215

Przegl¹d Lekarski 2001 / 58 / 4

PRACE POGL¥DOWE – REVIEW PAPERS

Ocena toksykologiczna metod

diagnostycznych stosowanych w zatruciach

œrodkami psychoaktywnymi

Toxicological evaluation of diagnostic methods used in

intoxication with psychoactive substances

Roman WACHOWIAK

Katedra i Zak³ad Medycyny S¹dowej

Akademii Medycznej im. K. Marcinkowskiego

w Poznaniu

Kierownik:

Prof. dr hab. med. Zygmunt Przybylski

Dodatkowe s³owa kluczowe:

metody analityczne

analiza zwi¹zków psychoaktywnych

zatrucia

oceny

Additional key words:

analytical techniques

psychoactive drug testing

intoxication

evaluation

Adres do korespondencji:

Prof. dr hab. farm. Roman Wachowiak

Katedra i Zak³ad Medycyny S¹dowej

Akademii Medycznej

ul. Œwiêcickiego 6, 60-781 Poznañ, POLAND

Tel./Fax: (61) 869-91-81 w. 551

e-mail: [e-mail]

Wprowadzenie

Diagnostyka toksykologiczna przypad-

ków zatruæ œmiertelnych, obok monitoringu

kontrolowanej terapii przedawkowania le-

ków (overdose drug monitoring) odgrywa

aktualnie wa¿n¹ rolê w nowoczesnej toksy-

kologii klinicznej i s¹dowej. Zapotrzebowa-

nie na tego typu badania ci¹gle wzrasta,

bowiem s¹ ono determinowane czêstotliwo-

œci¹ zatruæ zwi¹zanych z systematycznym

nadu¿ywaniem leków, w tym œrodków psy-

choaktywnych. Motywacja i celowoϾ ozna-

czania poziomów leków i ich metabolitów w

p³ynach ustrojowych w przypadku zatruæ

stanowi podstawê racjonalnego dzia³ania

terapeutycznego, a szczególnie detoksyka-

cyjnego. Koniecznoœæ okreœlenia poziomu

ksenobiotyku w p³ynach ustrojowych i tkan-

kach ma szczególne znaczenie w toksyko-

logii s¹dowej, bowiem wielokrotnie w spo-

sób obiektywny pozwala ustaliæ przyczynê i

mechanizm zgonu. Szczególne zapotrzebo-

wanie diagnostyczne dotyczy równie¿ inter-

pretacji wielu przypadków medyczno-s¹do-

wych czy klinicznych, okreœlonych jako trud-

ne, z racji m.in. nieprzytomnego stanu pa-

cjenta, przy braku jakichkolwiek informacji

dotycz¹cych okolicznoœci zdarzenia. Ko-

niecznoϾ indywidualizacji w odniesieniu do

poszczególnych stanów zatruæ pacjentów

leczonych w oddzia³ach toksykologii klinicz-

nej, wymaga specjalistycznych oznaczeñ

poziomów leków w osoczu z czêstotliwoœci¹

adekwatn¹ do istniej¹cych zagro¿eñ, wyni-

kaj¹cych z obserwacji klinicznych. Propo-

nowane metody analityczne, przeznaczone

do rutynowych oznaczeñ, powinny byæ wy-

starczaj¹co czu³e, bardzo selektywne, aby

Diagnostyka toksykologiczna przy-

padków zatruæ zwi¹zkami psychoak-

tywnymi, notowanymi w toksykologii

klinicznej i s¹dowej wymaga odpo-

wiednich badañ laboratoryjnych. Pra-

ca dotyczy oceny aktualnie u¿ywanych

metod analizy jakoœciowo-iloœciowej

badanych zwi¹zków psychoaktywnych

w materiale biologicznym. PrzydatnoϾ

najczêœciej stosowanych metod skri-

ningowych (immunochemicznych) i

potwierdzaj¹cych (fizykochemicznych)

oceniono w aspekcie kryteriów wali-

dacyjnych, dotycz¹cych specyficzno-

œci limitu detekcji i oznaczalnoœci.

Toxicological diagnosis in cases of

intoxication with psychoactive sub-

stances known in clinical and foren-

sic toxicology requires appropriate

laboratory studies. The paper pertains

evaluation of the currently employed

techniques of quantitative and quali-

tative analysis of psychoactive sub-

stances in a biological material. Use-

fulness of the most frequently applied

screening (immunochemical) ap-

proaches and the confirmation (physi-

cochemical) techniques was evaluated

against the validation criteria, relating

to the specificity, detection limit and

sensitivity of the discussed sub-

stances.

w sposób obiektywny mog³y wykazaæ zale¿-

noœæ pomiêdzy poziomem leku w osoczu, a

efektem notowanych oddzia³ywañ toksyko-

dynamicznych. PowszechnoϾ stosowania

szybkich i wiarygodnych metod analizy ja-

koœciowo-iloœciowej ksenobiotyków w p³y-

nach ustrojowych jest uzale¿niona od po-

stêpu technicznego, który w ostatnim okre-

sie jest wyraŸnie zauwa¿alny. Koszty zwi¹-

zane z zakupem odpowiedniego wyposa¿e-

nia aparaturowego i niezbêdnych odczyn-

ników, przy obecnych mo¿liwoœciach finan-

sowych wskazuj¹ na zasadnoœæ centraliza-

cji us³ug diagnostycznych u³atwiaj¹cych

szybkie, kompleksowe badanie.

Aktualnie istnieje zwiêkszone zapotrze-

bowanie w zakresie toksykologicznych ba-

dañ diagnostycznych, klinicznych, jak i s¹-

dowych, wynikaj¹ce z potencjalnego zagro-

¿enia zwi¹zanego z dystrybucj¹ i nadu¿y-

waniem leków psychoaktywnych i realizacji

za³o¿eñ Ustawy o zapobieganiu narkoma-

nii. Potwierdzeniem tych obserwacji jest

wzrost doniesieñ kazuistycznych, dotycz¹-

cych ostrych zatruæ i zgonów.

