

Kataliza kowalencyjna



Mechanizm działania alfa-amylazy



Grupy funkcyjne i ich modyfikacje

Kataliza kowalencyjna

Enzymy wykorzystują nukleofilowe łańcuchy

boczne aminokwasów w miejscu aktywnym do

tworzenia wiązań kowalencyjnych

z substratem.

Przebieg hydrolizy wiązania
peptydowego z udziałem proteaz
serynowych



Utworzenie
kompleksu
enzym-substrat



Kowalencyjne
związanie seryny
z substratem, z
wytworzeniem
nietrwałego
związku
przejściowego



Rozszczepienie
wiązania C-N w
związku
przejściowym i
odłączenie
produktu
pierwszego



Przyłączenie
cząsteczki wody



Wytworzenie
drugiego związku
przejściowego



Rozpad drugiego

związku

pośredniego



Rozpad kompleksu

enzym-produkt II z

uwolnieniem

peptydu

Mechanizm działania alfa
amylazy

amylaza

maltotrioza

maltoza

glukoza



Hydroliza wielocukrów przebiega w sposób
dwuetapowy



Alfa-amylaza działa:

-

dekstrynująco

-

scukrzająco

Grupy funkcyjne biorące udział

w procesie katalizy



grupy funkcyjne aminokwasów
„kontaktowych”



grupy pomocnicze występujące w
centrum aktywnym



grupy stabilizujące określoną strukturę
enzymów

Modyfikacje struktury enzymów

Cel:



Określenie rodzaju i liczby wszystkich grup niezbędnych

do aktywności;



Wyróżnienie tych grup czynnych, które zlokalizowane są w

centrum aktywnym.



chemiczne przekształcenie grup funkcyjnych w inne grupy

Drogi modyfikacji:



Selektywne znakowanie (modyfikacje) grup funkcyjnych w

centrum aktywnym;



Modyfikacje wszystkich dostępnych grup funkcyjnych w

enzymie.

Modyfikacje z odczynnikami

nieselektywnymi

Stosuje się chemiczne substancje modyfikujące

wszystkie dostępne dla nich grupy funkcyjne w

enzymie.



badanie zależności pomiędzy rodzajem i liczbą

zmodyfikowanych grup funkcyjnych, a aktywnością

enzymu

Wady:

•

pewne grupy funkcyjne mogą być zamaskowane

•

reaktywność grup funkcyjnych zależna od ich udziału

w innych wiązaniach

•

dostępność grup względna – zależy od warunków

i odczynnika

Kinetyczne sposoby oceny
modyfikacji

Kinetyczna analiza utraty aktywności,

metoda Raya i Koshlanda:

A/A

0

= X

1

/X

1o

+ X

2

/X

2o

+ ... X

n

/X

no

A

0

- aktywność w czasie zerowym

A - aktywność w czasie t
X

1o

, X

2o

, X

no

- stężenie odpowiednich aminokwasów w czasie

zerowym

X

1

, X

2

, X

n

- stężenia odpowiednich aminokwasów (w stanie

niezmodyfikowanym) po czasie t

założenie: przebieg modyfikacji opisuje równanie reakcji

pierwszego rzędu (nadmiar odczynnika modyfikującego lub

jego stałe stężenie)

Modyfikacje z odczynnikami

selektywnymi

Podstawowe informacje:



Stosujemy substraty w odpowiednio dobranych
warunkach;



Możliwość stosowania związków podobnych do
substratów – pseudosubstraty lub inne;



Istotne jest ‘affinity labeling’ – powinowactwo
do miejsca wiążącego w enzymie



Możliwość badania struktury 1-rzędowej wokół
zmodyfikowanych aminokwasów