1

Biologia Komórki

Ćwiczenie I

MIKROSKOP ŚWIETLNY

Nazwa części

Budowa

Funkcje

urz

ąd

zen

ie

ośw

iet

laj

ące

źródło

światła

żarówka halogenowa, diody

emitujące światło, żarówka

zwykła, (w starszych
mikroskopach- lusterko)

wytworzenie lub utworzenie

wiązki światła

kondensor
(aparat
Abbego)

układ soczewek

skupianie rozproszonego światła

w zbieżną wiązkę oświetlającą
pole widzenia

obiektyw

system soczewek

pierwszy z elementów tworzący

obraz powiększony

pośredni

układ
optyczny

zwierciadło lub układy
pryzmatyczne

załamanie wiązki pod

określonym kątem zgodnym z

kątem załamania tubusa (może

dzielić wiązkę na dwie części –

pierwszą skierowaną do okularu,

drugą do połączonego z
mikroskopem aparatu
fotograficznego lub kamery)

okular(y)

dwie soczewki płasko-

wypukłe

powiększanie, odwracanie i
tworzenie obrazu urojonego

Części optyczne mikroskopu świetlnego

Obraz w mikroskopie świetlnym jest pozorny (urojony), powiększony i odwrócony.

Powiększenie całkowite mikroskopu oblicza się, mnożąc powiększenie obiektywu przez

powiększenie okularu i ewentualnie przez powiększenie pośredniego układu optycznego.

Powiększenia mikroskopów świetlnych mieszczą się w zakresie od 10-1500X.

Apertura numeryczna –

jest wielkością charakteryzującą obiektyw

An = n x sin α

n -

współczynnik załamania światła

kąt α - kąt zawarty pomiędzy osią optyczną a skrajnym promieniem trafiającym do soczewki
obiektywu

Zdolność rozdzielcza mikroskopu jest to najmniejsza odległość dzieląca dwa punkty, które w

obrazie mikroskopowym dostrzegalne są oddzielnie. Im mniejsza ta odległość tym lepsza

zdolność rozdzielcza.
E = 0,5 L / An
L -

długość fali światła (przeciętna 0,55 μm)

Obiektywy suche - An - 0,95; E -

0,3 μm

Obiektywy immersyjne wodne - An - 1,2; E -

0,24 μm

Obiektywy immersyjne olejkowe - An - 1,42; E -

0,19 μm (najlepsza zdolność rozdzielcza)

2

granica

rozdzielczości
oka
nieuzbrojonego

granica

rozdzielczości
mikroskopu

świetlnego

granica

rozdzielczości
mikroskopu
elektronowego

Rodzaje obiektywów

monochromatyczne

skorygowane na jedną określoną część widma światła

białego

achromatyczne

skorygowane na środkową część widma światła widzialnego

planachromatyczne

achromatyczne o lepszej korekcji, zwiększające ostrość

obrazu (pozwalają na korzystanie z dużego pola widzenia i

okularów o dużych powiększeniach)

apochromatyczne

prawie cały zakres fal

planapochromatyczne

apochromatyczne o lepszej korekcji, zwiększające ostrość

obrazu (pozwalają na korzystanie z dużego pola widzenia i

okularów o dużych powiększeniach)

do fluorescencji

obiektywy o bardzo dużej transmisji wiązki świetlnej,

zwłaszcza o długości fali ok. 340 nm

obiektywy suche

przy powiększeniach małych i średnich

obiektywy mokre

(immersyjne)

przy powiększeniach dużych

obiektywy o dużej

odległości roboczej

stosowane w mikroskopach odwróconych

3

Obiektyw suchy

(małych i średnich powiększeń) – część promieni świetlnych nie przechodzi

przez obiektyw, lecz odbija się na granicy szkiełka z preparatem i powietrza
Obiektyw immersyjny

(dużych powiększeń) – przestrzeń między nim a preparatem wypełnia

się olejkiem immersyjnym, którego współczynnik załamania światła jest taki sam, jak szkła –

unika się ugięcia (dyfrakcji) promieni świetlnych na granicy szkła i powietrza, co wpływa

korzystnie na jakość obrazu

Cechy charakteryzujące obiektyw (symbole umieszczone na obudowie):
Apertura numeryczna – An

Powiększenie – 10x, 20x…

Najczęściej stosowane powiększenia obiektywów to:
- obiektywy suche – 5x, 10x, 20x, 40x
- obiektywy immersyjne – 60x, 100x

Rodzaje mikroskopów świetlnych

Mikroskop świetlny klasyczny

Mikroskopy będące prostymi

modyfikacjami mikroskopu

klasycznego

Mikroskop fluoroscencyjny

Mikroskop konfokalny

Mikroskop zwykły

Mikroskop odwrócony

Mikroskop polaryzacyjny

Mikroskop interferencyjny

Mikroskop

kontrastująco-

fazowy

Mikroskop ciemnego pola

Mikroskop odwrócony

- stosowany dla preparatów biologicznych

wymagających mikroskopowania „od dołu”,

np. hodowli komórek w płaskich naczyniach, w których komórki osiadają na dnie, a

nad nimi jest warstwa płynu (odżywki) utrudniająca tradycyjne mikroskopowanie od

góry (uniemożliwia zbliżenie obiektywu od góry na odległość niezbędną do
wytworzenia ostrego obrazu),

-

układ optyczny jest odwrócony o 180º (źródło światła i kondensor są w górnej części

mikroskopu, a obiektyw i okular w dolnej),

- specjalne obiektywy (20 -

60 x) o dużej odległości roboczej pozwalają na obserwacje

poprzez dna naczyń wykonane ze szkła lub tworzywa sztucznego o grubości 0,2 – 1,5
mm,

-

najczęściej uzyskany obraz nie jest odwrócony co bardzo ułatwia mikromanipulację,

-

mikroskop odwrócony może posiadać dodatkowo specjalny układ optyczny
(kontrastowo-fazowy, fluorescencyjny, polaryzacyjny).

4

Mikroskop pola ciemnego
-

obserwacja w polu ciemnym umożliwia dostrzeżenie w preparacie drobnych cząstek o

wymiarach poniżej zdolności rozdzielczej układu optycznego. Wykorzystuje się zjawisko
dyfra

kcji (ugięcia) promieni świetlnych padających na obiekt o bardzo małych rozmiarach.

Przykładowo drobne cząstki kurzu w powietrzu, niewidoczne w normalnych warunkach, gdy

znajdą się w smudze światła padającej do pokoju, świecą się. Dzieje się tak, gdy patrzymy na

jasną smugę światła widoczną na ciemnym tle.
-

występuje specjalny kondensor, którego centralna część jest nieprzepuszczalna dla światła;

promienie świetlne przechodzą przez preparat pod bardzo ostrym kątem, a do obiektywu

trafiają tylko te promienie, które załamują się na krawędziach oglądanych obiektów. Obiekty

te widać jako drobne świecące punkty na ciemnym tle,
-

wykorzystując zjawisko rozpraszania światła na obserwowanych strukturach, można w polu

ciemnym rozpoznać np. włókna o grubości zaledwie 5 nm, a więc o wymiarach około 40 razy

mniejszych od wartości zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego,
-

mikroskopię ciemnego pola stosuje się głównie do obserwacji mikroorganizmów w płynach

ustrojowych.

