BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

1

1.

Koenzym zawierający wit. B

5

(kwas pantotenowy) -> CoA: przenośnik grup arylowych; w cyklu

kwasu cytrynowego

2.

Funkcje:

a)

ATP

– koenzym oraz nośnik energii chemicznej używanej w metabolizmie komórki. Powstaje jako

magazyn energii w procesach fotosyntezy i oddychania komórkowego. Zużywają go liczne enzymy, a
zgromadzona w nim energia służy do przeprowadzania różnorodnych procesów, jak biosyntezy,
ruchu i podziału komórki;

b)

UDP

– pochodne UDP-cukier uczestniczą w epimeryzacji cukrów i biosyntezie glikogenu,

dwucukrów (disacharydów) glukozylowych i oligosacharydów występujących w glikoproteinach i
proteoglikanach. UDP-kwas glukuronowy tworzy koniugaty wielu leków (np. aspiryny) oraz bilirubiny
w moczu.

3.

Wpływ mocznika na topnienie DNA (brak danych) + krzywe absorpcji

Wyznaczenie temperatury topnienia kwasu nukleinowego z wykorzystaniem efektu
hiperchromowego

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

2

Krzywa, przedstawiająca zależność absorbancji od temp. to „krzywa topnienia”.
Temperatura, która powoduje wzrost absorbacji równy 50% absorbancji max w czasie podgrzewania
nazywamy temp. topnienia. Max pochłaniania występuje przy 260nm.
Wyznaczenie tego pozwala nam na ocenę czystości preparatu kwasu nukleinowego – białka będące
zanieczyszczeniem mają max w 280 nm (wzrasta wartość A280/A260).

4.

Wzór inozyny

5.

Degradacja nieenzymatyczna kwasów nukleinowych może być wywoływana przez następujące

czynniki zebrane w 3 grupy:

- mechaniczne: rozcinanie, wytrząsanie, zbyt intensywne mieszanie, szybkie przemieszczanie przez
kapilary – dochodzi do tego najczęściej w czasie preparatyki;

- fizyczne: wysoka temp, promieniowanie jonizujące oraz nadfioletowe, ultradźwięki;

- chemiczne:

- hydroliza kwaśna poprzez stężone kwasy jak HClO

4

, H

2

SO

4

, trichlorooctowy (TCA).

 hydrolizują one zarówno DNA jak i RNA do wolnych zasad azotowych oraz kwasu
fosforowego, deoksyrybozy lub rybozy.

- hydrolizie zasadowej ulegają tylko RNA, w efekcie czego powstają cykliczne 2’ 3’ –
nukleozydomonofosforany.

6.

Stopień depolimeryzacji kwasów można zmierzyć badając absorbancję światła ultrafioletowego

ich roztworów.

7.

Odnośnie ułamków molowych w nici wzorcowej i komplementarnej:

A łączy się z T, natomiast G z C. Nie znając żadnej wartości oczywiście nic nie wyczarujemy. Jednak
wiemy, że suma wszystkich ułamków molowych musi się równać 1.0, dlatego znając ułamek molowy
dla A, T i G na jednej nici, bądź A, G na jednej nici i T na nici komplementarnej, zgodnie z logiką,

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

3

możemy wyliczyć ułamki molowe dla wszystkich zasad na obydwóch niciach.

Przykład 1:
Ułamek molowy na nici 1 dla A wynosi 0.24, dla T 0.26 i dla G 0.32;
Ułamek molowy dla C na nici 1 wynosi: 1.0 - (ułamek A + ułamek T + ułamek G)
1.0 - (0,24 + 0.26 + 0.32) = 0.18

Na nici 2 ułamki będą wynosiły:
A 0.26
T 0.24
G 0.18
C 0.32

Przykład 2:

Ułamek molowy na nici 1 dla A wynosi 0.28 a dla G 0.16, natomiast na nici 2 dla T ma on wartość
0.28. Jakie są wartości ułamka molowego dla wszystkich zasad na obydwóch niciach?

Jeśli na nici 2 ułamek dla T wynosi 0.28 to zgodnie z zasadą komplementarności zasad, na nici 1
ułamek ten musi wynosić 0.50 - ułamek T = 0.22. Przyjąłem wartość 0.50 ponieważ w zasadzie liczymy
jedynie stosunek A/T, który podajemy w wartości ułamka molowego. Znając ułamki molowe dla A, T i
G na nici 1 możemy wyliczyć ułamek molowy dla C na nici 1. Następnie, jak w przykładzie pierwszym,
wyliczamy ułamki molowe dla zasad na nici drugiej.

