Biochemia: Ćw. 12 – Metoda RT-PCR

1

Ć

wiczenie 12

M

ETODA

RT-PCR

Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:

bromek etydyny

– T+

EDTA

– Xi

etanol, 96%

– F

kwas octowy, 96%

– C

β

-merkaptoetanol

– N, T

Tris

– Xi

U

WAGI WST

Ę

PNE

Praca z kwasami nukleinowymi (np. izolacja, reakcja PCR) wymaga zachowania szczególnej czystości, ponieważ kwasy nukleinowe łatwo uleqają degradacji. Dotyczy to głównie

RNA, ze względu na powszechną obecność rybonukleaz (RNaz) – enzymów katalizujących niespecyficzne rozrywanie łańcuchów rybonukleinowych. Poniżej zamieszczono kilka

uwag istotnych podczas eksperymentów, w których używamy kwasów nukleinowych.

Wszystkie czynności wykonujemy w czystych rękawiczkach, które przemywamy 70% etanolem.

Wszystkie końcówki, probówki i szkło muszą być autoklawowane.

Probówki pobieramy ze zlewki metalową pincetą, przemytą etanolem.

Izolację kwasów nukleinowych oraz przygotowanie reakcji PCR wykonujemy pod laminarem wysterylizowanym lampą UV. Miejsce do izolacji i aparat do rozdziału
elektroforetycznego przemywamy 70% etanolem.

Bufory z zestawu do izolacji, składniki zestawu do reakcji PCR, polimerazy pobieramy tylko końcówkami z filtrem.

PBS sterylizujemy przez filtrowanie (filtr o średnicy porów 0.2

µ

m); bufory z gotowych zestawów do izolacji i reakcji PCR są sterylne.

Metoda RT-PCR (ang. PCR – polymerase chain reaction, RT - reverse transcriptase) służy min. do analizy ekspresji badanego genu. Bezpośrednim i

najbardziej miarodajnym sposobem sprawdzenia, czy gen ulega ekspresji w danej komórce jest wykrycie obecności transkryptu danego genu – cząsteczek

mRNA. Technika RT-PCR składa się z dwóch etapów:

- reakcji odwrotnej transkrypcji, w której mRNA przepisywane jest na cDNA,

- amplifikacji (wielokrotnego powielenia) cząsteczek cDNA metodą klasycznego PCR.

Ostatnim etapem badania ekspresji genu jest elektroforeza produktów (amplifikatów) reakcji PCR wykonywana najczęściej w żelu agarozowym.

1.

I

ZOLACJA

RNA

NA MINIKOLUMNACH Z WYKORZYSTANIEM ZESTAWU FIRMY

Q

IAGEN

Materiał do izolacji kwasów nukleinowych stanowią skrawki tkankowe, całe narządy pobierane od zwierząt, komórki ustalonych linii komórkowych lub linii

pierwotnych hodowane in vitro w naczyniach hodowlanych (szalkach Petriego, płytkach wielodołkowych lub butelkach). Zamieszczona poniżej procedura w

punktach 1 – 4 odnosi się do komórek adherentnych hodowanych in vitro.

1. Po osiągnięciu 70 – 90% zarośnięcia naczynia hodowlanego (szalki Petriego o średnicy 6 cm) komórki przemyć zimną pożywką nie
zawierającą surowicy a następnie zimnym sterylnym PBS*.

2. Po dokładnym odciągnięciu roztworu PBS komórki zebrać sterylnym skrobakiem do probówki typu Eppendorf o poj. 1.5 ml w 350

µ

l

buforu lizującego RLT zawierającego

β

-merkaptoetanol. Tak zebrane komórki można przechowywać w temp. -70

°

C przez okres 1

miesiąca.

3. Do ekstraktów komórkowych dodać 350

µ

l 70% etanolu, zamieszać pipetą.

4. 700

µ

l mieszaniny nałożyć na minikolumnę do izolacji RNA. Po zwirowaniu (8000 RPM**, 15 s, RT***) kolumnę przełożyć do nowej

probówki wirowniczej o poj. 2 ml.

5. Dodać 700

µ

l buforu RW1, zwirować (8000 RPM, 15 s, RT).

6. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i dodać 500

µ

l buforu RPE, zwirować (8000 RPM, 15 s, RT).

7. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i dodać 500

µ

l buforu RPE, zwirować (8000 RPM, 2 min, RT).

8. Kolumnę umieścić w nowej probówce wirowniczej o poj. 2 ml i zwirować w celu wysuszenia membrany (15000 RPM, 1 min, RT).

9. Kolumnę przenieść do probówki wirowniczej o poj. 1.5 ml i dodać na membranę 30

µ

l wody wolnej od RNaz, zwirować (8000 RPM,

1 min, RT). Czynność powtórzyć nakładając na kolumnę eluat otrzymany z pierwszego wirowania.