Maj¹c na uwadze koniecznoœæ wykony-

wania odpowiednich badañ diagnostycz-

nych, niezbêdnych w kompleksowej moni-

torowanej terapii zatruæ, przedstawiono tren-

dy i mo¿liwoœci analityczne, warunkuj¹ce

obiektywn¹ interpretacjê istniej¹cych zale¿-

noœci, w aspekcie wybranych zwi¹zków psy-

choaktywnych.

Wyniki badañ diagnostycznych

a uwarunkowania interpretacyjne

W rozwa¿aniach dotycz¹cych u¿ywania

œrodków psychoaktywnych (odurzaj¹cych,

216

Przegl¹d Lekarski 2001 / 58 / 4

R. Wachowiak

narkotycznych), nale¿y uwzglêdniæ cztery

dominuj¹ce grupy zwi¹zków chemicznych

wykazuj¹cych efekt oddzia³ywañ na oœrod-

kowy uk³ad nerwowy. Wskazaæ tutaj nale¿y

na nastêpuj¹ce grupy zwi¹zków:

•

narkotyczne zwi¹zki przeciwbólowe

(morfina, heroina, kodeina) i syntetyczne

analogi, np. (metadon, dolargan);

•

zwi¹zki dzia³aj¹ce depresyjnie na

oœrodkowy uk³ad nerwowy (barbiturany, ben-

zodiazepiny, tricykliczne antydepresanty,

kwas gamma hydroksymas³owy [GHB]);

•

psychostymulanty (amfetamina, ko-

kaina, efedryna, kofeina);

•

zwi¹zki halucynogenne (LSD, me-

skalina, ecstasy, psylocybina, kwas ibote-

nowy).

Powy¿szy podzia³ systemowy œrodków

psychoaktywnych zosta³ rozbudowany w

oparciu o raport Komitetu Ekspertów WHO.

Wyró¿niono w nim 8 grup zwi¹zków, które

w aspekcie oddzia³ywañ farmakologicznych

mieszcz¹ siê w wymienionym wykazie czte-

rogrupowym. Wysoka aktywnoϾ farmako-

logiczna œrodków psychoaktywnych, deter-

minowana niskimi dawkami ich za¿ywania,

przy równoczeœnie niekorzystnym wspó³-

czynniku terapeutycznym (rozpiêtoœæ miê-

dzy dawk¹ lecznicz¹ a œmierteln¹), stwarza

trudny uk³ad analityczny, zwi¹zany z wyj¹t-

kowo niskimi zakresami stê¿eñ w p³ynach

ustrojowych (10

-6

-10

-12

g/ml). Zakresy ozna-

czalnoœci uzyskane najczêœciej stosowany-

mi metodami przedstawiono na rycinie 1.

W ocenie zale¿noœci przyczynowo-skut-

kowej, obowi¹zuj¹ce miêdzynarodowe nor-

my interpretacyjne zakresów stê¿eñ tera-

peutycznych, toksycznych i œmiertelnych,

dotycz¹ wy³¹cznie krwi, jako bardziej stabil-

nego objêtoœciowo uk³adu odniesienia w

porównaniu z moczem. Poziomy stê¿eñ

najczêœciej notowanych œrodków psychoak-

tywnych oraz okresy ich biologicznego pó³-

trwania w organizmie cz³owieka, s¹ dostêp-

ne w wielu monografiach [4,8,9,13,26], czy

programach np. TOXINET (Internet), czy

MICROMEDEX (INFO TECHNOLOGY Sup-

plied Ltd.).

Wa¿nym elementem niezbêdnym w

kompleksowej ocenie analizowanych zale¿-

noœci toksykodynamicznych ksenobiotyku

jest koniecznoœæ uwzglêdnienia (udzia³u)

metabolitów – produktów ich biochemicz-

nych przekszta³ceñ. Metabolity, obok zwi¹z-

ków macierzystych, mog¹ interferowaæ za-

równo w zakresie oddzia³ywañ toksykody-

namicznych, jak równie¿ uzyskiwanego wy-

niku badañ analitycznych. Klasyczny przy-

k³ad synergistycznego oddzia³ywania karba-

mazepiny i jej aktywnego metabolitu 10,11-

epoksydu, czy oddzia³ywañ nordiazepamu,

metabolitu jego prekursorów klorazepatu,

diazepamu, chlorodiazepoksydu, jest po-

wszechnie znany [8,9,13,29]. W³aœciwa in-

terpretacja istniej¹cych oddzia³ywañ toksy-

kodynamicznych dla tych uk³adów jest mo¿-

liwa po uprzedniej selektywnej identyfikacji

i ró¿nicuj¹cej analizie iloœciowej poszczegól-

nych komponentów zawartych w p³ynach

ustrojowych. Wyniki badañ laboratoryjnych

uzyskane niespecyficznymi i tym samym

niew³aœciwymi metodami analitycznymi nie

pozwalaj¹ na obiektywn¹ interpretacjê ob-

jawów klinicznych. Mo¿liwoœæ równoczesne-

go okreœlenia poziomów zwi¹zku macierzy-

stego i jego aktywnego metabolitu we krwi

przy ich zró¿nicowanych parametrach far-

makokinetycznych (szybkoϾ eliminacji,

czas biologicznego pó³trwania, klirens), po-

zwala wyjaœniæ nietypowy przebieg klinicz-

ny zatrucia. Krytyczna ocena powinna do-

tyczyæ zawsze wyników badañ uzyskanych

niespecyficznymi metodami, np. metody

immunochemiczne mog¹ byæ sum¹ oddzia-

³ywañ interferuj¹cych pochodnych o podob-

nym uk³adzie strukturalnym, (reaktywnoœæ

krzy¿owa – cross-reactivity). Z tego te¿

wzglêdu dla danego testu oznaczanych kse-

nobiotyków uwzglêdnia siê reaktywnoœæ

krzy¿ow¹, która okreœla iloœæ wybranego

zwi¹zku interferuj¹cego, wywo³uj¹cego w

uk³adzie analitycznym tak¹ sam¹ wartoœæ

parametru pomiarowego (absorbancja), jak

wybrane stê¿enie odpowiedniego wzorca,

np. 100 mg/ml nordiazepamu w teœcie na

obecnoœæ benzodiazepin. Uzyskany wiêc

pozytywny wynik badañ immunochemicz-

nych, przy braku informacji o innych za¿y-

wanych lekach przez pacjenta, wymaga

odpowiedniej interpretacji o istniej¹cych za-

k³óceniach z mo¿liwoœci¹ wyst¹pienia wy-

niku fa³szywie pozytywnego. Przyk³adowo

fa³szywie pozytywny wynik badañ, „potwier-

dzaj¹cy” obecnoœæ tricyklicznych antyde-

presantów jest czêsto obserwowany dla

przypadków zatruæ wy³¹cznie karbamaze-

pin¹ podczas jej równoczesnej analizy

metod¹ TDx.