Mikroskop kontrastowo- fazowy
Siatkówka o

ka rejestruje tylko 2 z 3 parametrów fizycznych fali świetlnej – długość fali

(odbiera ją jako barwę) i amplitudę fali (odbiera jako stopień jasności). Trzeci parametr – faza

fali świetlej - nie jest rejestrowany przez siatkówkę. Faza jednak ulega zmianom przy

przechodzeniu światła przez preparat. Różne struktury obecne w preparacie powodują

przesunięcie fazy fali świetlnej. To zjawisko wykorzystano w mikroskopii kontrastowo-
fazowej.

Żywe komórki ssaków (z wyjątkiem tych zawierających pigment) są obiektami fazowymi.

Światło przechodzi przez nie jak przez przejrzyste szkło. Obserwator nie dostrzega żadnych

zmian ani w jego natężeniu ani w barwie. Jedyną zachodzącą zmianą, którą ludzkie oko nie

potrafi ocenić, jest zmiana (przesunięcie) fazy światła.
Mikroskop kontrastowo-fazowy zawiera specjalny

układ optyczny, który przekształca

przesunięcie fazy światła w zmianę jej amplitudy (czytelną dla oka), dzięki temu struktury
obecne w preparacie

widoczne są w postaci skontrastowanej, czyli jako ciemniejsze lub

jaśniejsze.

Zastosowanie:
-

powszechnie używany do badania komórek nie zabarwionych, z reguły żywych (np. z

hodowli komórkowej),
-

do wzmocnienia ogólnego kontrastu w słabo zabarwionych preparatach.

Mikroskop interferencyjny

-

działa także na zasadzie przekształcenia różnic faz fal świetlnych w różnice ich
amplitudy

-

posiada jednak odmienną konstrukcję kondensora, który dodatkowo rozdziela wiązkę

światła na dwie składowe (jedną przechodzącą przez preparat, drugą obok preparatu,

przez tło - tzw. wiązkę odniesienia, charakteryzującą się m. in. stałym

współczynnikiem załamania światła. W tubusie dochodzi do interferencji między

nimi, czyli ponownego zespolenia dwóch wiązek w jedną składową).

–

układ optyczny kontrastuje obraz oraz dzięki temu, że umożliwia obliczenie współczynnika

załamania światła promieni przechodzących przez preparat, może służyć do analizy

ilościowej suchej masy badanych struktur i do określania grubości skrawków. Istnieje

bowiem poznana zależność między stężeniem substancji wchodzących w skład komórki

(białka, cukry, lipidy) a wartością współczynnika załamania światła.
-

układ optyczny pozwala też na rozszczepianie światła białego na barwne części widma i

optyczne „wybarwienie” struktur widocznych w obrazie mikroskopowym.

5

Mikroskop z o

ptyką (kontrastem) Nomarskiego

- modyfikacja mikroskopii kontrastowo- fazowej i interferencyjnej,
-

pozwala na znaczące wzmocnienie kontrastu nie zabarwionych struktur komórkowych,

- uzyskanie plastycznego nieomal trójwymiarowego obrazu tych struktur.

Mikroskop polaryzacyjny
-

używany do badań obiektów anizotropowych w świetle spolaryzowanym,

-

posiada w układzie optycznym pryzmaty powodujące polaryzację światła (uporządkowanie

chaotycznych drgań fali świetlnej w jednej płaszczyźnie). Wszystkie obiekty biologiczne pod

względem ich wpływu na polaryzację przechodzącego przez nie światła dzielimy na

izotropowe (załamują pojedynczo światło i nie zmieniają płaszczyzny polaryzacji, nie są więc

widoczne w mikroskopie polaryzacyjnym) oraz anizotropowe (załamują podwójnie światło i

zmieniają płaszczyznę polaryzacji promieni świetlnych, są wtedy widoczne jako jasne na
ciemnym tle)
-

do obiektów anizotropowych, które można oglądać, należą substancje, w których występuje

wysoce uporządkowany układ cząsteczek, np. włókna kolagenowe, zmineralizowana

substancja międzykomórkowa tkanki kostnej, miofibryle włókien mięśniowych poprzecznie

prążkowanych, krystaliczne i parakrystaliczne wtręty wewnątrzkomórkowe
- w histopatologii mikroskop polaryzacyjny

służy do wykrywania złogów skrobiawiczych

(amyloidu) w komórkach.

Mikroskop fluorescencyjny
Fluorescencja –

emitowanie światła (widzialnego) przez substancję chemiczną pod wpływem

naświetlania jej promieniami ultrafioletowymi (UV). Własność tę posiadają niektóre
substancje obecne w komórkach i tkankach (porfiryny, witamina A, lipofuscyny, chlorofil)
oraz specjalne barwniki tzw.

fluorochromy używane w metodyce histologicznej i

histochemicznej.

Źródłem światła w mikroskopie fluorescencyjnym jest specjalna żarówka emitująca
promieniowanie UV. Dodatkowo mikroskop ten

posiada zestaw filtrów przepuszczających

jedynie widzialne UV o pożądanej długości fali, chroniąc tym samym narząd wzroku przed

szkodliwym działaniem pozostałych promieni UV.

Obrazem w mikroskopie fluorescencyjnym są widoczne na ciemnym tle świecące

(fluoryzujące) struktury komórek i tkanek.

Kolor fluorescencji zależy od rodzaju substancji fluoryzującej.

Konfokalny skaningowy mikroskop świetlny
- nowoczesna odmiana mikroskopu fluorescencyjnego, w którym

źródłem światła jest laser,

skupiany w wiązkę o średnicy zaledwie 0,1 μm, co stanowi teoretyczną zdolność rozdzielczą
tego mikroskopu,
- mikroskop ten jest

sprzężony ściśle z odpowiednim programem komputerowym,

-

wiązka lasera z dużą szybkością skanuje preparat na określonej równoległej płaszczyźnie,

komputer rejestruje obrazy serii przekrojów optycznych wszystkich warstw preparatu (np.

warstw o grubości 1-2 µm w skrawku histologicznym o grubości 20 µm), łączy je razem i

umożliwia tworzenie trójwymiarowego obrazu badanego obiektu, który ogląda się na
monitorze.

W innych typach mikroskopu świetlnego ostry obraz można uzyskać tylko z jednej

określonej głębokości – warstwy preparatu uwarunkowanej m.in. jego odległością od
obiektywu,
-

w większości przypadków mikroskopy konfokalne wykorzystują fluorescencję emitowaną

pod wpływem laserowego światła przez odpowiednio zabarwiony preparat.