Wygląda na to, że nie da się tego wyliczyć znając jedynie ułamki molowe dwóch zasad, niezależnie od
tego, dla której nici są one podane.

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

4

8. NAD dinukleotyd nikotynoamido-adeninowy

funkcje:

NAD zależne dehydrogenazy katalizują reakcje oksydoredukcji w oksydacyjnych szlakach

metabolizmu np.: w glikolizie, cyklu kwasu cytrynowego i mitochondrialnym łańcuchu
oddechowym ,

Różne pochodne tego związku są akceptorami elektronów i protonów w procesach utleniania

komórkowego (Wiki)

Pełni też rolę koenzymów oksydoreduktaz. Wiki

NADP

fosforan di nukleotydu nikotydynoamidowo-adeninowego

funkcje:

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

5

NADP-zależne dehydrogenazy są charakterystyczne dla syntez redukcyjnych np.:

pozamitochindrialnej syntezy kwasów tłuszczowych i syntezy steroidów,

NADP jest koenzymem dehydrogenaz cyklu pentozo fosforanowego

NADP+ jest także akceptorem protonu i elektronów w reakcjach redukcji, w ten sposób

powstaje NADPH (Wiki)

Jest on następnie zużytkowywany w różnych reakcjach redukcji, głównie w przebiegu

biosyntezy kwasów tłuszczowych i cholesterolu. (Wiki)

FMN mononukleotyd flawinowy

Funkce :

Zwykle mocno (nie kowalencyjnie) związane z odpowiednim apoenzymem,

Współdziałając z oksydazą L-aminokwasową katalizuje deaminację oksydacyjną L-

aminokwasów,

stanowi grupę prostetyczną niektórych oksydaz

Zarówno FMN, jak i jego sól sodowa (FMN-Na) stosowane są jako żółte barwniki spożywcze

(oznaczane odpowiednio jako E101a i E106) (wiem co jem :D )

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

6

FAD di nukleotyd flawinoadeninowy

Funkcje

koenzym oksydoreduktaz pełniący funkcję przenośnika elektronów i protonów (kationów

wodorowych). Przenosi dwa protony i dwa elektrony, w efekcie czego utleniona forma FAD
przechodzi odwracalnie w formę zredukowaną FADH2

FAD-zależny enzym: oksydaza glukozowa ma zastosowanie przy oznaczaniu stężenia glukozy

9. II rzędowa struktura DNA

II- rzędowa struktura DNA – podwójna helisa, przestrzenne ułożenie nukleotydów

10.

Struktura DNA



Dwuniciowa helisa



Składa się z nukleotydów: zasada azotowa (puryny – A, G; pirymidyny – C, T),

deoksyryboza, reszta kwasu fosforowego



Zasady, skierowane do wewnątrz spirali, łączą obie nici miedzy sobą wiązaniami

wodorowymi (A i T dwoma; G i C trzema), wiązanie między C i G jest ok. 50%
silniejsze, dlatego obszary z dużą ilością A-T są bardziej podatne na rozluźnienie
struktury



„na zewnątrz” spirali nukleotydy połączone wiązaniem 3’,5’- fosfodiestrowym



Podwójna helisa na powierzchni posiada dwa rowki: większy i mniejszy, które różnią

się w zależności od rodzaju struktury II-rzędowej, które pięknie opisze Olek ;P. Np.
struktura B ma rowek większy o szer. 2,2 nm, mniejszy ma 1,2 nm, a struktura Z ma
tylko 1 rowek



Opisano 6 struktur II-rzędowych (A-E i Z), z czego jedynie Z jest lewoskrętna



Struktury II-rzędowe różnią się też stopniem skręcenia (skok w strukturze B wynosi

3,4 nm).

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

7

11.

Wzory i role cAMP oraz s-adenozylometioniny

cAMP

-rola cAMP: drugorzędowy przekaźnik, bierze udział w wielu funkcjach regulatorowych w
komórce(np. regulacja cAMP-zależnych kinaz białkowych), do poprawnego funkcjonowania
wystarczy b. małe stężenie w kom. (1nmol/l).