Z tego te¿ wzglêdu handlowa propozy-

cja wielu producentów zestawów analitycz-

nych ostrzega i okreœla prawdopodobieñ-

stwo wystêpowania reaktywnoœci krzy¿owej

wskazuj¹c na ich ograniczon¹ pewnoœæ i

skutecznoœæ analityczn¹. Powy¿sze niedo-

godnoœci sprawiaj¹, ¿e pozytywny test ba-

dañ jakoœciowych, a nawet iloœciowych, uzy-

skany metodami homogenicznymi-immuno-

chemicznymi wymaga zawsze dodatkowo

potwierdzenia innymi metodami fizykoche-

micznymi.

Diagnostyka toksykologiczna zatruæ

œrodkami psychoaktywnymi opiera siê

przede wszystkim na analizie chemicznej

materia³u biologicznego (krew, mocz, œlina,

w³osy) - zatrucia kliniczne, poszerzone do-

datkowo o tkanki (zatrucia œmiertelne). Sze-

reg uwarunkowañ sprawia, ¿e mocz okazu-

je siê wa¿nym materia³em biologicznym

przydatnym w diagnostyce toksykologicznej

[8,28].

Wiêkszoœæ dostêpnych skriningowych

metod diagnostycznych œrodków psychoak-

tywnych dotyczy wiêc ich analizy w moczu

[DAU-test – Drug of abuse urine]. Za u¿y-

ciem moczu jako preferencyjnego materia-

³u biologicznego przemawia szereg uwarun-

kowañ, wœród których mo¿na wymieniæ:

•

d³u¿szy czas przebywania ksenobio-

tyków w moczu ani¿eli we krwi, stê¿enie we

krwi jest ograniczone czasem pó³trwania

(t

1/2

);

•

wy¿sze poziomy stê¿eñ w moczu w

porównaniu z krwi¹ (LSD jest typowym przy-

k³adem);

•

nieinwazyjny sposób pobierania pró-

bek moczu do badañ.

W ostatnich latach zwrócono uwagê na

mo¿liwoœæ wykorzystania w³osów osoby

podejrzanej o d³u¿sze nadu¿ywanie leków,

w tym narkotyków jako w³aœciwego mate-

ria³u dowodowego. Badania lat 90-tych

wskazuj¹ jednoznacznie, ¿e wiêkszoœæ nad-

u¿ywanych zwi¹zków psychoaktywnych,

takich jak kokaina, heroina, amfetamina,

metadon, mog¹ byæ wykryte i oznaczone ilo-

œciowo we w³osach [14]. Kontrola przestrze-

gania okresu abstynencji w czasie leczenia

odwykowego, czy te¿ jej doraŸne przepro-

wadzenie w przypadku podejrzeñ o za¿y-

Rycina 1

Metody i zakresy najczêœciej notowanych oznaczalnoœci zwi¹zków psychoaktywnych w p³ynach ustrojowych.

Methods and ranges of detection for psychoactive drugs in body fluids.

217

Przegl¹d Lekarski 2001 / 58 / 4

wanie œrodka psychoaktywnego jest deter-

minowana okresem biologicznego pó³trwa-

nia, tj. czasokresem przebywania zwi¹zków

narkotycznych w p³ynach ustrojowych. Za-

bezpieczenie wiêc najczêœciej spotykanego

materia³u (krew, mocz) po okresie ukoñczo-

nej eliminacji narkotyku z organizmu nie

pozwala na obiektywn¹ ocenê potwierdza-

j¹c¹ za¿ycie, czy te¿ uzale¿nienie.

Homogeniczne metody analityczne

stosowne w diagnostyce zatruæ

Najbardziej przydatnymi metodami ana-

lizy jakoœciowo-iloœciowej ksenobiotyków,

stosowanymi w laboratoriach toksykologii

klinicznej i s¹dowej (szybki skrining), s¹ te

które nie wymagaj¹ odrêbnych technik izo-

lacji z materia³u biologicznego (krew, mocz,

œlina). Stosowane w tym wzglêdzie metody

homogeniczne oparte s¹ przede wszystkim

na badaniach immunochemicznych. Mo¿li-

woœæ wytwarzania przeciwcia³ dowolnych

leków w organizmie ¿ywym spowodowa³a

istotny postêp w badaniach jakoœciowo-ilo-

œciowych ksenobiotyków, a szczególnie

œrodków psychoaktywnych. Standardowy

proces otrzymywania trwa³ych po³¹czeñ

chemicznych lek-bia³ko, opiera siê na wy-

korzystaniu reaktywnych grup (karboksyko-

wych, aminowych, tiolowych, hydroksylo-

wych), które z wybranym lekiem tworz¹

czynny zwi¹zek immunologiczny – wysoko-

cz¹steczkowy hapten (immunogenic conju-

gate). Przyk³adowo, produkt po³¹czenia bia³-

ka z morfin¹ nastêpuje poprzez grupy hy-

droksylowe przy C-3 i C-6 lub heterocyklicz-

ny atom azotu tworz¹c hapten o ukierunko-

wanej zdolnoœci wytwarzania przeciwcia³ w

odniesieniu do morfiny, kodeiny czy teba-

iny. Podanie haptenu drog¹ parenteraln¹

zwierzêtom doœwiadczalnym stymuluje wy-

tworzenie wysoce specyficznych przeciwcia³

monoklonalnych, które po odpowiednim

mianowaniu mog¹ byæ wykorzystane w ana-

lizie jakoœciowo-iloœciowej danego ksenobio-

tyku [25].