6

Przygotowanie materiału biologicznego do badań w mikroskopie świetlnym.

Przygotowanie materiału biologicznego do badań w mikroskopie świetlnym to często długa i

skomplikowana procedura, która służy do uzyskania trzech podstawowych wymaganych cech
dobrego preparatu mikroskopowego:
-

przejrzystość – odpowiednia grubość preparatu, która musi umożliwić przejście przez niego

promieni świetlnych. Najlepszą jakość uzyskuje się przy preparatach jak najcieńszych,
- zabarwienie (ewentualnie skontrastowanie) –

by zróżnicować struktury występujące na

preparacie,
- zachowanie struktur komórek i tkanek w preparacie w stanie jak najbardziej

zbliżonym do

str

uktury tkanki żywej – co jest warunkiem wiarygodności obrazu mikroskopowego.

W praktyce najczęściej wykorzystuje się dwa typy preparatów mikroskopowych:
- skrawki –

uzyskane przez pokrojenie materiału biologiczne na cienkie „plasterki”,

- rozmazy – wyko

nywane z płynów ustrojowych, w których są zawieszone wolne komórki

(kre

w, szpik czerwony, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyny wysiękowe i wydzieliny). Kroplę

płynu rozprowadza się na szkiełku tak, by zawarte w nim komórki utworzyły pojedyńczą

płaską warstwę.

TECHNIKA PARAFINOWA

1.

Pobieranie materiału

•

Pośmiertne - w czasie jak najkrótszym od ustania pracy serca (by zapobiec zmianom

rozkładowym), pobiera się wycinek o wymiarach nie większych niż 1 cm x 1 cm x 1
cm, 2 cm x 0,5 cm x 0,5 cm

(by zapewnić dobrą i szybką penetrację płynów

stosowanych w dalszych etapach –

utrwalaczy, płynów odwadniających i pośrednich)

za pomocą ostrych narzędzi

•

Przyżyciowe - w trakcie zabiegu operacyjnego lub metodą biopsji

2. Utrwalanie

• Cel - zatrzymanie procesów

życiowych w komórkach bez naruszenia ich struktury,

przede wszystkim przez denaturację enzymów. Zapobiega to zmianom autolitycznym,

czyli samostrawieniu komórek przez własne enzymy lizosomalne i wtórnym zmianom

rozkładowym i gnilnym wywoływanym przez obecne w materiale bakterie,
- zachowanie struktury tkanek i komórek tak,

aby nie uległa ona zniszczeniu w

t

rakcie dalszych etapów obróbki poprzez wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie

jego odporności na działanie odczynników używanych w dalszych etapach procedury.

•

Najczęściej stosowane utrwalacze stabilizują tkanki i komórki poprzez wytwarzanie

nieodwracalnych wiązań krzyżowych (co usztywnia bardziej tkankę) pomiędzy

końcowymi grupami polipeptydów i białek, tworzenie mostków (np. formaldehyd –
mostki metylenowe CH

2

= CH

2

) lub wiążą się z grupami SH białek. Proces ten

zachowując integralność budowy niszczy biologiczną funkcjonalność białek

(szczególnie enzymów) poprzez denaturację białek (czyli zmiany w II, III i IV

rzędowej strukturze białka)

• Utrwalacze

– proste: formalina, alkohol, aceton
–

złożone: płyn Bouina (formalina, kwas pikrynowy,

kwas octowy)

AFA (alkohol, formalina, kwas octowy).

• Czas i temperatura utrwalania –

różne w zależności od rodzaju utrwalacza i materiału.

Sposoby utrwalania:
Immersyjne - zanurzenie wycinka w naczyniu z utrwalaczem

o objętości 50 – 100 x większej

niż utrwalanego wycinka. Część obwodowa tkanki zostaje utrwalona najszybciej, do części

7

środkowej utrwalacz dociera z opóźnieniem, co może sprzyjać powstawaniu artefaktów
(struktur nie

istniejących w żywych tkankach) związanych z procesami autolitycznymi,

szczególnie przy większych wycinkach. Czas utrwalania od 1 godziny do kilku dni.
Perfuzyjne – do otwartych

głównych naczyń tętniczych badanego narządu (lub w przypadku

małych zwierząt dosercowo) wprowadza się sól fizjologiczną (w celu wypłukania krwi) a

następnie utrwalacz, który wypływa z narządu przy otwartych żyłach. Dzięki bogatej sieci

naczyń włosowatych utrwalacz dociera natychmiast do każdego rejonu narządu. Tkanka jest
utrwalana równomiernie i szybko

od wewnątrz, co zapewnia najlepsze zachowanie jej

struktury

. Czas utrwalania perfuzyjnego może być bardzo krótki – 5-15 minut.

3. P

łukanie

•

Ma na celu usunięcie nadmiaru utrwalacza nie związanego z utrwalanym materiałem.

• Jest przeprowadzane w:

–

wodzie bieżącej - w przypadku utrwalaczy będących roztworami wodnymi

– alkoholu etylowym –

w przypadku utrwalaczy złożonych zwierających alkohol

etylowy w stężeniu ≥ 70 %.

•

Trwa najczęściej 12 – 18 godzin.

4. Odwadnianie

• Cel –

usunięcie wody z badanego materiału (wewnątrztkankowej i z resztek

utrwalacza)

i zastąpienie jej alkoholem

• Przeprowadzane

w naczyniach zawierających kolejno roztwory alkoholu etylowego o

rosnącym stężeniu: 30, 50, 60, 70, 80, 90, 96, 100%

5. P

rzeprowadzanie przez płyny pośrednie (prześwietlanie)

• Cel –

usunięcie alkoholu i resztek wody z badanego materiału, gdyż ich obecność

uniemożliwia późniejsze zatopienie materiału w substancji utwardzającej (parafinie)

•

Kąpiel w ksylenie - wycinek stopniowo staje się półprzeźroczysty. Ksylen jako

rozpuszczalnik organiczny rozpuszcza się w parafinie. Nosi nazwę płynu pośredniego,

ponieważ pośredniczy między odwadnianiem a zatapianiem. Do dokładnym

przepojeniu materiału płynem pośrednim można go zatopić.

6. Zatapianie w parafinie

• Cel – ut

wardzenie i przygotowanie materiału do krojenia.

• Przepajanie w

naczyniu z roztopioną parafiną (najpierw o niższej, a później o wyższej

temperaturze topnienia) przez kilka godzin w cieplarce w temperaturze o kilka stopni

wyższej od temperatury topnienia parafiny.

•

Używa się kilku odmian parafiny o różnej twardości i temperaturze topnienia (im

większa twardość tym wyższa temperatura topnienia, np. 45°C dla bardzo miękkiej i
60°C dla bardzo twardej)

• Utwardzenie bloczka tkankowo-parafinowego poprzez

oziębienie parafiny.

•

Każdy bloczek jest odpowiednio podpisany i skatalogowany.

