Kataliza kowalencyjna
Mechanizm działania alfa-amylazy
Grupy funkcyjne i ich modyfikacje
Kataliza kowalencyjna
Mechanizm działania alfa-amylazy
Grupy funkcyjne i ich modyfikacje
Kataliza kowalencyjna
Enzymy wykorzystują nukleofilowe łańcuchy
boczne aminokwasów w miejscu aktywnym do
tworzenia wiązań kowalencyjnych
z substratem.
Przebieg hydrolizy wiązania
peptydowego z udziałem proteaz
serynowych
Utworzenie
kompleksu
enzym-substrat
Kowalencyjne
związanie seryny
z substratem, z
wytworzeniem
nietrwałego
związku
przejściowego
Rozszczepienie
wiązania C-N w
związku
przejściowym i
odłączenie
produktu
pierwszego
Przyłączenie
cząsteczki wody
Wytworzenie
drugiego związku
przejściowego
Rozpad drugiego
związku
pośredniego
Rozpad kompleksu
enzym-produkt II z
uwolnieniem
peptydu
Mechanizm działania alfa
amylazy
amylaza
maltotrioza
maltoza
glukoza
Hydroliza wielocukrów przebiega w sposób
dwuetapowy
Alfa-amylaza działa:
-
dekstrynująco
-
scukrzająco
Grupy funkcyjne biorące udział
w procesie katalizy
grupy funkcyjne aminokwasów
„kontaktowych”
grupy pomocnicze występujące w
centrum aktywnym
grupy stabilizujące określoną strukturę
enzymów
Modyfikacje struktury enzymów
Cel:
Określenie rodzaju i liczby wszystkich grup niezbędnych
do aktywności;
Wyróżnienie tych grup czynnych, które zlokalizowane są w
centrum aktywnym.
chemiczne przekształcenie grup funkcyjnych w inne grupy
Drogi modyfikacji:
Selektywne znakowanie (modyfikacje) grup funkcyjnych w
centrum aktywnym;
Modyfikacje wszystkich dostępnych grup funkcyjnych w
enzymie.
Modyfikacje z odczynnikami
nieselektywnymi
Stosuje się chemiczne substancje modyfikujące
wszystkie dostępne dla nich grupy funkcyjne w
enzymie.
badanie zależności pomiędzy rodzajem i liczbą
zmodyfikowanych grup funkcyjnych, a aktywnością
enzymu
Wady:
•
pewne grupy funkcyjne mogą być zamaskowane
•
reaktywność grup funkcyjnych zależna od ich udziału
w innych wiązaniach
•
dostępność grup względna – zależy od warunków
i odczynnika
Kinetyczne sposoby oceny
modyfikacji
Kinetyczna analiza utraty aktywności,
metoda Raya i Koshlanda:
A/A
0
= X
1
/X
1o
+ X
2
/X
2o
+ ... X
n
/X
no
A
0
- aktywność w czasie zerowym
A - aktywność w czasie t
X
1o
, X
2o
, X
no
- stężenie odpowiednich aminokwasów w czasie
zerowym
X
1
, X
2
, X
n
- stężenia odpowiednich aminokwasów (w stanie
niezmodyfikowanym) po czasie t
założenie: przebieg modyfikacji opisuje równanie reakcji
pierwszego rzędu (nadmiar odczynnika modyfikującego lub
jego stałe stężenie)
Modyfikacje z odczynnikami
selektywnymi
Podstawowe informacje:
Stosujemy substraty w odpowiednio dobranych
warunkach;
Możliwość stosowania związków podobnych do
substratów – pseudosubstraty lub inne;
Istotne jest ‘affinity labeling’ – powinowactwo
do miejsca wiążącego w enzymie
Możliwość badania struktury 1-rzędowej wokół
zmodyfikowanych aminokwasów