Jakoœciowa i pó³iloœciowa ocena

toksykologiczna

Istotnym postêpem w szybkim skrinin-

gu toksykologicznym œrodków psychoaktyw-

nych jest u¿ycie czu³ych testów p³ytkowych,

których rozwój chronologicznie zapocz¹tko-

wa³ Abuscreen ONTRAKT firmy Roche Dia-

gnostics (test aglutynacyjny) [2]. Zasada

oznaczania testem ONTRAKT sprowadza

siê do potwierdzenia, wzglêdnie wyklucze-

nia aglutynacji uk³adu konkurencyjnej reak-

cji ksenobiotyku zawartego w badanym

materiale (mocz) i osadzonym na tzw. LA-

TEXIE z przeciwcia³ami przeciw oznacza-

nemu zwi¹zkowi. U¿ycie testu ONTRAKT

wymaga zakupu odpowiednich zestawów

np. dla wybranych grup zwi¹zków psycho-

aktywnych. Wykrywalnoœæ poszczególnych

ksenobiotyków w materiale biologicznym

jest zró¿nicowana, a o jej wymiarze decy-

duje wartoœæ stê¿enia progowego (cutoff),

powy¿ej którego odczyt nale¿y uznaæ za

pozytywny. Progowe wartoœci stê¿enia „cut-

off” dla wybranych oznaczeñ grup zwi¹zków

w odniesieniu do wybranej substancji kali-

bracyjnych oscyluj¹ w zakresie 25-1000 ng/

ml.

Istotny postêp w szybkim zró¿nicowa-

nym skriningu toksykologicznym œrodków

psychoaktywnych spowodowa³o wprowa-

dzenie przez firmê Merck zestawów anali-

tycznych TRIAGE. Zaproponowany system

pozwala dokonaæ szybkiej zró¿nicowanej

analizy jakoœciowej moczu, w kierunku sied-

miu (TM-7) czy oœmiu (TM-8) podstawowych

grup œrodków psychoaktywnych – Metadon

(MTD), benzodiazepiny (BZO), kokaina

(COC), amfetamina (AMT), kannabinole

(THC), alkaloidy grupy opium (OPI), barbi-

turany (BAR) i tricykliczne antydepresanty

(TCA).

Istot¹ dzia³ania testu jest konkurencyj-

na reakcja zwi¹zku psychoaktywnego za-

wartego w moczu z jego chemicznie znako-

wanym po³¹czeniem z koloidalnym z³otem

(koningat) o okreœlon¹ liczbê miejsc prze-

ciwcia³a umieszczonego na pasku membra-

nowym w tzw. strefie testowej p³ytki. W koñ-

cowym etapie pomiaru trwaj¹cym ok. 3-8

minut barwny pr¹¿ek w strefie testowej jest

obserwowany wówczas, gdy w badanym

moczu nie wystêpuje poszukiwany kseno-

biotyk (próba ujemna). Brak pr¹¿ka barw-

nego w strefie testowej potwierdza obecnoϾ

ksenobiotyku w próbie badanej (wynik do-

datni).

W rutynowych badaniach skriningo-

wych, obok systemu TRIAGE, u¿ywane s¹

bardzo czêsto jednostopniowe testy immu-

nochemiczne ukierunkowane na dan¹ gru-

pê zwi¹zków psychoaktywnych. Na rynku

dominuj¹ testy firm HUMAN, HYDREX, IN-

TIMEX, SYVA BEHRING.

Ostatnia pozycja firmy SYVA BEHRING

i Roche Diagnostic dotyczy jednostopniowe-

go testera kasetowego (SYVA-RADIO

TEST), kubkowego (SYVA-RAPID) oraz

ONTRAK TESTSTIK czy ONTRAK Test cup-

5, pozwalaj¹cego na równoczesn¹ identyfi-

kacjê pochodnych siedmiu lub piêciu grup

œrodków psychoaktywnych (amfetaminy,

barbiturany, benzodiazepiny, kannabinole,

kokaina, metamfetamina, opiaty, fencyklidy-

na oraz tricykliczne antydepresanty).

Metody immunochemiczne

stosowane w analizie iloœciowej

zwi¹zków psychoaktywnych

Konsekwencj¹ rozszerzenia zakresu

u¿ycia jakoœciowych metod immunoche-

micznych by³o ich przystosowanie dla ce-

lów analiz iloœciowej. Metody immunoche-

miczne nale¿¹ obecnie do najczêœciej sto-

sowanych technik homogenicznych i nie

wymagaj¹cych wstêpnej izolacji moczu czy

osocza. Mniejsze zainteresowanie dotyczy

metod radioimmunologicznych (RIA) i radio-

receptorowych (RRA), które obok koniecz-

noœci etapu rozdzia³u (metody heterogenicz-

ne) wymagaj¹ wzorca zwi¹zku znakowane-

go izotopem oraz odpowiedniego wyposa-

¿enia z racji u¿ycia izotopów promieniotwór-

czych.

Powszechnie stosuje siê dwie metody

homogeniczne, tj. enzymatyczno-immuno-

logiczn¹ (Enzyme-Multiplied Immunoasay

Technique – EMIT-SYVA) oraz immunolo-

giczn¹ metodê fluoroscencyjno-polaryzacyj-

n¹ – FPIA, TDx firmy ABBOT. Mniejsze za-

stosowanie znajduje heterogeniczna tech-

nika immunoenzymatyczna ELISA (enzyme-

linked-immunosorbent assays) w uk³adzie

analitycznym enzymu osadzonego na fazie

(solid phase enzyme immunoassay).

Zasada metody EMIT proponowanej

przez SYVA CORPORATION oparta jest na

fakcie hamowania aktywnoœci enzymu w

uk³adzie konkurencyjnego wi¹zania przeciw-

cia³a, np. wolnego leku zawartego w prób-

ce z lekiem znakowanym enzymem. Wolny

lek konkuruje z lekiem znakowanym enzy-

mem o po³¹czenia z przeciwcia³ami a ak-

tywnoϾ enzymu jest wprost proporcjonal-

ne do iloœci wolnego leku w próbce. Aktyw-

noœæ enzymu nie zwi¹zanego z przeciwcia-

³ami (najczêœciej bakteryjna dehydrogena-

za glukozo-6 fosforanowa) mierzona reduk-

cj¹ substratu NADP do NADPH jest deter-

minowana poœrednio stê¿eniem oznaczane-

go leku Ab=f (c) stê¿enie przy l = 340 nm.