7. Krojenie

Skrawki histologiczne kroi się na mikrotomach. Każdy mikrotom prócz noża krojącego (z

wysokogatunkowej stali) i stolika, do którego montuje się bloczek parafinowy z materiałem,

posiada mechanizm umożliwiający ustawienie pożądanej grubości skrawków i automatyczne

dosuwanie bloczka do noża (lub odwrotnie) o dystans odpowiadający odpowiedniej grubości

skrawka. W zależności od typu mikrotomu, częścią ruchomą jest stolik z bloczkiem lub nóż:
- mikrotom rotacyjny -

ruchomy bloczek, nieruchomy nóż

- mikrotom saneczkowy -

ruchomy nóż, nieruchomy bloczek

8

W mikroskopii świetlnej kroi się skrawki o grubości 6 – 10 μm. Im cieńsze skrawki, tym

lepsza rozdzielczość mikroskopu świetlnego i możliwość obserwowania drobniejszych

szczegółów w obrazie mikroskopowym.

Przy krojeniu bloczka parafinowego tworzy się wstęga złożona z kolejnych (seryjnych)

skrawków zlepionych ze sobą krawędziami. Skrawki te odrywa się delikatnie od siebie i

ponieważ są pofałdowane, umieszcza się na powierzchnię wody o temperaturze 40°C w celu

zmiękczenia parafiny i rozprostowania skrawków. Następnie skrawek nakłada się na

powierzchnię szkiełka podstawowego, suszy i barwi.

8. Barwienie
Metody barwienia komórek i tkanek

- barwienie

zwiększa kontrast komórek i tkanek oraz uwidacznia ich charakterystyczne

cechy, pozwala na wyr

óżnienie poszczególnych komórek i tkanek pod mikroskopem

-

umożliwia określenie rodzajów komórek i podstawowych cech ich budowy (kształt,

wielkość, główne struktury) oraz topografii komórek

W

yróżniamy barwienia rutynowe i specjalistyczne. Metody rutynowe wykorzystują

najczęściej kwaśny lub zasadowy charakter barwionych elementów (opierają się wtedy na

reakcji zobojętniania – barwniki zasadowe wiążą się ze strukturami kwaśnymi) oraz
powinowactwo struktur do pewnych substancji (np. soli metali)

P

rzykłady:

- metoda HE (hematoksyksylina, eozyna –

barwienie jąder i cytoplazmy),

- metoda Giemsy (barwienie komórek krwi i szpiku),
- metoda Azan-

Mallory (barwienie komórek i włókien tkanki łącznej na niebiesko),

- metoda srebrzenia (impregnacja azotanem srebra

, który redukuje się w tkankach do

metalicznego czarnego strątu – na obecność włókien srebrochłonnych).

Najpopularniejsze barwniki:

• Barwniki rozpuszczalne w wodzie:

–

Barwniki zasadowe (jądrowe) – wiążą się z kwaśnymi strukturami
komórkowymi –

jądrem, siateczką szorstką, rybosomami

• hematoksylina – wybarwia na kolor fioletowy

–

Barwniki kwaśne (plazmatyczne) – wiążą się z zasadowymi elementami
komórki -

z cytoplazmą i pozostałymi organellami

• eozyna –

wybarwia na kolor różowy

•

Barwniki rozpuszczalne w tłuszczach (obojętne)

• sudan –

wybarwia na kolor pomarańczowy

Barwienie HE (metoda HE):

• odparafinowywanie (ksylen 2x) – u

suwamy parafinę ze skrawka, gdyż barwnik się w

niej nie rozpuszcza

• uwadnianie (alkohol 100 % - 50 %)
•

płukanie (woda destylowana) – barwnik rozpuszczalny w wodzie wymaga dobrego
uwodnienia tkanki

•

barwienie jąder - hematoksylina

•

płukanie (woda)

•

różnicowanie (roztwór alkoholu)

•

płukanie (woda)

• barwienie cytoplazmy – eozyna
•

płukanie (woda)

• odwadnianie (alkohol 80 % - 100 %)
•

prześwietlanie (ksylen 2x)

9

9. Zamykanie –

zakrywanie zabarwionego preparatu szkiełkiem nakrywkowym i

wypełnienie przestrzeni między oboma szkiełkami żywicami - balsamem kanadyjskim lub
DPX.

Żywice te mają ten sam współczynnik załamania światła co szkło, co zapobiega

ewentualnemu rozpraszaniu i uginaniu promieni świetlnych przechodzących przez preparat w

mikroskopie świetlnym.
Tak przygotowany

preparat mikroskopowy może służyć nawet kilkadziesiąt lat.

pobieranie

materiału

Techniki stosowane w mikroskopii świetlnej

utrwalanie

płukanie

odwadnianie

płyny pośrednie

krioprotekcja

zamrażanie

krojenie

zatapianie w
parafinie

odparafinowanie

nawadnianie

barwienie

odwadnianie

prześwietlanie

zamykanie

Technika parafinowa

Technika mrożeniowa

TECHNIKA MROŻENIOWA



polega na utwardzeniu materiału biologicznego przez jego zamrożenie.



technikę mrożeniową stosuje się w histochemii i immunocytochemii, gdyż zachowuje

aktywność biologiczną białek (enzymów) oraz skład chemiczny wszystkich substancji
komórki (m.in. lipidów),



ok. 70% masy materiału biologicznego stanowi woda, która podczas zamrażania

zamienia się w bardzo liczne i szybko przybierające na masie i wielkości kryształki,

które mogą uszkodzić struktury komórek. By temu zapobiec lub nawet wyeliminować

proces krystalizacji, przed zamrożeniem stosuje się krioprotekcję tkanek – czyli

przepojenie utrwalonej tkanki substancją, której wodny roztwór nie tworzy

kryształków, lecz ulega żelifikacji. Najczęściej stosuje się roztwory sacharozy lub

glicerolu. Tak przepojoną tkankę zamraża się w temperaturze minimum -25°C (przy

dłuższym czasie przechowywania nawet -80°C),

 krojenie

zamrożonego materiału przy pomocy kriostatu – jest to zmodyfikowany

mikrotom rotacyjny umieszczony w komorze chłodniczej o temperaturze regulowanej
od -25 do -60 ºC

. Elementy sterujące (napęd, regulacja grubości skrawków, odległości

10

noża od materiału) są wyprowadzone na zewnętrznej obudowie komory, by zapobiec

odmrożeniu rąk pracującego.

 Pojedynczy skrawek

z noża zbiera się bezpośrednio na szkiełko, na którym jest

rozmrażany, suszony i od razu barwiony (bez konieczności stosowania alkoholi i
innych rozpuszczalników organicznych).

