OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCH

OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCH

TOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI

TOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI

CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

SPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREM

SPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREM

MASOWYM (HPLC-MS)

MASOWYM (HPLC-MS)

Dr inż.Agata Kot-Wasik

Katedra Chemii Analitycznej,

Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska

ul. G.Narutowicza11/12,

80-952 Gdańsk, Poland

[e-mail]

Dr Hanna Mazur-Marzec

Instytut Oceanografii, Uniwersytet Gdański,

Al. Marszałka Piłsudskiego 46,
81-378 Gdynia, Poland
[e-mail]

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

ANALIZĘ TOKSYN:

ANALIZĘ TOKSYN:

TESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNE

TESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNE

–

–

ELISA (

ELISA (

ang

ang

.

.

E

E

nzyme

nzyme

-

-

L

L

inked

inked

I

I

mmuno

mmuno

s

s

orbent

orbent

A

A

ssay

ssay

)

)

pozwala na oszacowanie obecności toksyn,

np. wydzielanych przez glony z rodzaju Microcystis,

na poziomie kilku µgL

-1

bez przygotowania próbki,

lecz nie pozwala na ich identyfikację.

–

–

PPI

PPI

(

(

ang

ang

.

.

P

P

rotein

rotein

P

P

hospatase

hospatase

I

I

nhibition assay

nhibition assay

)

)

metody wysoce selektywne, czułe i szybkie

J. Rapala, K. Erkomaaa, J. Kukkonen, K. Sivonen, K. Lahti, Analytica Chimica Acta 466 (2002) 213-231

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

ANALIZĘ TOKSYN:

ANALIZĘ TOKSYN:

METODY CHROMATOGRAFICZNE

METODY CHROMATOGRAFICZNE

–

GC–MS

GC–MS

- zapewnia wysoką selektywność

(specyficzność) oznaczenia, lecz wymaga

derywatyzacji analitów, a poza tym nie może

być zastosowana do analizy nielotnych toksyn

wysokocząsteczkowych.

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

ANALIZĘ TOKSYN:

ANALIZĘ TOKSYN:

–

–

HPLC-UV

HPLC-UV

lub

HPLC-DAD

HPLC-DAD

- jedna z

najczęściej

najczęściej

stosowanych technik, jednakże nie zapewnia

ona wystarczającej jakości uzyskiwanych

wyników bez zastosowania żmudnych i

długotrwałych procedur przygotowania próbki.

–

–

HPLC-fluorescencja

HPLC-fluorescencja

- rzadziej stosowana

technika, gdyż wymaga derywatyzacji analitów;

ale znacznie czulsza niż HPLC-UV.

HPLC–DAD

HPLC–DAD

analiza ekstraktu

analiza ekstraktu

Nodularii

Nodularii

HPLC-DAD

238 nm

254 nm

HPLC–DAD

HPLC–DAD

analiza ekstraktu

analiza ekstraktu

Nodularii

Nodularii

Analiza widma DAD

Wniosek: niezbędny jest wzorzec

celem potwierdzenia czasu

retencji i porównania widma UV

238 nm

254 nm

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

ANALIZĘ TOKSYN:

ANALIZĘ TOKSYN:

–

–

HPLC-UV

HPLC-UV lub

HPLC-DAD

HPLC-DAD

Pozwala na uzyskanie informacji o

masie cząsteczkowej oznaczanych

toksyn, a nawet ich identyfikację.

HPLC–DAD-MS

HPLC–DAD-MS

HPLC-MS

HPLC-MS

TAK, ALE ...

problem połączenia LC i MS !

Przepływ fazy ruchomej w LC wymusza problemy związane z

uzyskaniem wysokiej próżni. Podczas analizy GC (faza ruchoma:

gaz) przepływ gazu u wlotu do MS wynosi około 0.5-2ml/min.

Podczas kiedy w HPLC faza ruchoma w postaci ciekłej daje przepływ

gazu u wlotu MS rzędu 350ml/min w przypadku metanolu i aż

1000 ml/min w przypadku wody!

