewnątrzcząsteczkowe)
k
-1
+ k
2
[S][E]
k
1
[ES]
= = K
M
stała Michaelisa
Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych
[E] = [E]
o
-[SE]
k
1
[S]([E]
o
-[SE]) = k
-1
[SE] + k
2
[SE]=(k
-1
+ k
2
)[SE]
stan stacjonarny
jeśli [S] >> [E]
[S][E] [S]([E]
o
-[SE])
[ES] [ES]
K
M
= =
[E]
o
K
M
[ES] [S]
= +1 = V
max
maksymalna szybkość reakcji
V
max
= k
2
[E]
o
Substrat
S
Produkt
P
enzym
E
S + E SE
P + E
k
1
k
-1
k
2
model Michealisa-Menten
1/K
M
– powinowactwo enzymu do substratu
wartości K
M
dla wybranych enzymów oddechowych metabolizujących cukry
maltaza
ok 10
-1
mol /dm
3
sacharaza
ok 10
-2
mol /dm
3
mleczan dehydrogenazy
ok 10
-4
mol /dm
3
Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych
V
max
/2
V
max
[S]
=
V
max
d[P]
d
τ
1+
K
M
[S]
gdy S
8
to: v
V
max
v =
gdy v = 0.5 V
max
to [S]=K
M
K
M
Substrat
S
Produkt
P
enzym
E
S + E SE
P + E
k
1
k
-1
k
2
model Michealisa-Menten
Wykres Lineweavera - Burka
Kinetyka prostych reakcji enzymatycznych
=
K
M
1 1
V
max
[S] V
max
+
1
v
Substrat
S
Produkt
P
enzym
E
S + E SE
P + E
k
1
k
-1
k
2
model Michealisa-Menten
1/V
max
1/v
1/[S]
-1/K
M
możliwość jednoznacznego wyznaczenia K
M
i V
max
Kinetyka złożonych reakcji enzymatycznych
Substrat
S
Produkt
P
enzym
E
S + E SE
P + E’
k
1
k
-1
k
2
reakcja właściwa
regeneracja formy
pierwotnej
E’ + a E-b
E + b
k
3
k
4
dla enzymatycznego utleniania glukozy przez oksydazę glukozową:
S = glukoza, P =
δ-lakton, a =O
2
, b = H
2
O
2
,
E i E’ = postać utleniona i zredukowana enzymu
S + E (SE)
1
(SE)
2
P + E
k
1
k
-1
k
2
k
3
inny przykład:
Inhibicja enzymów
E
E + Inh E-Inh
+S
+Inhibitor
EI
inhibicja kompetytywna (współzawodnicza)
ES
P + E
inhibicja niekompetytywna (niewspółzawodnicza)
E
+S
+Inhibitor
EI
ES
E-I-S
P + E
WPŁYW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ
•
kataliza przez zbliżenie reagujących cząsteczek
•
kataliza przez utworzenie kowalencyjnych produktów
pośrednich z enzymem
•
kataliza kwasowo-zasadowa
•
kataliza przez deformację cząsteczki substratu
•
kataliza jonami metali
aktywność enzymu
IU - International Units
lub
µmol powstającego produktu na minutę
w 30
o
C
aktywność molekularna- liczba obrotów
liczba moli substratu reagująca w ciągu
1 minuty z 1 molem centrów aktywnych
w 30
o
C.
Wpływ czasu reakcji na aktywność enzymu
[P]
czas reakcji
V
pocz
WPŁYW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ
Wpływ temperatury na aktywność enzymu
temperatura maksymalna
temperatura optymalna
temperatura
V
reakcji
sz
ybk
oś
ć r
ea
kc
ji c
he
mi
cz
ne
j
sta
biln
ość
bia
łka
WPŁYW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ
•
wpływ pH
V
max
pH optymalne
pH
1. dla skrajnych wartości
pH zachodzi denaturacja
2. protonowanie/deprotonowanie
centrum aktywnego
WPŁYW CZYNNIKÓW KINETYCZNYCH
NA PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNEJ
•
wpływ stężenia substratu
V
max
[S]
c
[S]
kataliza
nieefektywna
kataliza
efektywna
krytyczne stężenie substratu
szybkość
wzrostu
bakterii
stężenie substratu
S
1
S
2
Zooglera ramigera
Sphaerotilus natans
niższe stężenia substratu:
bakteria z enzymami o wyższym K
s
(niższym K
M
) wzrasta szybciej (ma
wyższe powinowactwo do substratu)
dla wyższych stężeń substratu: K
M
nie jest decyduje o szybkości wzrostu
µ
max
[S]
K
s
+[S]
µ=
µ - właściwa szybkość
wzrostu
µ
max
- maksymalna
właściwa
szybkość wzrostu
K
s
- stała równowagi
enzym-substrat
Równanie Monoda
Biochemia i fizjologia wzrostu mikroorganizmów
MIKROORGANIZMY
•
bakterie
•
grzyby (np. drożdże, Aspergillus)
•
glony jednokomórkowe
•
pierwotniaki
metabolizm - wszelkie reakcje zachodzące w komórce
KATABOLIZM
duże i skomplikowane
cząsteczki są przekształcane na
mniejsze i prostsze
(pozyskiwana jest energia)
ANABOLIZM
mniejsze i prostsze cząsteczki
są przekształcane na większe i
skomplikowane
(energia jest zużywana)
ANABOLIZM:
powstają zarówno główne składniki komórki:
(np. białka, kwasy nukleinowe, cukry, lipidy)
oraz ich prekursory i inne produkty przejściowe:
(np. aminokwasy, puryna, pirymidyny,
kwasy tłuszczowe, cukty, fosforany)
efekt energetyczny - endotermiczny
procesy anaboliczne muszą wymagają obecności reduktorów
Skąd pochodzi energia potrzebna do przebiegu procesów anabolicznych?