Preparaty sporządzane techniką

mrożeniową

Preparaty sporządzane techniką

parafinową

ZALETY

•

Dobrze zachowana struktura
komórek i tkanek

•

Wysoka jakość obrazów w
mikroskopie optycznym

(poprzez możliwość uzyskania

wystarczająco cienkich
skrawków)

WADY

•

Długotrwała procedura
przygotowania

•

Wypłukane lipidy (efekt

działania rozpuszczalnika
organicznego)

•

Znacznie zmieniona biologiczna

funkcjonalność i struktura białek

(wpływ utrwalania i wysokiej
temperatury przy przepajaniu

parafiną)

ZALETY

•

Dobrze zachowany skład chemiczny

wszystkich składników komórek łącznie
z lipidami

•

Krótsza procedura przygotowania niż w
technice parafinowej

•

Zapobiega denaturacji białek,

zachowuje aktywność enzymów

WADY

•

Struktura materiału częściowo
uszkodzona na skutek

mrożenia

(proces krystalizacji)

•

Grubsze preparaty i

gorsza jakość

obrazu niż w przypadku preparatów
parafinowych

KROJENIE

MATERIAŁU NIEUTWARDZONEGO

 stosowane w histochemii i immucytochemii
 krojenie przy pomocy wibratomu

(nóż drga z określoną częstotliwością)

 skrawki grube 50 –

100 μm, nierówne

W medycynie z

aletą krojenia na wibratomie i w kriostacie

jest wykorzystanie

tych technik np. w czasie kilkugodzinnych operacji, gdy chirurg

wycinając fragment tkanki i

przekazując do analizy, może liczyć na to, że w trakcie operacji wróci do niego wynik
histopatologiczny

. Wówczas wie dokładnie, z jaką tkanką patologiczną ma do czynienia i

odpowiednio do tego zmodyfikować przebieg zabiegu.

11

Biologia Komórki

Ćwiczenie II

Metody cytochemiczne

Zasady metod cytochemicznych :
-

pozwalają na umiejscowienie w komórkach (cytochemia) i tkankach (histochemia)

określonych substancji chemicznych oraz enzymów,

-

stanowią one połączenie metodyki histologicznej i reakcji chemicznych,

-

w odróżnieniu od barwienia histologicznego (mającego na celu skontrastowanie struktur

komórek i tkanek), reakcje cytochemiczne prowadzą do uwidocznienia w preparacie

mikroskopowym jedynie ściśle określonych substancji chemicznych będących przedmiotem

badań,
-

na szkiełku podstawowym przeprowadza się reakcję chemiczną, która przebiega pomiędzy

szukaną substancją zawartą w materiale biologicznym oraz wprowadzonym do środowiska
reakcji zwi

ązkiem chemicznym (substratem), w miejscu wykrywanej substancji powstaje

produkt reakcji cytochemicznej, którego lokalizacja i ilość jest oceniana w MŚ lub ME,
- produkt reakcji musi by

ć widoczny (barwny, fluoryzujący lub elektronowo gęsty) i

nierozpuszczalny (co zapobiega jego wypłukaniu i zatarciu pierwotnej lokalizacji) w

środowisku reakcji,
- reakcje cytochemiczne cechuje

duża specyficzność (swoistość).

Typy reakcji cytochemicznych :
- bezpo

średnia – reakcja wykrywanej substancji z substratem prowadząca do powstania

produktu wyznaczającego miejsce jej lokalizacji,
- dwu lub kilkuetapowa –

w której wstępnie dochodzi do zmiany struktury chemicznej

szukanej substancji, a potem ten zmieniony związek chemiczny jest wykrywany przez

przeprowadzenie końcowej reakcji barwnej,
- specyficzne wi

ązanie barwników na drodze oddziaływań elektrostatycznych lub

chemicznych,
- wybiórcze uwidacznianie niektórych zwi

ązków oparte na selektywnej,

rozpuszczalno

ści w nich barwników (np. wykrywanie lipidów Sudanem).

Wykrywanie związków chemicznych w cytochemii:

• białka, kw. nukleinowe i cukrowce – można badać w materiałach przygotowanych techniką

parafinową,
• aminy biogenne -

najlepiej w materiałach przygotowanych metodą liofilizacji (proces

suszenia zamrożonego materiału w próżni i w obniżonej temperaturze) –
• enzymy

, tłuszcze – w technice mrożeniowej, oprócz nich można tu badać wszystkie

pozostałe substancje chemiczne.

Przygotowanie do badań cytochemicznych w transmisyjnym mikroskopie elektronowym
(TEM):
- utrwalenie,
- pokrojenie

materiału nieutwardzonego na skrawki vibrat omowe o grubości 50-100 µm,

- reakcja cytochemiczna,
- zatapianie

w żywicy epoksydowej,

- krojenie na ultra cienkie skrawki,
- kontrastowanie i obserwacja w TEM.

Przykłady reakcji cytochemicznych
• wykr

ywanie białek- reakcja Millona,

12

• wykrywanie cukrowców - reakcja P.A.S.,
• wykrywanie lipidów -

głównie Sudan III i IV, czerń sudanowa, czerwień oleista,

• kwasów nukleinowych - reakcja Feulgena,
• wykrywanie enzymów -

oparte jest na uwidocznieniu produktów ich aktywności

(wykrywany e

nzym musi być czynny; do środowiska wprowadzamy substrat, który pod

wpływem funkcji wykrywanego enzymu ulega przemianie w barwny lub elektronowo gęsty

strąt).

Reakcje kontrolne -

pozwalają na sprawdzenie swoistości reakcji cytochemicznych, a przez to

wiarygodności uzyskanych wyników. Reakcje kontrolne przeprowadza się równolegle z

właściwymi reakcjami cytochemicznymi.
Typy reakcji kontrolnych:
- swoiste blokowanie chemiczne badanej substancji,
-

opuszczanie procedur wstępnych w przypadku reakcji wieloetapowych,

- inkubacja bez substratu ( w reakcjach enzymatycznych),
- blokowanie wykrywanych enzymów swoistymi inhibitorami.

Jeśli zastosowana metoda cytochemiczna jest prawidłowa, to w reakcjach kontrolnych

uzyskuje się wynik negatywny.

Metody immunocytochemiczne

Charakteryzują się najwyższą swoistością. Polegają na wykrywaniu i lokalizacji składników
komórek i tkanek na zasadzie reakcji antygen – przeciwcia

ło, czyli wykrywaniu substancji o

charakterze antygenowym za pomocą znakowanych przeciwciał.

Antygen - jest to substancja (zazwyczaj bia

łko proste lub złożone, rzadziej związek o niższej

masie cz

ąsteczkowej) wykazująca zdolność do wywoływania produkcji swoistych przeciwciał

przez system immunologiczny oraz swoistego wi

ązania wytworzonych przeciwciał i

tworzenia z nimi kompleksów.

Każda struktura komórkowa, w skład której wchodzą białka (lub inne substancje zdolne do

wywołania odpowiedzi immunologicznej) ma potencjalne własności antygenowe i to właśnie
wykorzystuje immunocytochemia.