Druga metoda homogeniczno-immunolo-

giczno-fluorescencyjno-polaryzacyjna

(FPIA) pozwala na okreœlenie poziomów

wybranych zwi¹zków w osoczu, surowicy

czy moczu. W uk³adzie analitycznym wystê-

puje przeciwcia³o przeciw zwi¹zkowi ozna-

czonemu, zwi¹zek oznaczony po³¹czony z

barwnikiem fluorescencyjnym (znakowany

hapten), próbka badana, w której oznaczo-

ny jest zwi¹zek (nieznakowany hapten w

roztworze buforu rozcieñczonego). W te-

stach FPIA mierzona jest emisja œwiat³a spo-

laryzowanego po uprzedniej kompetycyjnej

reakcji znakowanego i nieznakowanego

haptenu o miejsca wi¹zania w przeciwcia-

³ach. Automatyczny uk³ad rejestruj¹cy okre-

œla stopieñ depolaryzacji œwiat³a, który jest

odwrotnie proporcjonalny do wielkoœci cz¹-

steczek rotuj¹cych. Stopieñ depolaryzacji

promieniowania fluoroscencyjnego jest

wprost proporcjonalny do stê¿enia leku w

próbce biologicznej. Metoda ta jest ca³ko-

wicie zautomatyzowana i z tego wzglêdu

czêœciej stosowana w porównaniu z inny-

mi. Obie metody charakteryzuj¹ siê wyso-

k¹ oznaczalnoœci¹ i dyskusyjn¹ specyficz-

noœci¹ nie pozwalaj¹c¹ ustaliæ udzia³u po-

szczególnych pochodnych tworz¹cych dan¹

grupê. Przyk³adowo wszystkie pochodne

benzodiazepiny s¹ mniej lub bardziej czyn-

ne w teœcie immunologicznym, a uzyskiwa-

ny wynik badania jest sum¹ oddzia³ywañ w

przeliczeniu na wybran¹ pochodn¹ tzw. ka-

libratora, np. nordiazepamu. W uk³adzie

oddzia³ywañ interferencyjnych nie rzadko

mo¿e wyst¹piæ interakcja zak³ócaj¹ca przez

inn¹ strukturalnie grupê chemiczn¹ zwi¹z-

ków.

Metody heterogeniczne

potwierdzaj¹ce skriningowe wyniki

badañ immunochemicznych

Zastosowanie metod potwierdzaj¹cych

(confirmation) jest bardziej czasoch³onne i

wymaga zawsze zastosowania wstêpnej

izolacji z materia³u biologicznego. Wartoœæ

u¿ytkowa nowoczesnych metod analizy ja-

koœciowo-iloœciowej ksenobiotyków w ma-

teriale biologicznym zale¿y wiêc przede

wszystkim od wydajnoœci stosowanych me-

tod izolacji. Wœród preferowanych technik

izolacji nale¿y wymieniæ klasyczn¹ ekstrak-

cjê typu ciecz/ciecz oraz znacznie szybsz¹

i bardziej wydajn¹ z u¿yciem fazy sta³ej (so-

lid phase extraction – SPE) [1,22]. Wydaj-

ny proces izolacji klasycznej ksenobiotyku

z osocza czy moczu, po uprzednim jego

uwolnieniu z po³¹czeñ bia³ka czy koniugatu

218

Przegl¹d Lekarski 2001 / 58 / 4

R. Wachowiak

II-ej fazy metabolizacji enzymatycznej, mo¿e

byæ osi¹gniêty wy³¹cznie w warunkach w³a-

œciwego doboru pH, uwarunkowanego cha-

rakterem kwasowo-zasadowego analitu.

Znajomoœæ wartoœci pka ksenobiotyku (war-

toœæ pH, przy którym 50% zwi¹zku znajduje

siê w postaci zjonizowanej) jest w tym przy-

padku najwa¿niejszym parametrem odnie-

sienia. Przyk³adowo izolacja amfetaminy

(pka 9.9) wymaga œrodowiska o pH powy-

¿ej 11, przy którym 100% jej postaci bêdzie

woln¹ zasad¹ podatn¹ do ekstrakcji roz-

puszczalnikami organicznymi.

Efektywny, a zarazem uproszczony i

szybki proces izolacji ksenobiotyków z oso-

cza, mo¿na uzyskaæ wykorzystuj¹c depro-

tonizuj¹ce w³aœciwoœci acetonitrylu w uk³a-

dzie 1:1. Oddzielony supernatat od precy-

pitatu bia³kowego, po uprzednim wyparowa-

niu i odpowiednim rozcieñczeniu, umo¿liwia

szybk¹ analizê w uk³adach analitycznych

(HPLC, GC). Znacznie przyspieszon¹ pro-

cedurê izolacji œrodków psychoaktywnych

z materia³u biologicznego zapewnia ekstrak-

cja z u¿yciem faz sta³ych. Dyskutowane fazy

s¹ zmodyfikowanymi chemicznie postacia-

mi ¿elu krzemionkowego (zawieraj¹ m.in.

podstawione ³añcuchy wêglowodorów C

8

,

C

18

), czêsto z dodatkowymi podstawnika-

mi odpowiedzialnymi za polarnoϾ adsor-

benta. U¿ywane najczêœciej w krajowych

laboratoriach fazy sta³e s¹ produkowane

przez firmy J.T. Baker, Supelco, Varian, z

ukierunkowanym przeznaczeniem do izola-

cji zró¿nicowanych chemicznie grup œrod-

ków psychotropowych. Koniecznoœæ uzyski-

wania wyniku badañ w mo¿liwie jak najkrót-

szym czasie sprawia, ¿e aktualne trendy i

zapotrzebowania lansuj¹ szybkie metody

izolacji g³ównie z u¿yciem faz sta³ych nie

wymagaj¹cych wstêpnych etapów przygo-

towawczych (kondycjonowanie, aktywacja).

