Dw. 12 Namnażanie wirusów w hodowlach komórkowych. Efekt cytopatyczny

(CPE – cytopathic effect).

Namnażanie wirusów w hodowlach komórkowych:

1.

Dobór odpowiedniej hodowli

zależy od jej wrażliwości na dany wirus, np..:

2. Bardzo ważna jest też

dawka zakaźna wirusa

, która może byd wyrażona w różnych jednostkach:

a.

TCID

50

(tissue culture infectious dose) – 50% dawka zakaźna dla hodowli komórek, czyli takie

rozcieoczenie wirusa, które wywołuje efekt cytopatyczny w 50% zakażonych hodowli komórkowych

b.

PFU

(plaque forming unit) – jednostka łysinkowa – najwyższe rozcieoczenie wirusa wywołujące

zniszczenie hodowli komórek w postaci pól zniszczenia (łysinek) dających się policzyd

c.

MOI

(multiplicity of infection) – liczba cząstek wirusa przypadających na jedną komórkę

-

Odpowiednia dawka zakaźna decyduje o koocowym mianie namnożonego wirusa.

-

W zależności od rodzaju hodowli i wirusa, namnożony patogen zbiera się po 18-120 godzinach
inkubacji w temperaturze optymalnej dla danego układu (zwykle od 26°C do 37°C).

Efekt cytopatyczny (CPE):



Efekt cytopatyczny CPE

(cytopathic effect) - zespół zmian morfologicznych i degeneracyjnych, występujących w

komórkach pod wpływem replikacji wirusa. Jest on następstwem zahamowania transkrypcji RNA oraz
syntezy białek gospodarza, jak również toksycznego wpływu białek wirusa.

 Wirusy, zaburzając prawidłowy metabolizm komórki, wywołują charakterystyczny dla danej grupy tzw. efekt

cytopatyczny - zmiana kształtu komórki, zmiany degeneracyjne jądra komórkowego, obecnośd
wewnątrzjądrowych i wewnątrzplazmatycznych wtrętów, wakuolizacja komórek i najczęściej ich rozpad

WPROWADZENIE:

• Wirus atakujący komórkę może powodowad w niej różnego rodzaju zmiany.

• Replikacja wirusa możliwa jest tylko w

komórkach wrażliwych

, czyli takich, które podtrzymują pełny cykl

replikacji – od adsorpcji i penetracji do uwolnienia zakaźnych, potomnych cząstek wirusa

• Genom wirusa wywołuje w komórce zasadnicze zmiany prowadzące do:

1.

Uszkodzenia funkcji komórki

wraz z charakterystycznymi zmianami morfologicznymi, które można

śledzid w mikroskopie elektronowym, a w koocowej fazie uszkodzenia komórki także w mikroskopie
świetlnym. Te nieodwracalne procesy zniszczenia komórki nazywamy – EFEKTEM CYTOPATYCZNYM

2.

Utrzymującego się zakażenia komórki

z nieznacznymi zmianami nie prowadzącymi do śmierci komórki.

W tym przypadku częśd komórek hodowli produkuje wirusa, a częśd pozostaje nie zakażona. Przy
podziałach komórek zakażonych wirus przechodzi do komórek potomnych.

3.

Transformacji komórek

, na przykład pod wpływem retrowirusów. Transformacja może wiązad się z

integracją genomu wirusa do genomu komórki, bez replikacji wirusa, lub może byd zachowane tworzenie
się zakaźnych wirionów.

• Zakażenie cytoidalne powoduje

nieodwracalne, poważne uszkodzenie lub zniszczenie komórki

w wyniku

zaburzeo metabolizmu komórkowego, działania białek wirusa i nowo syntetyzowanych wirionów.