Przeciwciało - białko – immunoglobulina wytwarzana przez limfocyty B, wiążąca się z
antygenem, ma k

ształt litery Y i składa się z dwóch ciężkich i dwóch lekkich łańcuchów

polipeptydowych. P

od wpływem trawienia papainą rozpada się na fragment Fc oraz dwa

fragmenty Fab, które zawierają miejsca wiążące antygen.

Przeciwciała do badań uzyskuje się w laboratoriach w wyniku immunizacji zwierząt.

Uzyskuje się generalnie dwa typy przeciwciał:

• Przeciwciała monoklonalne - zbiór przeciwciał, które wykazują jednakową swoistość

względem danego antygenu oraz takie same powinowactwo (najlepsze do badań).

• Przeciwciała poliklonalne – przeciwciała, które wiążą różne antygeny i wykazują

różne powinowactwo względem tego samego antygenu.

Przeciwciała są znakowane, by można było uwidocznić na preparacie mikroskopowym

miejsca wiązania przeciwciała z szukanym antygenem.
Znakowanie

przeciwciał:

- fluorochromami

(gdy ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym),

- enzymami (peroksydaza, fosfataza zasadowa) –

zarówno do MŚ i ME,

- metalami -

ferrytyną (białko zawierające żelazo) i złotem – tylko do badania w ME.

Typy reakcji immunocytochemicznych
-

reakcje bezpośrednie – dodaje się znakowane przeciwciało bezpośrednio przeciwko

szukanemu antygenowi,

13

-

reakcje pośrednie – bardziej swoiste, w I etapie przeprowadza się reakcję antygenu z

nieznakowa

nym przeciwciałem, a w II etapie stosuje się znakowane antyprzeciwciała

(przeciwciało przeciw przeciwciału) – by taka reakcja mogła zajść, antyprzeciwciała muszą

pochodzić od innego gatunku zwierzęcia, np. w I etapie używa się nieznakowane przeciwciała
kró

licze, a w II etapie znakowane antyprzeciwciała kozy przeciwko immunoglobulinom

króliczym.
- reakcja awidyna – biotyna (metoda ABC). Awidyna –

białko obecne w jajach.

Wykazuje du

że powinowactwo do biotyny (witaminy H) i jest to jedno z najmocniejszych

zaobserwowanych w przyrodzie interakcji niekowalencyjnych. Jedna cząsteczka awidyny

wiąże cztery cząsteczki biotyny. Reakcja ABC zachodzi w trzech etapach:

1) reakcja między antygenem tkankowym a przeciwciałem pierwotnym z

utworzeniem kompleksu,

2) reakcja powstałego kompleksu z przeciwciałem wtórnym związanym z biotyną

swoistym dla przeciwci

ała pierwotnego,

3) reakcja kompleksu antygen tkankowy-

przeciwciało pierwotne-przeciwciało wtórne

z kompleksem awidyna-biotyna-

peroksydaza, który ma zdolność łączenia się z biotyną

związaną z przeciwciałem wtórnym.
Przebieg tej reakcji oceni

a się na podstawie aktywności peroksydazy w reakcji

enzymatycznej.

Hybrydyzacja in situ (Hybrydocytochemia)

Wykorzystuje właściwość wiązania się komplementarnych łańcuchów kwasów
nukleinowych

poprzez wybiórcze tworzenie się par przez zasady purynowe i pirymidynowe.

Do pojedynczych łańcuchów nukleotydów rozspiralizowanego DNA lub RNA w komórce

mogą się przyłączać fragmenty łańcuchów kwasów nukleinowych pochodzących z innych

źródeł – w tym te wytworzone w wyniku preparatyki biochemicznej lub sztucznej syntezy w

laboratoriach. Prowadzi to do wiązania się odpowiednich par zasad i odtworzenia struktury

dwułańcuchowej – proces ten nosi nazwę hybrydyzacji. Może on zachodzić między
wszystkimi rodzajami kwasów nukleinowych (DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA).
W technikach

mikroskopii hybrydyzację wykorzystuje się do określenia precyzyjnej

lokalizacji badanych sekwencji nukleotydów w obrębie komórki, „in situ” – czyli w miejscu

naturalnego występowania. Stąd nazwa – hybrydyzacja in situ.
Badane sekwencje nukleotydów wykrywa

się za pomocą specjalnie przygotowanych

komplementarnych odcinków DNA lub RNA, które noszą nazwę sond, dodatkowo

znakowanych, by można było dostrzec miejsce ich związania w komórce.

Hybrydyzacja in situ umożliwia:
-

wykrywanie obcego materiału genetycznego w komórce (np. przy zakażeniach

wirusowych),
-

ocenę ekspresji poszczególnych genów w komórce poprzez wykrywanie w nich m-RNA,

-

lokalizację konkretnych genów lub ich fragmentów w obrębie poszczególnych

chromosomów (tworzenie map genowych, diagnostyka chorób dziedzicznych, wykrywanie
genów nowotworów).

Rodzaje sond

(im dłuższe sondy, tym bardziej swoiste, lecz trudniej penetrują do komórek,

więc ustalona optymalna długość sondy wynosi 100-250 nukleotydów):

• dwuniciowe sondy DNA,

• jednoniciowe sondy DNA,

• jednoniciowe sondy RNA,

• krótkie jednoniciowe sondy oligonukleotydów o dł. 25-50 nukleotydów,

Znakowanie sond:

14

• radioaktywne – do łańcucha sondy wbudowuje się izotopy promieniotwórcze

3

H,

32

P,

35

S. Sondy te są wykrywane drogą autoradiografii..

• biotyna – wykrywa się reakcją immunocytochemiczną awidyna-biotyna,

• znacznik antygenowy – połączony z nukleotydami może łączyć się z przeciwciałem,

wykrywany wybraną reakcją immunocytochemiczną.

•

Audioradiografia

Polega na lokalizacji substancji znakowanych izotopami w komórkach i tkankach (np.
radioaktywnych sond w hybrydyzacji in situ).

Substancje te wprowadza się doświadczalnie do

żywego organizmu lub żywych komórek (w hodowli), gdzie są gromadzone lub wbudowane

do znanego związku w organizmie i włączane w procesy metaboliczne (np. tymidyna

znakowana trytem wbudowuje się do DNA komórek). Wykorzystuje się fakt, że substancje

chemiczne zawierające izotopy promieniotwórcze nie są odróżniane przez organizm od
substancji nie znakowanych.

Po pewnym czasie można zbadać stopień wbudowania

znakowanego prekursora do produktu końcowego. Pobiera się narządy i tkanki zawierające
izotopy, nas

tępnie sporządza się z nich preparaty mikroskopowe (do badań w MŚ i ME),

które pokrywa się w ciemni warstwą emulsji fotograficznej. Tak sporządzony preparat leży w

ciemni kilka, kilkanaście dni (a nawet tygodni) w celu ekspozycji emulsji na działanie
promieniowania beta izotopów. W tym czasie izotopy

obecne w komórkach, emitując

elektrony,

powodują miejscowe zmiany w kryształkach bromku srebra obecnych w emulsji.

