Struktura i funkcje
jądra komórkowego i jąderka
Strukturalne uwarunkowania procesów
zachodzących w jądrze komórkowym
Hipotezy dotyczące ewolucji jądra i błony jądrowej
Składniki jądra komórkowego - DNA
cechy chemiczne
i morfologiczne
lokalizacja/funkcja
satelitarny
- wysoki stopień kondensacji
- tandemowy układ krótkich,
powtarzających się sekwencji
heterochromatyna
nie podlega
transkrypcji
rodzaj
umiarkowanie
powtarzalny
- rozmaity stopień kondensacji
- rozmaita długość sekwencji
odcinki pomiędzy
sekwencjami unikalnymi,
przerywniki
regulacja
aktywności genów
rDNA
- nieznaczny stopień kondensacji
- znaczna powtarzalność sekwencji
przewężenia wtórne
chromosomów,
czasami kariolimfa
ulega transkrypcji
na pre-rybosomy,
nie podlega translacji
inne DNA
- nieznaczny stopień kondensacji,
(luźne fibryle chromatynowe)
lub okresowo skondensowane
- unikalne sekwencje nukleotydów
euchromatyna
ulega transkrypcji,
niektóre rodzaje RNA
(mRNA) podlegają translacji
wielkość
genomu
% repetytywnego
DNA
muszka owocowa
organizm
Powtarzające się (repetytywne) DNA
% kodujących
sekwencji DNA
nicień C. elegans
pies domowy
100 MB
175 MB
2.4 GB
mysz
2.5 GB
człowiek
2.9 GB
16.5
14.0
<10
33.7 - ~57
31
1.45
40
1.40
>50
1.20
ryż
466 MB
42
11.8
kukurydza
2.5 GB
77
1
hipoteza „informatyczna”
DNA służy do przechowywania informacji:
pamięć stała – sekwencje kodujące DNA, informacja stabilna
i przekazywana kolejnym pokoleniom komórek
pamięć średnio-terminowa – za pomocą trwałych kompleksów z RNA
i białkami oraz modyfikacji chemicznych DNA (metylacja, acetylacja),
może być przekazywana potomnym komórkowm
pamięć krótko-terminowa – dynamicznie powstające kompleksy z RNA
i białkami, regulowane w czasie cyklu komórkowego i w odpowiedzi
na warunki środowiska, informatyzacja nie jest przekazywana komórkom
potomnym
wielkość
genomu
ilość genów
muszka owocowa
organizm
nicień C. elegans
100 MB
175 MB
mysz
2.5 GB
człowiek
2.9 GB
18 424
13 601
30 000.
25-35 000
u człowieka:
ok. 25 tys. genów
100-200 tys. rodzajów m-RNA
1-3 mln różnych białek
tylko
ok. 2% transkryptów cRNA koduje białka
98% transkryptów ncRNA powstaje na podstawie
tzw. strukturalnego DNA (niekodujące sekwencje)
im bardziej skomplikowany organizm tym większa ilość
strukturalnego DNA
dlaczego?
Składniki jądra komórkowego - białka
zawartość [%]
masa cząsteczkowa
[kDa]
klasy histonów
argininy
lizyny
H1
1.8
26.8
19.5-21
H2A
6.4
16.0
14.5
H2B
9.3
10.8
13.8
H3
13.3
9.6
15.3
H4
13.7
9.8
13.0
białka histonowe
post-translacyjne modyfikacje białek histonowych
kod histonowy – wzór modyfikacji post-translacyjnych obecnych
w białkach histonowych
fosforylacja
acetylacja
metylacja
ubikwitynacja
białka niehistonowe
enzymatyczne
polimerazy DNA, RNA, poli-A
terminalne nukleotydylotransferazy
ligazy, N-glikozydazy
kinazy polinukleotydowe
topoizomerazy I, II ( i )
regulatorowe
proteazy, kinazy, fosfatazy
metylotransferazy/demetylazy
acetylotransferazy/deacetylazy
syntaza poli(ADP)rybozy
glikohydrolaza
poli(ADP)rybozylowa
strukturalne
białka HMG (ang. high mobility
group)
niektóre białka enzymatyczne i
regulatorowe
Składniki jądra komórkowego - białka
Składniki jądra komórkowego - RNA
Struktura DNA
Problemy topologiczne w DNA
Poziomy organizacji chromatyny
Struktura typowego chromosomu metafazalnego
Struktura chromosomu
Modele struktury chromosomu
A
pętla chromatyny
B
pętla chromatyny związana
z siatką lamin
C
pętla chromatyny związana
ze szkieletem jądrowym
D
pętla chromatyny związana
z białkami
E-H
tworzenie struktury chromosomu mitotycznego
30 nm filamenty
60000 pętli, każda 5-150 kpz
(średnio 60 kpz)
ok. 1000-3000 miejsc replikacji
Poziomy organizacji DNA w jądrze
helisa DNA
pętla DNA
nukleosom
„chmura”
chromatyny
„obszar”
chromosomalny
1 m
Organizacja DNA w jądrze
Organizacja strukturalna por jądrowych
Schemat transportu przez pory jądrowe
Siatka lamin
Struktura błony jądrowej rozpada się i odtwarza się
Struktura jąderka
Struktura jąderka zmienia się w czasie
cyklu komórkowego
Odkryta i opatentowana w
1948
I.B. Zbarskii i
współpracownicy
Instytut Biologii Rozwoju,
Moskwa
„residual nuclear protein
fraction”
Powtórnie odkryta w 1974
R. Berezney i D.S. Coffey
„the nuclear matrix”
Macierz jądrowa
trawienie niespecyficznymi nukleazami np. DNAza I (i RNAza A)
ekstrakcja buforem z niejonowymi detergentami
ekstrakcja roztworami chlorku sodu 0.15-2 M
ekstrakcja roztworem 0.25 M siarczanu amonu
izolacja jąder komórkowych
komórka
białka
73-98%
(10-12% ogólnej zawartości białek jądrowych)
DNA
< 1%
(1-3% DNA)
RNA
0.05-1.2%
(20-30% jądrowego RNA)
fosfolipidy
0.5-7%
(2-9% fosfolipidów frakcji jądrowej)
skład macierzy bardzo zależy od sposobu jej otrzymywania !