S-Adenozynometionina

-rola: aktywna forma metioniny, dawca grup metylowych w reakcji metylacji, źródło
propyloaminy do syntezy poliamin.

12. Cykliczny GMP

(cGMP: guanozyno-3’,5’-monofosforan) (Harper ’06 – 468)



powstaje z GTP przez cyklazę guanylową (reakcja analogiczna do r. katalizowanej przez
cyklazę adenylową; obie cyklazy regulowane przez efektory obejmujące hormony)



wewnątrzkomórkowy sygnał, wtórny przekaźnik (messenger) (np. NO ze śródbłonka [czynnik
relaksacyjny]  zwiększenie stężenia cGMP [drugi przekaźnik]  procesy charakterystyczne
dla rozluźnienia mięśni gładkich)



może działać antagonistycznie do cAMP

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

8

13. Rzadkie zasady

(w stosunkowo małych ilościach, oprócz głównych zasad, są w DNA i RNA

pro- i eucaryotów; szeroko rozpowszechnione w przyrodzie – mylące synonimy „podrzędne”,
„niezwykłe”)



w DNA i RNA – ważne funkcje w procesie rozpoznawania oligonukleotydów (np. odróżnienie
własnych od wirusowych i bakteryjnych)



w RNA – regulowanie długości życia cząsteczek

PIRYMIDYNY

PURYNY

N

7

-metyloguanina N

6

,N

6

-dimetyloadenina

14.

Histony – klasa, właściwości, rola

Histony – małe, zasadowe białka wchodzące w skład chromatyny, najbardziej obfite białka
chromatyny; są nieco heterogenne, składają się z wielu blisko spokrewnionych białek.

Wyróżniamy 5 klas histonów:



H1 – najbardziej zasadowy i największy z histonów, wiąże się z DNA gdy ten wchodzi i
wychodzi z rdzenia nukleosomu



H2A; H2B } bogate w lizynę



H3; H4 } bogate w argininę, ściśle konserwatywne ewolucyjnie

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

9

Ułożone kolejno histony H2A – H2B – H4 – H3 – H3 – H4 – H2B – H2A tworzą rdzeń nukleosomu.

15.

Narysuj i podaj funkcje pochodnej witaminy B2 o budowie nukleotydowej i PAPS.

Chodzi o :

Dinukleotyd flawinoadeninowy

(FAD – forma utleniona, FADH

2

– forma

zredukowana) – jest aktywną postacią ryboflawiny, powstaje w wyniku reakcji FMN z ATP,
stanowi grupę prostetyczną enzymów oksydoredukcyjnych –> flawoprotein, pełni funkcję
przenośnika elektronów i protonów.

(wzór zgodny w 100% z Harperem 1994)

PAPS (3’-fosforano-5’-fosfosiarczan adenozyny)

– donor grup siarczanowych dla

proteoglikanów.

16.

Narysować wzór nukleotydu zawierającego nikotynamid i wpisać jego pełną nazwę

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

10

NAD+ – dinukleotyd nikotynamido-adeninowy ( -OR = -OH )

NADP+ - fosforan dinukleotydu nikotynamido-adeninowego (-OR = -H

2

PO

4

)

17.

Fragment DNA przepisać na RNA

nić DNA

kodująca

5’-…ACGT…-3’

matrycowa

3’-…TGCA…-5’

Transkrypt RNA

5’-…ACGU…-3’

Transkrypt jest komplementarny do nici matrycowej (która jest odwrotnej polarności) i ma taką samą
sekwencję (po zamianie T na U) i polarność jak nić kodująca.

18. Rodzaje RNA:



informacyjne lub matrycowe RNA (mRNA) – produkt transkrypcji DNA, matryca do translacji

rybosomów



rybosomalne RNA (rRNA) – buduje podjednostki większe i mniejsze rybosomów,



transferowe RNA (tRNA) – transportuje określone aminokwasy na rybosom w procesie

transalcji, w obrębie tRNA występuje antykodon komplementarny do kodonu mRNA, miejsce
wiązania aminokwasu, ramię rybotymidowe do wiązania z rybosomem,



heterogenne jądrowe RNA (hnRNA lub pre-mRNA) – głównie produkty transkrypcji DNA i

przetwarzania surowego transkryptu do mRNA, zawiera sekwencje kodujące – egzony oraz
niekodujące – introny,