Powy¿sze oczekiwania spe³nia propozycja

firmy Varian dotycz¹ u¿ycia fazy sta³ej Ab-

selut Nexus. Procedura wykonawcza szyb-

kiej izolacji z wysok¹ wydajnoœci¹ w zakre-

sie 80-100% sprowadza siê do trzyetapo-

wego prostego postêpowania w kolejnoœci:

adsorbcja analitu z osocza, p³ukania wod¹ i

desorbcji metanolem. Uproszczone postê-

powanie ma zasadnicz¹ przewagê nad in-

nymi bardziej restrykcyjnymi i czasoch³on-

nymi. W praktyce, obok wymienionych faz

octyl -C

8

, octaldecyl –C

18

, Narc-2 (Becker)

w rutynowych badaniach w toksykologii s¹-

dowej szersze zastosowanie znajduje Extre-

lut (Merck) jako uniwersalny sorbent zwi¹z-

ków o zró¿nicowanym charakterze kwaso-

wo-zasadowym i obojêtnym [7,11].

Wspó³czesna toksykologia kliniczna czy

s¹dowa, dysponuj¹ca nowoczesnymi tech-

nikami wykrywania trucizn musi dokonaæ ich

szybkiej i pewnej identyfikacji w materiale

biologicznym na drodze trudnej i skompli-

kowanej eliminacji co najmniej kilku tysiêcy

zwi¹zków chemicznych towarzysz¹cych

¿yciu cz³owieka. Zagadnienia zwi¹zane z

szybk¹ identyfikacj¹ ksenobiotyków w ma-

teriale biologicznym dotycz¹ ci¹g³ego roz-

wijania ró¿nych metod fizykochemicznych,

tworz¹c coraz bardziej doskona³e programy

tzw. systematycznej analizy toksykologicz-

nej. W celu wyeliminowania wielu czynni-

ków zak³ócaj¹cych powtarzalnoœæ miêdzy-

laboratoryjn¹, w rutynowych badaniach tok-

sykologicznych stosuje siê korekcje para-

metrów identyfikacyjnych dla najczêœciej

stosowanych metod chromatograficznych.

Zast¹pienie przez Kovats’a [15] parametru

czasu retencji stabilnym uk³adem odniesie-

nia – indeksem retencji, da³o pocz¹tek no-

wym technikom identyfikacji zwi¹zków pro-

ponowanym przez Mofota i wspó³pracowni-

ków [1,19,20]. Podobne zasady systema-

tycznej analizy identyfikacyjnej, opartej na

bazie indeksów retencji, zaproponowano dla

metody chromatografii cieczowej HPLC

[3,5,12,17]. Chromatografia cieczowa nale-

¿y aktualnie do najbardziej przydatnych i

efektywnych metod analizy jakoœciowo-ilo-

œciowej ksenobiotyków w materiale biolo-

gicznym. Jej zastosowanie dla celów iden-

tyfikacyjnych znacznie wzros³o po wprowa-

dzeniu nowej techniki detekcji typu DIODE-

ARRAY. Zastosowanie tego typu detekcji

pozwala uzyskaæ obok sygna³u piku dane-

go zwi¹zku na chromatogramie jego widmo

UV (200-350 nm) w uk³adzie trójwymiaro-

wym, potwierdzaj¹c¹ jego jednorodnoœæ. Ta

w³aœciwoœæ detektora DIODE-ARRAY pod-

nosi znacz¹co mo¿liwoœci identyfikacji

zwi¹zków [6,11,16,18,23,24].

Komputerowe sterowanie uk³adu HPLC

zawieraj¹cego dodatkowo bank widm w

nadfiolecie, umo¿liwia szybk¹ identyfikacjê

dowolne zarejestrowanego piku badanego

zwi¹zku. Aktualnie istniej¹ gotowe progra-

my komputerowe pozwalaj¹ce na podsta-

wie banku widm (library search) dokonaæ

identyfikacji zwi¹zku ujêtego w rejestrze

danych. Wœród dostêpnych programów

uwagê zwraca propozycja handlowa firmy

Hewlett Packard – aktualny dystrybutor w

Polsce - AGILENT TECHNOLOGY, dotycz¹-

ca programu obejmuj¹cego identyfikacjê

ponad 1600 zwi¹zków (g³ównie leków i ich

metabolitów oraz pestycydów i innych), w

uk³adzie 12-blokowego podzia³u (sublibra-

ries). Niezast¹pion¹ metodê identyfikacji i

analizy iloœciowej zwi¹zków psychoaktyw-

nych jest metoda chromatografii gazowej i

spektrofotometrii masowej (GC/MS) z rów-

noczesn¹ mo¿liwoœci¹ korzystania z biblio-

teki widm masowych np. systemu HP 5997

OC MS/MD Chemistation. Wœród mo¿liwych

technik analitycznych w tym uk³adzie, za-

stosowanie znalaz³a technika pe³nego wid-

ma masowego (MID - multiple ion detection)

stosowanego dla wy¿szych stê¿eñ bada-

nych zwi¹zków. Dla przypadków ni¿szych

stê¿eñ ksenobiotyków typowych dla mate-

ria³u biologicznego zastosowanie znajduje

technika SIR (selected ion recording) czy

SIM (selected ion monitoring). Obie techni-

ki pozwalaj¹ na monitorowanie zmian inten-

sywnoœci wybranych specyficznych frag-

mentów cz¹steczki tworz¹cych widmo ma-

sowe. Uzyskane dane dla materia³u bada-

nego przy u¿yciu dowolnej techniki, mog¹

znaleŸæ potwierdzenie w komputerowym

uk³adzie porównawczym z odpowiednim

wzorcem wybranym z banku widm. Metoda

GC/MS znajduje równie¿ zastosowanie w

analizie iloœciowej [21,30]. Rutynowo, z uwa-

gi na oznaczalnoœæ, stosuje siê technikê SIM

z równoczesnym u¿yciem wzorca wewnêtrz-

nego, którym jest pochodna deuterowana

oznaczonego zwi¹zku. Kalibracja dotyczy

poœredniej zale¿noœci funkcji zró¿nicowa-

nych stê¿eñ zwi¹zku oznaczonego, wyra-

¿onego stosunkiem intensywnoœci wybrane-

go z widma jonu w odniesieniu do intensyw-

noœci okreœlonego jonu pochodnej determi-

nowanej, dodanej w sta³ym stê¿eniu do roz-

tworów wzorcowych.