Następnie po normalnej obróbce fotograficznej emulsji (wywołaniu i utrwaleniu) powstają na
tych miejscach

strąty metalicznego srebra, widoczne w mikroskopie w formie czarnych

ziarenek.

Umożliwia to lokalizację miejsca zawierającego izotop. Skrawki pod emulsją

podbarwia się dodatkowo metodami histologicznymi.

Autoradiografia u

możliwia m.in.:

-

śledzenie szlaków metabolicznych, w które włączane są znakowane substancje chemiczne,

-

śledzenie losów populacji komórek namnażających się,

-

badanie sposobu namnażania organelli komórkowych,

-

śledzenie dróg migracji komórek przemieszczających się,

-

badanie rozmieszczenia i magazynowania związków radioaktywnych w narządach

organizmu.

Izotopy stosowane w autoradiografii do znakowania badanych substancji chemicznych to

przede wszystkim izotopy emitujące promieniowanie beta:

3

H,

14

C,

32

P,

35

S,

45

Ca,

90

Sr,

125

I.

Hodowla tkanek

- j

est metodą umożliwiającą utrzymywaniem poza organizmem czyli In vitro komórek,

fragmentów tkanek lub na

rządów przez okres dłuższy niż 24 godziny (hodowla do 24 godzin

używana w badaniach biochemicznych to inkubacja),
- t

ermin hodowla tkanek jest pojęciem szerokim i obejmuje hodowlę wycinków tkankowych,

hodowle narządowe, hodowle komórek (pierwotne, linii i szczepów komórkowych). Często

używane są dwa terminy – hodowla komórek (w odniesieniu do wyizolowanych komórek) i
hodowla tkanek (

w stosunku do hodowli narządów, hodowli przestrzennych).

Metoda pozwala na obserwowanie zachowania i

badanie żywych komórek i tkanek

pozbawionych kontrolnego i regulacyjnego wpływu organizmu.

Najczęściej stosowane typy hodowli:
- hodowla jednowarstwowa

komórek (w płaskim naczyniu)

- hodowla komórek w zawiesinie
- hodowla komórek w postaci agregatów

15

-

hodowla narządowa statyczna

-

hodowla narządowa przepływowa

Przykład techniki hodowli
Technika hodowli jednowarstwowej:
-

komórki do hodowli jednowarstwowej mogą być pobrane od zwierząt w różnym wieku,

-

pobiera się wycinki narządów lub całe narządy, których komórki izoluje się poprzez

trawienie enzymatyczne (jednostopniowe –

trypsyną lub kolagenazą i hialuronidazą lub

dwustopniowe -

kolagenazą, a następnie trypsyną), dodatkowo przygotowanie zawiesiny

komórek można wspomagać rozdrabnianiem mechanicznym tkanki
-

do zakładania i prowadzenia hodowli stosuje się pożywki (np. DMEM, HAMS F12) do

których jako suplement dodaje się surowicę cielęcą płodową, neonatalną lub surowicę

końską),
-

pożywki zapewniają sterylne środowisko wzrostu oraz dostarczają komórkom

niezbędnych związków odżywczych - węglowodany, aminokwasy, białka i peptydy, kw.
t

łuszczowe, cholesterol, lipidy, witaminy, sole mineralne; pH pożywek jest zbliżone do

naturalnego pH organizmu (utrzymywane przez występujące w pożywce bufory) i wynosi

od 6,8 do 7,2. Do pożywek dodaje się czasem antybiotyki chroniące hodowle przez

zakażeniami bakteryjnymi, grzybiczymi lub wirusowymi.
- surowice

dostarczają hormonów, czynników wzrostu i różnicowania komórek

pobudza

jących wzrost, intensyfikują różnicowanie,

-

hodowle prowadzi się w naczyniach polistyrenowych przystosowanych do adhezji komórek,

na siatkach z poliwęglanu lub na szkle,
-

przy zakładaniu hodowli umieszcza się 1-5 x 10

5

komórek na 1 cm

2

,

- hodowla prowadzona jest specjalnych inkubatorach w at

mosferze nawilżonego powietrza o

temp. 37-38ºC w przypadku komórek ssaków i 38-40ºC w przypadku komórek ptaków oraz
dodatkiem 95% tlenu i 5% d

wutlenku węgla.

- h

odowla komórkowa może by prowadzona w warunkach statycznych lub w przepływie

medium.

Mikroskop elektronowy transmisyjny (TEM)

TEM jest

niejako odpowiednikiem MŚ, gdyż strumień elektronów (podobnie jak strumień

promieni świetlnych) przechodzi przez preparat – stąd nazwa transmisyjny, w odróżnieniu od

mikroskopu elektronowego skaningowego (SEM), w którym strumień elektronów odbija się
od powierzchni preparatu.

TEM jest hermetyczną metalową kolumną w kształcie rury, w której występuje wysoka

próżnia (do -100 atmosfer) wytwarzana przez zespół pomp połączonych z mikroskopem. Do

mikroskopu podłączony jest też system transformatorów przetwarzających prąd sieciowy na

prąd o wysokim napięciu i niskim natężeniu. Na szczycie kolumny jest działo elektronowe, na

drugim końcu ekran fluorescencyjny. W środku kolumny umieszcza się siateczkę z badanym
obiektem.

Działo wytwarza elektrony, które są przyspieszane przez wysokie napięcie i

formowane przez elektromagnetyczne soczewki

działające kolejno jako kondensor, obiektyw

i okular. Obraz w TEM powstaje w wyniku rozpraszania elektronów przez jądra atomów
badanego obiektu. Rozproszone

elektrony nie docierają do ekranu fluorescencyjnego, widać

wtedy obraz ciemny. W mie

jscach, gdzie elektrony przenikają swobodnie przez preparat

widać obraz jasny.

Ponieważ pierwiastki, z których składają się żywe komórki, są lekkie, mają bardzo słabą

z

dolność rozpraszania elektronów. Ich obraz w TEM byłby jasny i słabo czytelny. Dlatego

wprowadzono specjalne techniki barwienia (kontrastowania) polegające na wprowadzeniu do

badanych obiektów soli metali ciężkich zawierających atomy o wysokiej masie. Tak

skontrastowany preparat daje wyraźny czarno-biały obraz w TEM.

