Ekstrakcja w układzie

ciecz - ciecz

Czym jest ekstrakcja???

Operacja służącą do rozdzielenia

mieszanin ciał stałych i ciekłych. Rozdział
następuje przez rozpuszczenie niektórych
składników mieszaniny w cieczach, zwanych
rozpuszczalnikami. Proces ekstrakcji może
zachodzić zatem w układach dwufazowych:
ciało stałe – ciecz lub ciecz – ciecz.

W ekstrakcji siłą napędową procesu jest różnica

stężeń ekstrahowanego składnika w

rozpuszczalniku pierwotnym i rozpuszczalniku

wtórnym, zatem jest to proces dyfuzyjny.

Zjawisko przebiega tak długo, aż układ osiągnie

stan równowagi termodynamicznej.

Prawo Nernsta

Procesem ekstrakcji rządzi

prawo

prawo

podziału Nernsta, które mówi:

podziału Nernsta, które mówi:

substancja rozpuszczona dzieli

substancja rozpuszczona dzieli

się pomiędzy dwa nie mieszające się

się pomiędzy dwa nie mieszające się

rozpuszczalniki w ten sposób, że w

rozpuszczalniki w ten sposób, że w

stanie równowagi stosunek stężeń

stanie równowagi stosunek stężeń

substancji rozpuszczonej w obu

substancji rozpuszczonej w obu

rozpuszczalnikach jest stały w danej

rozpuszczalnikach jest stały w danej

temperaturze.

temperaturze.

gdzie: K

X(12)

- stała podziału substancji X pomiędzy fazy "1" i

"2" (zwana też współczynnikiem podziału), [X]

i

- stężenie

substancji X w fazie "i"

Ekstrakcja w układzie

ciecz - ciecz

•

podstawowym sposobem izolowania nielotnych

trucizn organicznych była ekstrakcja ciecz - ciecz
do nie mieszających się z wodą rozpuszczalników
organicznych.

• w toku ekstrakcji następuje:

* wyizolowanie trucizn
* oczyszczenie od matrycy biologicznej
* zatężenie
* w odpowiednio dobranych warunkach podział na
podgrupy zależnie od charakteru chemicznego

Wynikiem procesu ekstrakcji ciecz – ciecz, jest
układ dwóch nie mieszających się cieczy, które
rozdziela się najczęściej w procesie filtracji
lub odwirowania.

Ekstrakcja znalazła zastosowanie w analizie

toksykologicznej, jest metodą wyodrębniania

nielotnych organicznych i nieorganicznych

związków trujących z materiału biologicznego

.

Przygotowanie materiału

biologicznego do ekstrakcji

Odbiałczanie i odtłuszczanie:

•

stosowane różne substancje: kw. wolframowy,

nadchlorowy, trichlorooctowy, etanol, siarczan

amonowy

•

odbiałczanie prowadzone w temp. 60 – 100 stopni,

co przyspiesza proces i zwiększa rozpuszczalność w

wodzie substancji trudno lotnych

•

etap ten zapobiega przed pienieniem materiału

biologicznego, zanieczyszczeniem wyciągów

•

w celu odbiałczania stosuje się 2 metody:
- siarczanowo – wolframowa: w temp. wrzenia wody,

próbka + siarczan amonu+ 1M kwas siarkowy

(pH4). Mieszaninę ogrzewa się do wrzenia i

utrzymuje przez 3 minuty, sączy, a osad na sączku

przemywa wrzącą wodą, aż do uzyskania

odpowiedniej ilości przesączu

- metoda wolframowa:
do odbiałczania materiału biologicznego,

zawierającego trucizny o charakterze kwaśnym i
obojętnym, mniej przydatna dla związków o
charakterze zasadowym.
1 część materiału biologicznego homogenizuje się
z 1 częścią 25% roztworu wolframianu
sodowego i 1 częścią wody. Mieszaninę przenosi
się do kolby, homogenizator przepłukuje 4
częściami wody. Po dodaniu 1 części 50%
roztworu disiarczanu sodowego ogrzewa się na
łaźni wodnej, aż przestanie ciemnieć, sączy lub
wiruje. Przesącz ekstrahuje się
rozpuszczalnikami organicznymi : chloroform,
eter, octan etylu

Hydroliza

- wiele związków organicznych i ich metabolitów

wiąże się w ustroju z białkami, a także ulega

sprzęganiu z kwasem glukuronowym i

siarkowym.