*PBS (ang. Phosphate Buffered Saline) – zbuforowany roztwór soli fizjologicznej

**RPM (ang. Revolutions Per Minute) – liczba obrotów na minutę

***RT (ang. Room Temperature) – temperatura pokojowa

Biochemia: Ćw. 12 – Metoda RT-PCR

2

2.

O

KRE

Ś

LENIE ST

Ęś

ENIA ORAZ CZYSTO

Ś

CI

RNA

METOD

Ą

SPEKTROFOTOMETRYCZN

Ą

Kwasy nukleinowe selektywnie pochłaniają światło ultrafioletowe (UV) wykazując maksimum absorbancji przy długości fali 260 nm.

Zjawisko to znajduje zastosowanie w oznaczaniu stężenia kwasów nukleinowych, np. w preparatach kwasów nukleinowych po izolacji.

Ekstrakty kwasów nukleinowych mogą być zanieczyszczone np. białkami lub odczynnikami używanymi do izolacji. W celu określenia

czystości przygotowanego preparatu mierzy się absorbanję również przy dł. fali 280 nm, stanowiącą maksimum absorbancji dla białek.

Preparat uznaje się za czysty wówczas, kiedy stosunek wartości absorbancji A260/A280 mieści się w zakresie 1.7 – 2.0.

Wykonanie: Przygotować dwie probówki typu Eppendorf o poj. 500

µ

l. Do pierwszej (próby ślepej) dodać 100

µ

l a do drugiej 99

µ

l wody

wolnej od RNaz. Do drugiej dodatkowo 1

µ

l otrzymanego roztworu RNA. Zmierzyć absorbancję przy dł. fali 260 i 280 nm (spektrofotometr

Bio-Rad). Spektrofotometr w oparciu o zadaną wartość współczynnika konwersji (ang. conversion factor, zwykle 1:50

µ

g/ml) oraz

rozcieńczenie przelicza zmierzoną wartość absorbancji na stężenie wyrażone w [

µ

g/ml]. Wyliczona przez spektrofotometr wartość ilorazu

A260/A280 świadczy o czystości preparatu.

3.

O

DWROTNA TRANSKRYPCJA

Cząsteczki kwasu mRNA przed amplifikacją w reakcji PCR należy przepisać na cDNA (ang. complementary DNA) w procesie odwrotnej

transkrypcji z użyciem enzymu – odwrotnej transkryptazy (RT – ang. reverse transcriptase).

Wykonanie: W probówce typu Eppendorf o poj. 0.5 ml 1

µ

g RNA rozcieńczyć wodą wolną od RNaz do obj. 5

µ

l. W kolejnej probówce o

poj. 0.5 ml przygotować mieszaninę reakcyjną, składającą się z: buforu 10-krotnie stężonego, roztworu czterech

deoksyrybonukleozydotrifosforanów (dNTP), krótkich fragmentów oligodeoksyrybonukleotydowych (dT23), wody wolnej od RNaz oraz

enzymu – odwrotnej transkryptazy. Zamieszczona poniżej Tabela 1 zawiera skład mieszaniny reakcyjnej na jedną próbkę.

Tab.1 Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji odwrotnej transkrypcji.

składniki mieszaniny

objętość [

µ

l]

1.

bufor

10x stężony

2

2.

5 mM dNTP

2

3.

70

µ

M Oligo dT23

0,3

4.

woda wolna od RNaz

9,7

5.

odwrotna transkryptaza

1

6.

objętość całkowita

15

Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną: mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz w miejsce RNA.

Odwrotną transkryptazę dodać na końcu, tuż przed dodaniem mieszaniny do probówki zawierającej RNA. Po zwirowaniu, probówki

umieścić w bloku grzejnym i prowadzić reakcję zgodnie ze schematem podanym w Tabeli 2.

Tab.2. Etapy odwrotnej transkrypcji.

nazwa cyklu

temperatura

czas [min]

1.

wstępna denaturacja

65ºC

5

2.

odwrotna transkrypcja

37ºC

60

3.

przerwanie reakcji

95ºC

5

4.

koniec reakcji

4ºC

Biochemia: Ćw. 12 – Metoda RT-PCR

3

4.

A

MPLIFIKACJA C

DNA

METOD

Ą

PCR

Technika PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy lub reakcja łańcuchowa polimeryzacji) zapewnia uzyskanie w przeciągu krótkiego czasu

milionów – miliardów kopii badanego fragmentu DNA. Miejsce syntezy w cząsteczce cDNA wskazują startery – krótkie sekwencje

nukleotydowe komplementarne do początku i końca powielanego odcinka cDNA. Proces syntezy katalizowany jest przez termostabilny

enzym – polimerazę Taq.