•

Cytopatyczny wpływ wirusa objawia się

:

▫ Zatrzymaniem ruchu komórek
▫ Zahamowaniem podziałów komórkowych
▫ Zahamowaniem syntezy komórkowego DNA i białek
▫ Powstawaniem składników kwasochłonnych w przestrzeniach okołojądrowych – dezintegracja jądra

komórkowego

▫ Wakuolizacją cytoplazmy
▫ Degeneracją mitochondriów
▫ Uszkodzeniem błony komórkowej i całkowitym rozpadem cytoplazmy

W zależności od rodzaju wirusa obserwuje się różne zmiany w hodowlach komórek in vitro:

• zmiana morfologii komórek
• powiększenie i deformacja jądra komórkowego
• degranulacja mitochondriów
• rozpad błony komórkowej
• syncytia – wielojądrzaste komórki olbrzymie
• śmierd zainfekowanych komórek

Różne rodzaje CPE:

• Efekt cytopatyczny jest charakterystyczny dla określonej grupy wirusów.

1. Np.

infekcja wirusem VSV

(Vesicular Stomatitis Virus) prowadzi do zniszczenia komórek nie w wyniku

bezpośredniej lizy lecz przez zmiany w przepuszczalności błony komórkowej, w wyniku których komórka nie jest
odpowiednio zaopatrywana w niezbędne jej składniki tj. rybonukleotydy. Prowadzi to do zahamowania syntezy
RNA i w konsekwencji do śmierci komórki. W hodowli zainfekowanej VSV widocznymi objawami infekcji są:
skupianie się komórek w agregaty i ich odpadanie od ścian naczynia.

2.

Zakażenie adenowirusami

prowadzi do powolnych zmian cytopatycznych wyrażających się zmianą morfologii

komórek:

-

powiększenie jąder

-

degranulacja mitochondriów

-

rozpad błony komórkowej

• Zmiany te pojawiają się zwykle między 2 a 21 dniem infekcji i moment ich pojawienia się zależy od typu

wirusa. Najszybsze zmiany powoduje adenowirus typu 5 - już w 12 godzinie od zakażenia dochodzi do
całkowitego zablokowania syntezy komórkowego DNA, co jest spowodowane działaniem białek wirusowych

3. Szczególną postacią CPE jest tworzenie wielojądrzastych komórek olbrzymich -

SYNCYTIÓW

. Powstają one na

skutek naruszenia struktury lipidów błony komórkowej przez czynniki uszkadzające, obecne w osłonkach wielu
paramyksowirusów i herpeswirusów. Jądra powstałych komórek olbrzymich są zwykle uszkodzone, a czasem
nawet pozbawione błony jądrowej (tzw. nagie jądra HHV-1 i 2)

-

SYNCYTIA WCZESNE - powstają po wprowadzeniu do hodowli
dużych dawek wirusa i składają się wyłącznie z komórek zakażonych
wirusem

-

SYNCYTIA PÓŹNE - powstają po użyciu niewielkiej ilości aktywnych
wirionów i składają się zarówno z komórek zakażonych, jak i
zdrowych

Wirus odry

4. Do zniszczenia komórek dochodzi także w wyniku masowego uwolnienia potomnych wirionów, np. podczas

pączkowania

wirusów Herpes

z błony jądrowej, aparatu Golgiego, siateczki środplazmatycznej i błon

wakuolarnych

5. Charakterystyczne zmiany wewnątrzkomórkowe występują również po

zakażeniu komórek

wirusem SV40

(Simian Virus).
• Na infekcję tym wirusem komórki reagują kilkukrotnym powiększeniem swojej objętości i silną wakuolizacją

cytoplazmy.

Wtręty komórkowe:

• Ciałka wtrętowe są to skupiska replikujących się wirusów (zakażenie reowirusami) lub stanowią pozostałośd po

procesie replikacji wirusa (wirus opryszczki). Mogą one powstawad w

jądrze

(wirusy Herpes - opryszczka),

cytoplazmie

(Poxwirusy - ospa), bądź

w

obu tych strukturach jednocześnie

(Paramyksowirusy - odra).

1. Wtręty wewnątrzjądrowe:

• Typ A – wyraźnie odgraniczone od chromatyny jądrowej otaczającą je jasną

przestrzenią. Powstają one w jądrach komórek zakażonych wirusami: HHV-1 i 2, VZV

(ospa wietrzna – półpasiec), SuHV-1 (Suid herpesvirus 1 powodujący chorobę
Aujeszky’ego).