- przed dokonaniem analizy należy związki te

wyodrębnić w postaci wolnej

- najczęściej wykonywana jest hydroliza kwaśna

- połączenia z kwasem siarkowym głównie typu

estrowego hydrolizują w trakcie ogrzewania z

rozcieńczonymi kwasami

- znacznie trudniej rozkładają się glukuronidy

(ich postacie estrowe- wymagają dodatku

stężonych kwasów w stosunku 1:1 w temp.

powyżej 100 stopni Celsjusza) lub rozłożone

mogą być pod wpływem glukuronidazy

(oznaczanie tą metodą morfiny, poch.

benzodiazepiny, TLPD)

- w stosunku do zasadowych leków:

amitryptylina, chloropromazyna używa się

proteazy alkalicznej.

Ekstrakcja rozpuszczalnikami

organicznymi:

-

dla zwiększenia wydajności stosuje się

kilkakrotną ekstrakcję rozpuszczalnikami
organicznymi.
- pierwsza metodę ekstrakcji do celów analizy
toksykologicznej opracował Stass (izolowanie
nikotyny z materiału sekcyjnego), później
zmodyfikował ją Otto. Stosowana od lat metoda
Stass – Otto stanowi klasyczny tok
postępowania w przypadku analizy
toksykologicznej trucizn organicznych z
materiału biologicznego.
- ekstrakcji podlegają jedynie leki i ich
metabolity znajdujące się w formie wolnej , nie
związane z białkami ani z kwasem
glukuronowym, siarkowym, glicyną.
- bezpośredniej ekstrakcji rozpuszczalnikami
organicznymi podlegają materiały z zatruć
przyżyciowych: mocz, osocze i surowica krwi,
zawartość żołądka

-

dla materiałów jak: krew pełna, tkanki i

narządy, mocz patologiczny (duże ilości białek,
barwników), żołądek wraz z zawartością (obfita,
śluzowata, tłusta), niektóre kosmetyki, leki
postępowanie jest 2 etapowe:

* izolowanie wstępne – zdolność rozpuszczania
trucizn ekstrakcyjnych w wodzie lub wodzie
zakwaszonej, etanolu lub etanolu zakwaszonym
w celu otrzymania czystego, kwaśnego,
zatężonego wyciągu nadającego się do ekstrakcji
właściwej

* właściwa ekstrakcja – poszukiwanych
związków z kwaśnego wyciągu do
rozpuszczalnika organicznego,

Wydajność ekstrakcji zależna jest od:

* współczynnika podziału substancji pomiędzy

fazą wodną (analizowany materiał) a fazę

organiczną (rozpuszczalnik użyty do ekstrakcji)

* stanu elektrochemicznego izolowanych

związków

Do rozpuszczalników organicznych przechodzą
w trakcie ekstrakcji substancje:

* obojętne
* kwasowe
*zasadowe

w formie niezdysocjowanej, bowiem
nierozpuszczalne w wodzie, lepiej rozpuszczają
się w rozpuszczalnikach organicznych, dzięki
czemu mogą być łatwiej ekstrahowane.

Związki organiczne – leki o charakterze

słabych kwasów lub zasad występują w fazie

wodnej częściowo w formie niezjonizowanej,

częściowo zjonizowanej.

Zmiana pH (alkalizacja bądź zakwaszanie)

poddawanej ekstrakcji fazy wodnej

powoduje przeprowadzenie poszukiwanej

trucizny w postać niezdysocjowaną i zależnie

od charakteru chemicznego umożliwia jej

wydajną ekstrakcję z odpowiednio dobranego

środowiska.

* związki o charakterze kwasowym

przeprowadza się w postać

niezdysocjowaną przez zakwaszenie

kwasami : winowym, solnym, fosforowym lub

siarkowym

* związki o charakterze zasadowym przez
alkalizację roztworami NaOH, KOH, Na

2

CO

3

,

NH

4

OH.