Wykonanie: Do probówki o poj. 0.2 ml dodać 2

µ

l (300 ng) cDNA. Przygotować mieszaninę odczynników do reakcji PCR – jeden wspólny

dla wszystkich próbek danego startera. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzi: bufor (10-krotnie stężony), Q-solution, roztwór czterech

deoksyrybonukleozydotrifosforanów (dNTP), MgCl

2

(jony magnezu są kofaktorami polimerazy Taq), para starterów (R – ang. reverse i F –

ang. forward), woda wolna od RNaz oraz termostabilna polimeraza Taq. Zamieszczona poniżej Tabela 3 zawiera skład mieszaniny na

jedną próbkę.

Tab.3. Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji PCR

składniki mieszaniny

objętość [

µ

l]

1.

bufor

10x stężony

2.5

2.

Q-solution

5

3.

10 mM dNTP

1.6

4.

MgCl

2

1

5.

20

µ

M starterów R

1

6.

20

µ

M starterów F

1

7.

woda wolna od RNaz

7.65

8.

polimeraza Taq

0.25

objętość całkowita

20

Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną (mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz w miejsce cDNA).

Polimerazę Taq dodać na końcu, tuż przed dodaniem mieszaniny do probówki zawierającej cDNA. Po krótkim zwirowaniu probówki

umieścić w termocyklerze PCR i prowadzić reakcję zgodnie ze schematem podanym w Tabeli 4.

Tab.4. Etapy reakcji PCR.

nazwa cyklu

temperatura

czas [min]

1.

wstępna denaturacja

94ºC

3

2.

denaturacja

94ºC

1

3.

hybrydyzacja

temp. zależy od starterów

1

4.

wydłużanie

72ºC

2

30 - 35 cykli (pkty: 2 – 4)

5.

końcowe wydłużanie

72ºC

10

6.

koniec reakcji

4ºC

Biochemia: Ćw. 12 – Metoda RT-PCR

4

5.

E

LEKTROFOREZA AGAROZOWA PRODUKTÓW REAKCJI

PCR

Produkt reakcji PCR identyfikujemy rozdzielając uzyskany materiał w żelu agarozowym metodą elektroforezy. Równocześnie z badanym

genem rozdzielmy w żelu standardy masowe – fragmenty DNA o znanych masach cząsteczkowych wyrażonych w ilości par zasad (pz,

ang. bp). Na podstawie położenia badanego genu w stosunku do standardów masowych określamy jego wielkość.

Wykonanie

Przygotowanie 1% żelu agarozowego

Do kolby stożkowej o poj. 250 ml dodać 0.4 g agarozy oraz 40 ml buforu TAE. Dokładnie rozpuszczać agarozę ogrzewając w mikrofalówce

przez 3 – 5 min. Energicznie mieszać zawartość kolby co 1 min, w miarę możliwości nie dopuszczając do wrzenia. Złożyć podstawę na żel

z płytkami zamykającymi oraz grzebieniem do formowania studzienek. Do roztworu agarozy schłodzonego pod wodą bieżącą do temp. 50

– 60ºC dodać 2.5 µl bromku etydyny (uwaga! bromek etydyny ma działanie karcynogenne!). Dokładnie wymieszać a następnie wylać żel

na podstawę i odczekać do zastygnięcia 30 – 40 min. Wyjąć płytki zamykające podstawę z żelem oraz grzebień. Wlać do aparatu ok. 300

ml buforu TAE (40mM Tris-kwas octowy, pH 8.3, 1mM EDTA).

Przygotowanie próbek

Do sterylnej probówki typu Eppendorf o poj. 0.5 ml używając sterylnych końcówek dodać:

4 µl wody dejonizowanej,

1 µl 6x buforu do próbek (Loading Dye Solution, Fermentas),

1 µl DNA (amplifikatu uzyskanego w reakcji PCR).

Wymieszać i krótko zwirować a następnie nakładać do studzienek w żelu agarozowym.

Rozdział elektroforetyczny

Rozdział prowadzić przez 30 – 40 min przy napięciu 80V. Wynik rozdziału elektroforetycznego

analizować w transiluminatorze w świetle

UV.

Na zajęciach obowiązuje strój ochronny: chałat, rękawiczki jednorazowe oraz okulary ochronne.

Zalecana literatura:

"Biochemia" J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, PWN; W-wa 2005, podrozdział pt. "Wybrane sekwencje DNA można wielokrotnie
powielać stosując reakcję łańcuchową polimeryzacji" w rozdziale pt. "Poznawanie genów", str. 149-151 (lub odpowiedni rozdział we
wcześniejszych/późniejszych wydaniach).