etap tzw „stabilizacji”- jony Cu
2+
, ogrzewanie, traktowanie czynnikami stabilizującymi
mostki dwusiarczkowe
ekstrakcja dijodosalicylanem litu 25 mM (detergent)
Izolacja macierzy jądrowej
Skład macierzy jądrowej
laminy A-C
NuMA, dezmina
DNA topoizomeraza II
HMG1,2
SATB1
nukleolina
mt p53
Rb
kinaza kazeinowa 2
Białka niehistonowe, wykazujące wysokie powinowactwo do DNA:
białka blaszki jądrowej
resztkowe struktury jąderka
sieci wewnątrzjądrowej
rusztowania chromosomów (chromosome scaffold)
białka cytoszkieletu np. aktyna
Białka macierzy jądrowej
Zawartość zależy od sposobu izolacji macierzy:
hnRNA
snRNA (U1-U6 snRNA)
ślady rRNA
ok. 25% jądrowego RNA związane jest w macierzy jądrowej
RNA w macierzy jądrowej
ang. MAR, matrix associated regions, SAR, scaffold-associated regions
300-1000 pz, bogate w pary AT (średnio 70%)
nie ma sekwencji consensus, konstytutywne i funkcjonalne
przykład:
mozaika motywów TAAT, ATTA, TAAAT, ATTTTA i TAAAAT
również TGTTTTG, TTTTGGGG
polimorficzne: palindromiczne, Z-DNA
cechy strukturalne MAR:
zwiększona podatność na zaginanie DNA
zdolność do przyjmowania struktury
jednoniciowej (otwieranie struktury)
DNAza I
Rejony MAR w macierzy jądrowej
fabryka/chromomer
chromatyna/DNA
szkielet jądrowy
filamenty
pośrednie
pora jądrowa
filament
podstawowy
macierz
jądrowa
siatka lamin
Struktura chromosomu i jądra komórkowego
a macierz jądrowa
regulacja rozmieszczenia DNA w jądrze
porządkowanie struktury jądra i procesów w nim zachodzących
tworzenie continuum mechanicznego
z cytoszkieletem
Fukcjonalne znaczenie MAR
znajdują się w pobliżu lub zawierają rejony regulatorowe DNA
np. początki replikacji
rejony MAR mogą zwiększać ponad 1000-krotnie ekspresję
obcych genów
w komórkach transfekowanych
(zniesienie efektu pozycyjnego?)
macierz
pętla
nić 30 nm
Funkcje macierzy jądrowej
Model struktury jądra
umiejscowiony czy rozproszony?
Model umiejscowiony struktury jądra wskazuje na
możliwość zachodzenia/regulacji procesów jądrowych
Główne różnice pomiędzy organizacją genomu
u Prokaryota i Eukaryota
prokaryota
eukaryota
wielkość genomu
600 kb - 9.5 Mb
3 Mb - 140 000 Mb
średnia wielkość
/ilość genu(ów)
950 bp/4300
2500 bp/19 000
horyzontalne
przenoszenie genów
częste
b. rzadkie
częstość sekwencji
niekodujących
rzadkie
b. częste
występowanie
intronów
rzadkie
powszechne
występowanie
powtórzeń genów
rzadkie
powszechne
haploidia
haploidia
/poliploidia
ploidalność
liczba
chromosomów
1
>1
heterozygotyczność
nie
tak
Strukturalne uwarunkowania
procesów zachodzących w jądrze
komórkowym
W czasie replikacji DNA powinno się obracać
aby znieść wzrastającą ilość nadskręceń
Co porusza się w czasie replikacji :
kompleks polimerazy DNA czy samo DNA ?
dowód 1: system replikacyjny wirusa SV40 (antygen T)
dowód 2:
Istnienie kompleksów replikacyjnych
wykazano również w komórkach
Podobne pytania stawiano
nt. kompleksu transkrypcyjnego
Podczas procesu transkrypcji polimeraza RNA
i/lub matryca DNA muszą wykonywać
bardziej skomplikowane ruchy względem siebie
Istnieje analogia w ruchu kompleksu transkrypcyjnego
i układu śruba-nakrętka
Pozostaje jeszcze problem replikacji miejsc
gdzie spotykają się kompleksy replikacyjne
Problem replikacji końców liniowych cząsteczek DNA