antysensowne RNA albo interferencyjne RNA (siRNA i miRNA) – produkowane w celu

precyzyjnej regulacji ekspresji genów kodujących białka (za pomocą mechanizmu wspólnego lub
bardzo zbliżonego do systemu zwalczania wirusów RNA)



małe cytoplazmatyczne RNA (scRNA) – odpowiedzialne za rozpoznawanie sygnału w

komórce,



małe jądrowe RNA (snRNA) – pełniące funkcje enzymatyczne przy wycinaniu intronów z tran

skryptów (splicing),



małe jąderkowe RNA (snoRNA) – biorące udział w modyfikacji chemicznej pre-mRNA.

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

11

19. Enzymy restrykcyjne

– (restryktazy, endonukleazy restrykcyjne) – enzymy bakteryjne

rozpoznające i hydrolizujące DNA w określonych miejscach. Są zaangażowane w obronę komórki
bakteryjnej przed wirusami.

Enzymy te rozpoznają określony odcinek łańcucha DNA i hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w

obrębie tzw. sekwencji restrykcyjnych – są to krótkie (najczęściej 4-8 par zasad), palindromowe
fragmenty (sekwencja zasad w jednej nici DNA jest taka sama jak odczytywana wspak sekwencja nici
komplementarnej). Produkty hydrolizy mogą mieć zakończenia w postaci tzw. lepkich końców
(miejsce przecięcia w obrębie jednej nici DNA jest przesunięte w stosunku do miejsca cięcia w drugiej
nici) lub tępych końców (miejsce cięcia występuje w obu niciach na tym samym poziomie).

Zastosowanie w biologii molekularnej i diagnostyce np.:



Tworzenie map restrykcyjnych cząsteczek DNA,



Analiza fragmentów restrykcyjnych w celu zdiagnozowania choroby genetycznej lub

wirusowej po zastosowaniu metody hybrydyzacji,



Wprowadzanie transgenów do wektorów w celu transfekcji lub transdukcji.

20.

Wiązania A-T i C-G

1) konfiguracja przestrzenna helisy DNA (rotacja wiązania fosfodiestrowego + ułożenie zasad
purynowych względem deoksyrybozy) powodują, że A łączy się tylko z T, a C tylko z G.
2) W cząsteczce DNA liczba A = liczbie T, liczba C = liczbie G.
3) Wiązanie A z T jest podwójne (wodorowe), a C-G jest potrójne, silniejsze o 50%.
4) DNA tym bardziej odporne na denaturację, im więcej par C-G.

21. Struktura nukleosomu

1) nukleosom składa się z oktameru histonowego i z odcinka DNA (146 par zasad, 1,75 skrętu wokół
białkowego rdzenia).
2) Oktamer histonowy: (H2A-H2B) - (H3 - H4)2 - (H2A - H2B)

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

12

3) Najważniejszy dla właściwości nukleosomu jest tetramer (H3 - H4)2 w centrum.
4) Pomiędzy nukleosomami – odcinek 30 par zasad.
5) Tworzenie nukleosomów jest wspomagane przez białko – nukleoplazminę.
6) Nukleosom chroni DNA przed działaniem nukleaz.

22. Wiązania w RNA:

- wiązania 3',5'-fosfodiestrowe między nukleotydami

- wiązania N-glikozydowe między resztami rybozylowymi i zasadami azotowymi

- wiązania wodorowe w strukturze II - rzędowej przy wewnątrzcząstkowym parowaniu zasad (3
między C i G oraz 2 między A i U)

23. Wzór DNA

- patrz pkt. 20

24. Co to jest Tm – definicja i od czego zależy

Tm – temperatura topnienia, temperatura w której połowa cząsteczek DNA uległa denaturyzacji.
(Poniżej Tm następuje renaturyzacja). Zależy od składy zasad DNA i od stężenia soli w roztworze.



GC (3 wiązania wodorowe) topią się w wyższej temperaturze niż AT (2 wiązania wodorowe)



10 krotne stężenie kationów jednowartościowych zwiększenie wartości Tm o 16,6°C



Formamid zmniejsza Tm przez destabilizację wiązań wodorowych.