• Typ B – nie posiadają wyraźnie zaznaczonej granicy, w mniejszym stopniu zauważalne

są też zmiany morfotyczne w jądrze. Występują po zakażeniach wirusami: żółtej
febry, poliomyelitis, wschodniego i zachodniego kooskiego zapalenia mózgu.

2. Wtręty cytoplazmatyczne:

• Ciałka wtrętowe powstające w cytoplazmie są głównie pozostałością cyklu replikacyjnego wirusów i wykazują

powinowactwo do barwników kwaśnych lub zasadowych

• Ich obecnośd jest często bezspornym dowodem wystąpienia infekcji wirusowej, np.:

-

w przebiegu wścieklizny w cytoplazmie zakażonych komórek wykrywane są ciałka Babesa i Negriego

-

zaś w zakażeniach nosówką – ciałka wtrętowe Lentza

-

wtręty cytoplazmatyczne wykrywa się również w komórkach nabłonkowych po zakażeniu wirusem
krowianki, czy wirusem nagminnego zapalenia przyusznic (świnki)

•

Ciałka Negriego

– okrągławe, podobne do erytrocytów ciałka wtrętowe spotykane w cytoplazmie

neuronów okolicy hipokampa i komórek Purkiniego móżdżku w przebiegu wścieklizny

•

Ciałka Guarnieriego

– w komórkach barwią się eozyną, wyglądają jak różowe pęcherzyki w

cytoplazmie zarażonych komórek nabłonkowych, znajdowane podczas badania mikroskopowego komórek
epitelialnych u osób zarażonych wirusem z rodziny Pokswirusów (np. wirusem ospy prawdziwej lub wirusem
krowianki)

Aberracje chromosomów:

• Następstwem zakażenia komórek przez wirusy może byd również

uszkodzenie kariotypu

• Większośd stwierdzanych zmian ma charakter losowy i obejmuje pęknięcia, fragmentacje i translokacje

chromosomów

• Zmiany kariotypu wywoływane są m.in. przez

wirus odry

,

VZV

,

adenowirusy

, a także

wirusy onkogenne

• Szczególnie niebezpieczne są zmiany kariotypu powodowane przez

wirus różyczki

i

CMV

(cytomegalowirus)

,

które prowadzą do poronieo lub do powstania wad rozwojowych u dziecka

Transformacja komórek:

• Zakażenie komórki

wirusem onkogennym

nie prowadzi do jej śmierci, lecz do nabycia przez nią nowych

właściwości biologicznych, przekazywanych również komórkom potomnym

• Okres produkcji wirusa ograniczony jest tylko długością życia tej komórki

• Transformacja komórki jest uzależniona od obecności w genomie wirusa genów odpowiedzialnych za ten proces

•

Komórki transformowane cechują się

wzrostem chaotycznym i wielowarstwowym, któremu zwykle towarzyszy

utrata zdolności hamowania kontaktowego i rozchodzenia się komórek na niezasiedlone miejsca

• Zmianie podlega też

morfologia komórek i ich metabolizm

• Komórki transformowane mają

zmniejszone wymagania odżywcze na niektóre składniki

, np. surowicę

• Komórki transformowane wykazują się

zwiększoną przemianą cukrową

oraz

produkcją kwasów organicznych i

mukopolisacharydów

• Transformacja komórek często obejmuje też

występowanie losowych nieprawidłowości chromosomowych

(translokacje, inwersje i delecje), często spotykanych zwłaszcza w komórkach pewnych typów białaczek

• Do wirusów mających zdolnośd transformacji komórek prawidłowych należą np.:

EBV

(limfocyty B zakażone tym

wirusem podlegają ciągłej proliferacji), czy

onkogenne retrowirusy

(wirus mięsaka Rousa, mysiej białaczki

limfatycznej – MTLV-1)

Wirus EBV

w strefie klimatu umiarkowanego wywołuje chorobę -

mononukleozę zakaźną

, natomiast u afrykaoskich

dzieci jest przyczyną łagodnego nowotworu (

Chłoniak Burkitta

), zaś w południowych Chinach, głównie u mężczyzn

po 50 roku życia pełni rolę w

rozwoju raka jamy nosowo-gardłowej

. Około 25% chorych na chłoniaka Hodkina

posiada limfocyty B transformowane przez wirus EBV.