z procesów KATABOLICZNYCH (np. utlenianie węglowodanów do CO2)
energetyka katabolizmu
energetyka katabolizmu
adenozyna
dwufosforan adenozyny (ADP)
trójfosforan adenozyny (ATP)
O
N
H
H
OH
H
OH
H
P
O
O
P
O
HO
O
O
O
P
O
O
O
N
N
N
NH
2
„wiązanie o dużej energii”
P
OH
O
C
OH
OH
O
+ ATP
C
+ ADP
ATP ADP AMP
(monofosforan)
(rzadziej)
warunki aerobowe
oksydatywna fosforylacja
N
NH
2
O
R
N
NH
2
O
R
+2e + 2H
H
H
NAD
+
NADH
adenozyna
NADPH + 3ADP + 3(nieorg. fosfor) + 1/2 O
2
NADP
+
+ 3ATP + H
2
O
NADH + 3ADP + 3(nieorg. fosfor) + 1/2 O
2
NAD
+
+ 3ATP + H
2
O
NADH - dinukleotyd nikotynamidoadeninowy
NADPH - fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego
warunki anaerobowe
oksydatywna fosforylacja nie może zachodzić
fosforylacja na poziomie substratu (substrate level phosphorylation)
znacznie większa ilość substratu musi być zużyta
NADH + X
NADP
+
+ XH
2
przykłady:
kwas mlekowy w mięśniach po dużym wysiłku fizycznym
kwas mlekowy z bakterii mlekowych
glicelor produkowany przez drożdże gdy blokowana jest synteza etanolu
wytwarzanie kwasu mrówkowego, etanolu, 2,3-butanodiolu, butanolu, acetonu, kwasu propionowego
fakultatywne (warunkowe)
beztlenowce -
dostosowują
sie zarówno do warunków
tlenowych jak i beztlenowych
GLUKOZA
drożdże beztlenowe
drożdże tlenowe
powstają:
CO
2
, H
2
O,
nowe drożdże (dużo)
powstają:
niewiele energii,
substancje redukujące
nowe drożdże (niewiele)
METABOLIZM
tlenowy
(aerobowy)
źródło węgla CO
2
utlenianie,
wydajne wydzielanie energii
beztlenowy
(anaerobowy)
dysproporcjonowanie
mniejsza wydajność uzysku energii
O
2
proces
metaboliczny
biomasa
utleniacz
reduktor
C
s
H
t
O
u
N
v
P
w
S
x
K
y
Mg
z
substrat węglowy
C
m
H
n
O
p
N
q
źródłó azotu
NH
3
K
+
/PO
4
3-
/Mg
2+
/SO
4
2-
etc.
zredukowany
metabolit węglowy,
H
2
O
O2,
utleniony
metabolit węglowy
METABOLIZM
pierwotny
tropofaza
podczas zbalansowanego wzrostu
(dostarczany nadmiar pożywienia)
wtórny
idiofaza
gdy nie ma dostatecznej ilości
pożywienia
substancje wytworzone podczas
idiofazy z acetylokoenzymuA:
cytryniany, kwasy tłuszczowe,
poliketydy, chinony, terpeny,
sterole i inne.
czas
metabolit
pierwotny
metabolit
wtórny
biomasa
(wzrost
komorki)
tropofaza
idiofaza
spadek tempa wzrostu
WYDAJNOŚĆ WZROSTU MIKROORGANIZMÓW
MOLOWA WYDAJNOŚĆ WZROSTU (Y
s
)
wydajność suchej masy komórek na mol substratu
WSPÓŁCZYNNIK KONWERSJI WĘGLA (WKC)
wydajność suchej masy komórek na 1 gram węgla
zawartego w substracie.
substrat
organizm
Ys
WKC
metan
Methylomonas sp.
17.5
1.46
metanol
Methylomonas sp.
16.6
1.38
etanol
Candilla utilis
31.2
1.30
glicerol
Klebsiella pneumoniae
31.2
1.30
glukoza
Escherichia coli
aerobowo
95.0
1.32
anaerobowo
25.8
0.36
Saccharomyces cerevisiae
aerobowo
90
1.26
anaerobowo
21
0.29
heksadekan
Yarrowia (Candida) lypolitica
203
1.06
SZYBKOŚĆ WZROSTU MIKROORGANIZMÓW
zależy od:
• rodzaju źródła węgla
• ścieżek metabolicznych
• obecności innych substratów
• wymagań energetycznych do asymilacji np. azotu
• wydajności tworzenia ATP
• obecności inhibitorów
• obecności jonów
• transportu substratów i produktów
• stanu fizjologicznego mikroorganizmu
SZYBKOŚĆ WZROSTU MIKROORGANIZMÓW - UKŁADY OSCYLUJĄCE
zjawiska oscylacyjne o podłożu enzymatycznym - sprzężenia zwrotne
grupa
amino
kwasowa
enzym
metabolit
substrat
metabolit
akty
wac
ja
rep
res
ja
regulacja genetyczno - metaboliczna
substrat
A
1
A
2
aktywacja wsteczna
aktywacja
substrat
A
1
A
2
aktywacja wsteczna
inhibicja
np. wolno tłumione oscylacje
zawartości NADH
2
w zawiesinie
komórek drożdzy w środowisku
beztlenowym
zwiększenie strumienia glukozy
przepływającej przez błonę komórkową
maleją stężenia fosforanów glukozy
ADP aktywuje fosfofruktokinazę
maleje stężenie ADP