Niezast¹pion¹ metod¹ stosowan¹ w tok-

sykologii s¹dowej i klinicznej jest chromato-

grafia gazowa z mo¿liwoœci¹ u¿ycia innych

detektorów ani¿eli masowy. Zastosowanie

uk³adu GLC z odpowiednim detektorem

(ECD, NPD, AFID, FID, TCD) pozwala re-

gulowaæ nie tylko oznaczalnoœæ ksenobio-

tyków, ale równie¿ zapewnia eliminacjê

mo¿liwych wp³ywów interferuj¹cych, np.

pochodz¹cych od u¿ytego rozpuszczalnika.

Ró¿norodnoœæ rozwi¹zañ technicznych,

mo¿liwoœæ wyboru odpowiednich technik

analitycznych, analiza ksenobiotyków jako

pochodnych sililowych, acetylowych, alkilo-

wych, estrowych, eliminacja t³a interferuj¹-

cych zanieczyszczeñ, predystynuj¹ chroma-

tografiê gazow¹ do podstawowych metod

badawczych stosowanych w toksykologii

[1,9,10,20].

W rutynowych badaniach toksykologicz-

nych zastosowanie znajduj¹ równie¿ inne

programy systematycznej analizy ksenobio-

tyków, wœród których wymieniæ mo¿na sys-

tem Remedi-HS (Bio-Rad Laboratories,

Hercules CA US). Program Remedi-HS

oparty jest na zasadach chromatografii cie-

czowej (HPLC) i detekcji UV. System Re-

medi-HS umo¿liwia szybk¹ analizê ok. 500

leków i ich metabolitów w uk³adzie wielo-

punktowego pomiaru UV (multiwavelenght

ultraviolet detection). Niezale¿nie od uk³a-

dów sprzê¿onych w analizie metod¹ HPLC

wykorzystuje siê zró¿nicowan¹ zdolnoœæ

detekcji, m.in. (UV, fluorescencyjnej, elek-

trochemicznej), której u¿ycie jest determi-

nowane strukturalnymi uwarunkowaniami

badanych zwi¹zków [23]. Najnowszym roz-

wi¹zaniem analitycznym jest zastosowanie

chromatografii cieczowej z spektrometri¹

masow¹ LC/MS. Osi¹gi detekcji dla ozna-

czeñ wielu zwi¹zków w tym uk³adzie s¹ ni¿-

sze ani¿eli uzyskane w systemie GC/MS i

najczêœciej wystêpuj¹ w zakresie od 10 ng/

ml. Wzglêdy ekonomiczne sprawiaj¹, ¿e

technika ta nie znajduje jeszcze powszech-

nego zastosowania i tylko nieliczne placówki

w Polsce dysponuj¹ tymi mo¿liwoœciami

analitycznymi.

Notowane wysokie poziomy ksenobio-

tyków w p³ynach ustrojowych dla przypad-

ków zatruæ przekraczaj¹cych zakres stê¿eñ

terapeutycznych stwarzaj¹ mo¿liwoœci wy-

korzystania dodatkowych metod potwierdza-

j¹cych. Najwy¿sz¹ wartoœæ u¿ytkow¹ nale-

¿y przypisaæ m.in. testom wielokrotnej ko-

rekty wartoœci RF opracowanych dla metod

chromatografii cienkowarstwowej, umo¿li-

wiaj¹cych analizê wiêkszej liczby leków

[9,10,23]. Podobne zastosowanie znajduje

system TOXI-LAB

TM

(Analytical systems,

Division of Marion Laboratories, Inc.) umo¿-

liwiaj¹cy szybki skrining (TLC) powszech-

nie nadu¿ywanych leków psychoaktywnych

i ich metabolitów w kompleksowym zesta-

wie analitycznym, zapewniaj¹cym proces

ekstrakcji, rozdzia³u i wizualizacji badanych

ksenobiotyków na chromatogramie [27].

Wspó³czesna analityka toksykologiczna

dysponuj¹ca nowoczesnymi technikami,

musi dokonaæ szybkiej i pewnej identyfika-

219

Przegl¹d Lekarski 2001 / 58 / 4

cji i analizy iloœciowej substancji toksycznej

w materiale biologicznym i stanowi integral-

n¹ czêœæ postêpowania diagnostycznego,

przydatnego w kontroli procesu skutecznej

detoksykacji. Przedstawione powy¿ej wybra-

ne zagadnienia, dotycz¹ce wykorzystania

niektórych rutynowych analitycznych metod

badawczych, stanowi¹ fragment wa¿nego

problemu zwi¹zanego z diagnostyk¹ che-

miczn¹ zatruæ, która ulega systematyczne-

mu doskonaleniu uwarunkowanego dyna-

micznym postêpem technicznym, którego

inicjacj¹ s¹ m.in. zapotrzebowania toksyko-

logii klinicznej i s¹dowej.

Wnioski

1. Systematyczny wzrost uzale¿nieñ

oraz zatruæ œrodkami psychoaktywnymi

wymaga odpowiednich metod diagnostycz-

nych, niezbêdnych w monitorowanej terapii

i skutecznej detoksykacji.

2. Homogeniczne, immunochemiczne

techniki diagnostyczne proponowane w ró¿-

nych modyfikacjach charakteryzuj¹ siê

znaczn¹ czu³oœci¹, lecz ograniczon¹ spe-

cyficznoœci¹, z racji reaktywnoœci krzy¿owej

– cross reactivity i wymagaj¹ odpowiednie-

go potwierdzenia innymi metodami badaw-

czymi.