25. Narysuj wykres DNA, gdy zawartość GC = 40%/70%

40% narysowane wystarczy walnąć komplementarną, a co do 70 % to analogicznie ;) P.S. Ciachnęło
tlen w ostatniej cytozynie.

26.

Denaturacja DNA

– separacja podwójnej nici DNA na dwie pojedyncze nici wskutek

zerwania więzi wodorowych pomiędzy nićmi; dwuniciowa helisa DNA jest stabilizowana przez
wiązania wodorowe między zasadami oraz solwatację – cząsteczki wody wytwarzają powłokę
dookoła cząsteczki , to właśnie te wiązania i oddziaływania trzeba przezwyciężyć, by doprowadzić do

BIOCHEMIA wejście kwasy nukleinowe – opracowanie

© gr. 3 WL I 2011-2017

13

denaturacji; dwie nici DNA ulegają wyraźnemu rozdzieleniu po inkubacji w roztworach o pH>12 i
pH<2, ze względu na jonizację zasad, przy bardzo wysokim lub niskim pH powłoka hydratacyjna
otaczająca cząsteczkę DNA ulega zaburzeniu, powodując destabilizację nakładania się par zasad,
traktowanie DNA kwasem prowadzi do depurynacji i depirymidyzacji – utraty zasad przez trawienie
wiązania glikozydowego, wiązanie fosfodiestrowe w miejscach pozbawionych zasad staje się bardziej
podatne na hydrolizę, wobec tego silne kwasy wywołują degradację DNA, ze względu na to, że
pojedyncze nici DNA są stosunkowo stabilne w środowisku alkalicznym, denaturację przeprowadza
się zazwyczaj właśnie w takich warunkach; wzrost temperatury DNA powoduje destabilizację
podwójnej helisy, ciepło zaburza zarówno wiązania wodorowe, jak i powłokę hydratacyjną,
prowadząc do zmniejszenia sił utrzymujących obie nici razem; temperaturę, w której 50% składu
próbki DNA ulega denaturacji, nazywa się temperaturą topnienia lub temperaturą mięknięcia DNA.

Renaturacja DNA

– szybkie ochłodzenie zdenaturowanej pod wpływem wysokiej temperatury

próbki DNA prowadzi do powstania nieuporządkowanej struktury, dlatego tylko powolne ochładzanie
umożliwia łączenie komplementarnych obszarów.

27. Struktury DNA:

a) jednoniciowy DNA inaczej ssDNA
b) dwuniciowy DNA w formach: A-DNA, B-DNA, C-DNA, E-DNA, H-DNA,P-DNA, Z-DNA – postaci

te odróżniają liczba par zasad, które zajmują każdy zwój, kąt między każdą par zasad,
średnica heliksu, kierunek skrętu

c) trójniciowy DNA
d) czteroniciowy DNA

B- DNA

– dominująca postać w warunkach fizjologicznych kierunek skrętu – prawy, wielkość skoku

na każdy zwój 3,4 nm, w obrębie zwoju jest 10 par zasad, średnica helisy wynosi ok. 2 nm.

28. Hydroliza enzymatyczna RNA

Rybonukleazy:



mogą występować endo i egzonukleazy.



enzymy trawienne soku trzustkowego

29. Efekt hiperchromowy

– zjawisko polegające na wzroście absorbancji DNA (lub RNA)

poddanego hydrolizie chemicznej lub enzymatycznej o 20-30% w stosunku do jego formy natywnej.
Jest to związane z tym, że w postaci natywnej uporządkowana struktura łańcuchów
polinukleotydowych i zwarte ułożenie w nich poszczególnych nukleotydów maskuje część grup
chromoforowych. Wzrost absorbancji wywołuje również ogrzewanie, które powodując denaturacje
zaburza strukturę cząsteczki.

Efekt hipochromowy

– obniżenie pochłaniania promieniowania nadfioletowego, wywołane

renaturacją cząsteczki DNA(lub RNA) poprzez obniżenie temp., co powoduje odtworzenie struktury.
Tak więc, natywne DNA/ RNA wykazuje ok. 25-35% niższa absorbancje w porównaniu z absorbancją
wszystkich składowych nukleotydów.

Wyjaśnienie: Kwasy nukleinowe maja zdolność pochłaniania światła nadfioletowego w zakresie fal
220-300nm, dzięki występującym w nich zasadom purynowym i pirymidynowym, w których są
sprzężone wiązania podwójne.