( J.Abian "The coupling of Gas and Liquid Chromatography with Mass Spectrometry ")

HPLC, 1 ml/min, 100-250 bar

MS, próżnia

HPLC-MS

HPLC-MS

Kwadrupol

Kwadrupol

Kolumna

Kolumna

HPLC

HPLC

Ciśnienie

Ciśnienie

atmosferyczne

atmosferyczne

Próżnia

Próżnia

Wysokie ciśnienie

Wysokie ciśnienie

+HV

+HV

Elektrorozpylanie

Elektrorozpylanie

(

(

electrospray

electrospray

)

)

ODPAROWANIE

ROZPUSZCZALNIKA

ROZPYLENIE

ROZSZCZEPIENIE

I POWSTANIE JONÓW

[M+

[M+

nH

nH

]

]

n+

n+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

+

+

++
++

+

++

+

+

++

+

+

++
++

+

++

+

+

++

+

+

++
++

+

++

+

+

+

+ +

+

+

+

+ +

+

+

+

+

+

HPLC–MS

HPLC–MS

analiza ekstraktu

analiza ekstraktu

Nodularii

Nodularii

HPLC-MS

SCAN

SIM

HPLC–MS

HPLC–MS

analiza ekstraktu

analiza ekstraktu

Nodularii

Nodularii

Widmo MS

SCAN

HPLC–MS

HPLC–MS

analiza ekstraktu

analiza ekstraktu

Nodularii

Nodularii

Analiza widma MS

Wniosek: wzorzec może potwierdzić

hipotezę o obecności nodularyny w

ekstrakcie, ale nie jest niezbędny.

[M+H]

[M+H]

+

+

= 825.4

= 825.4

M=824.4

M=824.4

NH

H

H

H

H

H

OMe

H

N

H

O

H

N

H

COOH

O

CH

3

H

NH

O

O

N

H

NH

NH

2

N

H

O

CH

3

H

H

COOH

H

CH

3

HPLC–MS

HPLC–MS

analiza ekstraktu

analiza ekstraktu

Nodularii

Nodularii

Widmo MS

SCAN

HPLC–MS

HPLC–MS

analiza ekstraktu

analiza ekstraktu

Nodularii

Nodularii

HPLC-MS

NH

H

H

H

H

H

OMe

H

N

H

O

H

N

H

COOH

O

CH

3

H

NH

O

O

N

H

NH

NH

2

N

H

O

CH

3

H

H

COOH

H

CH

3

[M+H]

[M+H]

+

+

= 811.3

= 811.3

M=810.3

M=810.3

dm-Nod

HPLC–DAD-MS

HPLC–DAD-MS

analiza ekstraktu:

analiza ekstraktu:

jezioro Karczemne

jezioro Karczemne

HPLC-DAD

HPLC-MS

MS-SCAN

MS-SIM

DAD

MS-SCAN

MS-SCAN

analiza ekstraktu: jezioro Karczemne

analiza ekstraktu: jezioro Karczemne

[M+H]

[M+H]

+

+

NH

2

+ O

Anatoksyna A

NH

CH

3

H

H

C

H

3

H

CH

3

H

H

H

O

N

H

O

C

H

3

H

N

O

OH

H

NH

CH

2

O

CH

3

A

H

C

H

3

O

N

H

H

NH

O

N

H

OH

R1

H

H

NH

2

N

H

MC RR

[M+2H]

[M+2H]

2+

2+

MS-SIM

MS-SIM

analiza ekstraktu: jezioro Karczemne

analiza ekstraktu: jezioro Karczemne

Jon monitorowany:

166 (Anatoksyna-a)

Jon monitorowany:

995 (MC-LR)

Jon monitorowany:

520 (MC-RR)

Jon monitorowany:

825 (Nod)

1046 (MC-YR)

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

ANALIZĘ TOKSYN:

ANALIZĘ TOKSYN:

–

HPLC–MS

HPLC–MS

- technika ta

pozwala na

uzyskiwanie informacji o masie cząsteczkowej

oznaczanych toksyn.

Widmo masowe - “odcisk palca” substancji

pozwala na jej identyfikację. Technika HPLC-DAD-MS

zaczyna być coraz powszechniej stosowana do analizy

toksyn ze względu na jej zalety oraz fakt, iż dzisiaj

systemy HPLC-MS stają się niezawodne, oferuje je coraz

większa liczba producentów, a ich ceny zbliżają się do

poziomu akceptowalnego przez większość laboratoriów.

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

ANALIZĘ TOKSYN:

ANALIZĘ TOKSYN:

–

HPLC–MS

HPLC–MS

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE

ANALIZĘ TOKSYN:

ANALIZĘ TOKSYN:

niezwykle użytecznym rozwinięciem techniki HPLC-MS

jest

LC-MS-MS

LC-MS-MS

–

–

HPLC-MS-MS

HPLC-MS-MS

- dzięki zastosowaniu

dodatkowego detektora masowego możliwa jest

identyfikacja nieznanych substancji jedynie na

podstawie ich widma masowego

(nawet bez

konieczności posiadania wzorców)

.

WNIOSKI KOŃCOWE:

WNIOSKI KOŃCOWE:

Technika

HPLC–MS

HPLC–MS

zaczyna być coraz

powszechniej stosowana w laboratoriach

analitycznych ze względu na jej zalety.

Wkrótce technika LC-MS stanie się techniką

rutynowych analiz.