3. Wœród rutynowych metod potwier-

dzaj¹cych nale¿y wskazaæ na chromatogra-

fiê cieczow¹ (HPLC), gazow¹ (GLC) oraz

sprzê¿one uk³ady GC/MS i LC/MS, jako

najbardziej specyficzne systemy analitycz-

ne.

4. Komputerowe programy systema-

tycznej analizy toksykologicznej zapropono-

wane dla uk³adów HPLC-DIODA ARRAY

oraz GC/MS stanowi¹ istotny postêp w szyb-

kiej i skutecznej analizie zwi¹zków psycho-

aktywnych.

Piœmiennictwo

1. Ardrey R., Moffat A.: Gas liquid chromatography

retention indices of 1318 substances of toxicological

interest on SE-30 or OV-1 stationary phase. J.

Chromatogr. 1981, 220, 195.

2. Armbruster D.A., Krolak J.M.: Screening for drug

of abuse with the Roche ONTRAKT Assays. J. Anal.

Toxicol. 1992, 16, 172.

3. Baker I., Skelton R.: Estimation of HPLC retention

indices of narcotic analgesics and related drugs. J.

Chromatogr. 1980, 18, 153.

4. Baselt R.C., Cravey R.H.: A compendium of thera-

peutic and toxic concentrations of toxicologically sig-

nificant drugs in human biofluids. J. Anal. Toxicol.

1977, 1, 81.

5. Bogusz M., Erkens M.: Reversed phase high-per-

formance liquid chromatographic data base of reten-

tion indices and UV spectra of toxicologically relevant

substances and its interlaboratory use. J. Chroma-

togr. 1994, 674, 97.

6. Bogusz M. Wu M.: Standardized HPLC-DAD sys-

tems based on retention for systematic toxicological

screening. J. Anal. Toxicol. 1991, 15, 188.

7. Breiter J., Helger R., Lang H.: Evaluation of col-

umn extraction: A new procedure for the analysis of

drugs in body fluids. Forens. Sci. 1976, 7, 131.

8. Chamberlain J.: The analysis of drugs in biological

fluids. CRP Press. Boca Ration New York, London,

Tokyo 1995.

9. Clark’s isolation and identification of drugs. Pharma-

ceutical Society, London 1986.

10. Daldrup T., Susanto F., Michalke P.: Combination

of TLC, GL and HPLC (RP 18) for rapid detection of

drugs and related compounds. Z. Anal. Chem. 1981,

308, 413.

11. Ferara S.D., Tedeschi L., Frison G., Castanga F.:

Solid phase extraction and HPLC-UV confirmation

of drug of abuse in urine. J. Anal. Toxicol. 1992, 16,

217.

12. Hill D.W., Kind A.J.: Reversed-phase solvent-gra-

dient HPLC retention indexes of drugs. J. Anal.

Toxicol. 1994, 18, 233.

13. Karch S.B.: Drug abuse handbook. CRS Press.

Boca-Raton, Boston, New York, Washington D.C.

1998.

14. Kintz P.: Drug testing in hair. CRS. Boca-Raton, New

York, London, Tokyo, 1996.

5. Kovats E.: Gaschromatographische charakteri-

sierung organischer Verbindungen. Teil 1: retentions

indices aliphatischer halogenide, alcohole, aldehyde,

und ketone. Helv. Chim. Acta 1958, 41, 1915.

16. Koves E.M., Wells B.S., Wells J.: Evaluation of a

photodiod array HPLC-based system for the detec-

tion and quantification of basic drugs in postmortem

blood. J. Forens. Sci. 1992, 37, 42.

17. Lambert W.E., Meyer E., De Leenheer A.P.: Sys-

tematic toxicological analysis of basic drugs by gra-

dient eluation of an alumina-based HPLC packing

material under alkaline condition. J. Anal. Toxicol.

1995, 19, 73.

18. Logan G.K., Stafford D.T., Tebbett J.R., Moore

C.M.: Rapid screening for 100 basic drugs and

metabolites in urine using cation exchange solid

phase extraction and high-performance liquid chro-

matography with diode array detection. J. Anal.

Toxicol. 1990, 14, 154.

19. Moffat A.C.: The standardisation of thin-layer chro-

matographic systems for the identification of basic

drugs. J. Chromatogr. 1975, 110, 341.

20. Moffat A.C.: Use of Se-30 stationary phase for the

gas-liquid chromatography of drugs. J. Chromatogr.

1975, 113, 69.

21. Mushoff F., Daldrup T.: Detection and quantifica-

tion of low concentrations of 11-nor-delta-9-tetrahy-

drocannabinol-9-carboxylic acid from minimal

amount of urine. J. Leg. Med. 1991, 104, 263.

22. Scheurer J., Moore C.M.: Solid-phase extraction of

drugs from biological tissues – a review. J. Anal.

Toxicol. 1992, 12, 264.

23. Schütz H.: Modern screening strategies in analyti-

cal toxicology with special regard to new

benzodiazepines. Z. Rechtsmedizin. 1988, 24, 19.

24. Smith R., Turdley T., Gill R., Moffat A.: The appli-

cation of retention indices using the alkylarylketone

scale to the separation of the barbiturates by HPLC.

II. The effect of the stationary phase. Chromatogr.

1984, 19, 407.

25. Smith R.N.: Radioimmunoassay of drugs in body flu-

ids in a forensic context. Forensic Science Progress

3, Springer – Verlag, Berlin, Heidelberg. 1988.

26. Stead A.H., Moffat A.C.: A collection of therapeutic,

toxic and fatal blood drug concentration in man. Hu-

man Toxicol. 1983, 3, 437.

27. TOXI-LAB screening and confirmation of drug abuse.

Analytical Systems Division of Marion Laboratories

Irvine, CA. 1987.

28. Thelander G., Jonsson J., Schuberth J.: Is urine

a suitable material for the preliminary screening of

drugs in autopsy cases. Forens. Sci. Inter. 1983, 22,

189.

29. Weaver D.F., Camfield P., Frase A.: Massive carba-

mazepine overdose. Clinical and pharmacologic

observations in five episodes. Neurology 1988, 38,

755.

30. Yinon J.: Forensic application of mass spectrometry.

CRS Press Inc. 1995, 16.