16

Porównanie podstawowych cech mikroskopów -

świetlnego i elektronowego

– transmisyjnego

Cechy

Świetlny (optyczny)

Elektronowy (transmisyjny)

Powiększenie

do 2000x

1 000 000x lub więcej

Rozd

zielczość max

200 nm (0,2 µm)

0,5 nm

Źródło obrazu

promienie światła

widzialnego

wiązka elektronów

Ostrość obrazu

zapewniają

szklane soczewki

obiektywu

elektromagnetyczne soczewki

obiektywu

Obraz widziany poprzez

szklane soczewki okularu

ekran fluorescencyjny

i monitor

Obiekt umieszczony na

szkiełku podstawowym

siateczce

(miedź, nikiel)

Obiekt może być żywy

tak

nie

Obiekt wymaga specjalnej

obróbki

nie zawsze

zawsze

Otrzymany obraz jest

barwny

tak

nie

Przygotowanie materiału biologicznego do badań w mikroskopie
elektronowym transmisyjnym (TEM)

A. P

obieranie materiału

•

Przyżyciowe - w trakcie zabiegu operacyjnego lub metodą biopsji

•

Pośmiertne - w czasie 3 minut od ustania pracy serca

• w

ycinek o wymiarach nie większych niż 1 mm x 1 mm x 1 mm

• z

a pomocą bardzo ostrych narzędzi

B. Utrwalanie I

Utrwalacz = nośnik + substancje utrwalające

Nośnik - zapewnia stałe i optymalne pH (7,2- 7,4), ciśnienie osmotyczne i skład jonowy

Najczęściej stosowane nośniki to bufor fosforanowy i bufor kakodylowy.
Substancj

e utrwalające:

• parafolmaldehyd -

szybko dyfunduje do utrwalanego materiału, wiąże się luźno z

białkami (poprzez wiązania krzyżowe) i nie modyfikuje ich struktury, reaguje z
glikogenem, nie utrwala lipidów,

• aldehyd glutarowy - powoli dyfunduje do utrwalane

go materiału, wiąże się ściśle z

białkami i zmienia ich strukturę, reaguje z lipidami.

Przykład utrwalacza:

• Mieszanina 2,5 % aldehydu glutarowego oraz 1 % paraformaldehydu

w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4

Sposób wykonania: immersyjne lub perfuzyjne.
Czas trwania i temperatura: 2 godziny w temp. 4ºC lub pokojowej.

17

C. P

łukanie

•

Ma na celu usunięcie utrwalaczy nie związanych z utrwalanym materiałem.

•

Jest przeprowadzane w buforze zastosowanym jako nośnik substancji utrwalającej
(np. buforze fosforanowym)

•

Trwa najczęściej 24 godziny, ale może być wydłużone do 7 – 14 dni (transport prób)

D. Utrwalanie II (wtórne)

i wstępne kontrastowanie

• Utrwalacz

i pierwszy środek kontrastujący: 1 - 2 % roztwór czterotlenku osmu w

wodzie destylowanej lub buforze fosforanowym

• Utrwalanie lipidów
•

Różnicowanie gęstości elektronowej (wstępne kontrastowanie)

Sposób wykonania: immersyjne.
Czas trwania i temperatura: 2 godziny w temp. pokojowej.

E. Odwadnianie

W roztworach alkoholu etylowego o rosnącym stężeniu: 30, 50, 60, 70, 80, 90, 96, 100%

F. P

rzeprowadzanie przez płyny pośrednie (rozpuszczalniki organiczne)

• aceton
• tlenek propylenu

G. Zatapianie

•

Bardzo mała grubość skrawków używanych w TEM stwarza konieczność zatapiania

materiału w substancjach o wysokiej twardości.

•

Żywice syntetyczne - epoksydowe (EPON 812), poliestrowe, metakrylany. Żywice w

temperaturze pokojowej są płynne.

•

Przepajanie w mieszaninie rozpuszczalnika i żywicy przez 24 godziny.

•

Umieszczenie materiału w kapsułce z płynną żywicą.

•

Utwardzanie żywicy poprzez polimeryzację w podwyższonej temperaturze (60-80°C
przez 24-48 h).

•

Powstają bardzo twarde bloczki zawierające zatopiony materiał.

H. Trymowanie i krojenie
Ultracienkie skrawk

i są nie tylko minimalnie grube ale i bardzo niewielkie – długość

większego boku nie przekracza zazwyczaj 0,3 mm (jest mniejsza niż materiału krojonego
przy pobieraniu)

. W związku z tym przed właściwym krojeniem wstępnie przygotowuje się

płaszczyznę skrawania o takich wymiarach.
-

wpierw wykonuje się kilka tzw. skrawków półcienkich (o grubości 0,5 do 2µm)

obejmujących całą powierzchnię zatopionego materiału, barwi na szkiełku np. błękitem

toluidynowym, następnie ogląda pod MŚ w celu wybrania tego rejonu bloczka, z którego

będzie się potem kroić właściwe skrawki ultracienkie czyli o grubości 20-60 nm,
-

po ocenie skrawków półcienkich w MŚ, na ultramikrotomach pod kontrolą powiększającej

lupy lub okularów zatopiony materiał poddaje się trymowaniu – bocznemu ścinaniu w

piramidkę, której wierzchołek będzie odpowiadał wielkości skrawka ultracienkiego i

wybranego na podstawie obserwacji skrawków półcienkich w MŚ rejonu.
- ultramikrotomy –

ich noże charakteryzują się szczególną twardością i ostrością. Warunków

tych nie spełnia najlepszy nóż stalowy, w związku z tym stosuje się noże szklane lub najlepiej
diamentowe.
-

do noży montuje się (lub są wbudowane fabrycznie) wanienki z tworzywa sztucznego lub

folii metalowej, które wypełnia się wodą. Podczas krojenia ultracienkie skrawki wypływają

na powierzchnię wody, skąd za pomocą precyzyjnej pensety są przenoszone na okrągłą

18

miedzianą lub niklową siateczkę o średnicy 3 mm, która jest odpowiednikiem szkiełka

podstawowego w MŚ.

I. Kontrastowanie - r

óżnicowanie gęstości elektronowej za pomocą soli metali ciężkich.

Skrawki na siateczkach

były już wstępnie skontrastowane przy wtórnym utrwalaniu za

pomocą czterotlenku osmu, lecz kontrast ten jest stosunkowo słaby, stąd dodatkowo

kontrastuje się je innymi solami metali ciężkich:

- octanem uranylu
- cytrynianem

ołowiu

Mikroskop elektronowy skaningowy (SEM)

- cienki

strumień elektronów nie przechodzi przez preparat, lecz odbija się od niego –

bada punkt po punkcie

powierzchnię obiektu (skanuje). Wybijane z powierzchni

elektrony są zbierane i wzmacniane, a ich obraz uwidacznia się na ekranie monitora,

-

stosuje się do badań zróżnicowania przestrzeni powierzchni, kształtu i rzeźby struktur
komórkowych i organelli

-

uzyskuje się plastyczny, niemal trójwymiarowy obraz preparatu

-

technika przygotowania materiału odmienna niż w TEM

-

do pokrywania preparatu stosuje się atomy węgla i złota

P

reparaty półcienkie

• pr

eparaty o grubości 0,5 – 2 µm

•

wykonywane za pomocą ultramikrotomu

•

z materiału pobranego i przygotowanego do badań w ME

•

przeznaczone do oglądania w mikroskopie świetlnym (MŚ)

• barwione

na szkiełku podstawowym błękitem toluidyny