Lipofilowe substancje o charakterze obojętnym

występuje w fazie wodnej w formie

niezjonizowanej mogą być izolowane ze

środowisk o różnym pH (jeśli nie ulegają

rozkładowi pod wpływem kwasów lub alkaliów).

Na przedstawionych wyżej zasadach opiera

się ekstrakcja nielotnych trucizn organicznych

połączona z ich równoczesnym podziałem na

podgrupy zależnie od charakteru

chemicznego, co stanowi podstawę toku

postępowania w oszukiwaniu nieznanej

trucizny.

• Według Stass – Otto próbę poddaje się

kolejnym ekstrakcjom różnymi

rozpuszczalnikami organicznymi zmieniając pH

próby:

1.

eterem ze środowiska kwaśnego (pH 3 – 4),

leki kwasowe i obojętne, np. kw. salicylowy,

aspiryna, fenacetyna, barbiturany

2.

eterem ze środowiska zasadowego ( NaOH;

pH 9 –10) – leki zasadowe, np. strychnina,

papaweryna, chinina, poch. fenotiazyny. Po

wyekstrahowaniu substancji tej grupy wodny

roztwór zakwaszony kwasem solnym

alkalizujemy amoniakiem

3.

eterem ze środowiska amoniakalnego (pH 9-

10) – leki zasadowe, np. apomorfina. Ten sam

roztwór po odparowaniu eteru poddajemy

ekstrakcji gorącym chloroformem.

4.

Chloroformem ze środowiska amoniakalnego

( pH 9-10) – leki amfoteryczne, np. morfina

5. Substancje pozostałe w roztworze wodnym,

nie ekstrahujące się wymienionymi
rozpuszczalnikami organicznymi.

Zastosowanie wieloetapowego procesu

ekstrakcji umożliwia rozdzielenie trucizn na
mniejsze podgrupy, a następnie ich
wykrywanie przy zastosowaniu grupowych lub
specyficznych reakcji chemicznych, prób
biologicznych oraz metod fizycznych.

Wady klasycznej metody Stass – Otto i jej

licznych odmian:

•

długotrwały tok wyosabniania trucizny

• mała wydajność
• uzyskiwanie ekstraktów zanieczyszczonych

ciałami balastowymi

• konieczność użycia dużej ilości materiału

biologicznego

• powstawanie emulsji w toku reakcji
• niewystarczająca wykrywalność
• zużycie dużej ilości odczynników do ekstrakcji

Ekstrakcja próbki moczu

•

do 10 ml moczu należy dodać odpowiednią ilość

kw. fosforowego albo kw. winowego do uzyskania

pH3.

• następnie należy prowadzić ekstrakcje 2*30ml

eterem, połączyć wyciągi eterowe, przemyć 5 ml

wody, dodać roztwór do próbek i zachować wodny

roztwór do ekstrakcji.

• frakcja A mocnych kwasów: następnie należy

prowadzić ekstrakcje 5ml nasyconym roztworem

Na

2

CO

3

i zachować wodny roztwór do zbadania

obecności salicylanów

• frakcja B słabych kwasów: ekstrahować roztwory

eterowe 5ml 0,5M NaOH i zachować ekstrakty dla

wykazania obecności barbituranów i innych słabych

kwasów

c.d.

• obojętna frakcja C: należy przemyć roztwory

eterowe wodą, zlać pozostałość po płukaniu i

wysuszyć roztwór bezwodnym siarczanem sodu i

pozostawić do odparowania. Osad może zawierać

leki o charakterze obojętnym

• Zasadowa frakcja D: do wodnego roztworu

zachowanego po pierwszej ekstrakcji należy dodać

rozcieńczony roztwór amoniaku do uzyskania pH8.

Ekstrakcje należy przeprowadzić używając 2*10ml

chloroformu, przemyć połączone ekstrakty wodą,

przesączyć, dodać niewielką ilość kw. winowego

aby zapobiec utracie lotnych zasad. Następnie

odparować do sucha, otrzymany osad może

zawierać związki o charakterze zasadowym

• frakcja E: doprowadzić wodny roztwór

uzyskany po frakcji D do pH3 dodając kw.
solny, ogrzewać do 100 stopni przez 30 min,
oziębić i ekstrahować 2*10ml eterem.
Zachować wodny roztwór. Przemyć eterowe
ekstrakty 5ml 1M NaOH i odparować eter do
sucha. Osad może zawierać benzofenony
(frakcja E)

• Frakcja F: doprowadzić zachowany roztwór

wodny do pH 9, oziębić, ekstrahować
mieszaniną octanu etylu i izopropanolu (9:1).
Odparować warstwę rozpuszczalnika do
sucha. Osad może zawierać opiaty

Ekstrakcja zawartości

żołądka

• w celu przeprowadzenia ekstrakcji wszelkie

fragmenty kapsułek i tabletek oraz materiały
sproszkowane powinny być usunięte i zawieszone
w wodzie.

• jeśli próbka zawiera resztki pokarmu lub

wydzieliny, powstaną trwałe emulsje podczas
ekstrakcji i konieczne jest wtedy ponowne
poddanie próbki ekstrakcji.

• w celu wyekstrahowania należy dodać nadmiar

stałego siarczanu amonu z kilkoma kroplami 10%
kw.fosforowego, po czym ogrzać i dokładnie
wymieszać, a następnie odsączyć zawartość
próbki.

• przesącz jest później poddany ekstrakcji tak jak w

przypadku ekstrakcji z użyciem próbki moczu.

Ekstrakcja próbki krwi

• Ponieważ próbki krwi, osocza i surowicy są

małe i tylko niewielka ilość leków może być w
nich łatwiej wykryta i oznaczona ta metoda
ekstrakcji może nieznacznie różnić się od
ekstrakcji w moczu czy zawartości żołądka.

• Początkowa ekstrakcja jest przeprowadzana przy

pH 4 ponieważ wiele zasadowych leków jest
odzyskiwanych przez ekstrakcje chloroformem
przy tym samym pH. W rezultacie szukana
substancja będzie najprawdopodobniej w frakcji
B lub C, a przygotowanie frakcji D jest
konieczne albo do upewnienia się, że nic nie
zostało przeoczone lub jeśli lek nie został
znaleziony we frakcji C lub B

• do 4ml próbki dodać 2ml buforu fosforanowego

(pH 7,4) i 40ml chloroformu. Wstrząsnąć
energicznie, dodać ok. 2g bezwodnego siarczanu
sodu i wstrząsnąć znowu aby otrzymać stabilną
postać. Następnie należy przelać chloroform
przez sączek, ekstrahować masę 20ml
chloroformu i połączyć ekstrakty chloroformu.

• frakcja A mocnych kwasów: jeżeli salicylany są

obecne w ekstrakcie powinny zostać usunięte z

chloroformu przez ekstrakcje z Na

2

CO

3

• Frakcja B słabych kwasów: do chloroformowych

ekstraktów dodać 8 ml 0,5M NaOH , wymieszać

2minuty i odwirować. Roztwór NaOH może

zawierać barbiturany i inne słabe kwasy

• neutralna i zasadowa frakcja C: przemyć

roztwór chloroformu wodą , odsączyć i wysuszyć

bezwodnym siarczanem sodu. Przesączyć i

odparować do sucha, osad może zawierać leki

obojętne i zasadowe

• zasadowa frakcja D: jeśli odpowiednia ilość

wyjściowej próbki jest dostępna przygotować

należy kolejną ilość alkalicznego roztworu

używając rozcieńczonego roztworu amoniaku,

ekstrahować 2*10ml chloroformu, wysuszyć

chloroform bezwodnym siarczanem sodu i

odparować do sucha. Osad może zawierać leki

zasadowe

• zasadowa frakcja

D:

jeśli nie ma

odpowiedniej próbki wyjściowej potrzebnej do
ekstrakcji należy użyć następującej metody:
po zbadaniu próbki C przez metody
przedstawione poniżej należy rozpuścić
wszelkie pozostałości osadu w chloroformie i
ekstrahować 0,5M kw. siarkowym. Dodać ten
ekstrakt do masy siarczanu sodowego
zachowanej po pierwszej ekstrakcji, stworzyć
zasadowy roztwór używając rozcieńczonego
roztworu amoniaku i ekstrahować 2*10ml
chloroformu. Wysuszyć chloroform
bezwodnym siarczanem sodu i odparować do
sucha. Osad może zawierać zasadowe leki

Dziękuję 