Model kinetyki enzymów zaproponowany

przez Michaelisa i Menten (M-M)

(1913r)

k

1

k

2

Jak wpływa stężenie enzymów [E] na szybkość katalizy
enzymatycznej?

Definicja -

szybkość katalizy (V) to

przyrost ilości substratu w czasie

.

Wyrażany ją jako liczbię
moli produktu na 1 sekundę (mol

-1

x s

-1

). Przy stałym

stężeniu enzymu i niskich

stężeniach substratu [S]

V

rośnie proporcjonalnie do stężenia substratu. Przy
dużym [S] jest prawie niezależne od jego ilości. Model
M-M zakłada, iż w procesie tym istnieje stan
przejściowy/pośredni

ES

stanowiący

kompleks enzymu

i substratu

. Model ten w najprostszej postaci opisuje

proces katalizy enzymatycznej w następujący sposób.

E + S ES E + S

k

1

wyraża stałą szybkości tworzenia kompleksu ES,

k

2

określa stałą szybkości rozpadu ES na

E + S,

k

3

to stała szybkości

uwalniania produktów z ES.

k

3

Musimy znaleźć następujące wyrażenia, które opisują
związek między szybkością reakcji V z 1/ stężeniem
substratu
[S]; ...........................
..........2/ stężeniem enzymu [E]
.....................................3/ z szybkościami
poszczególnych etapów reakcji. Szybkość katalizy równa
się iloczynowi stałej k

3

i stężenia kompleksu ES

to V = k

3

x

[ES]

Szybkość tworzenia kompleksu ES to k

1

x

[E] [S];

Szybkość rozpadu ES to (k

2

+

k

3

)

x

[ES].

W stanie równowagi steady state kiedy stężenie
intermediatów nie zmienia się a zmienia się ilość
substratów i produktów szybkość tworzenia i rozpadu
kompleksu ES jest taka
sama. ...................................k

1

x

[E] [S] = (k

2

+ k

3

) x [ES] - przekształcamy równanie

względem [ES]

[ES] = [E] [S] / {(k

2

+ k

3

)/ k

1

}

Zastępujemy iloczyn (k

2

+ k

3

)/k

1

przez stałą

K

M

zwaną stałą Michaelisa

,

a więc

K

M

= (k

2

+ k

3

)/k

1

.

K

M

umieszczamy w

poprzednim równaniu, które przyjmuje postać:

[ES] = [E] [S] /

K

M

Licznik równania

-

Jeśli stężenie enzymu

jest dużo mniejsze od stężenia substratu to
stężenie nie związanego substratu

[S]

jest prawie

równe całkowitemu stężeniu substratu, podczas
gdy stężenie nie związanego enzymu

[E]

równa

się różnicy między całkowitym stężeniem enzymu

[ET]

i kompleksu ES

E = [ET] – [ES] Podstawiamy to wyrażenie
zamiast [E]

i otrzymujemy równanie [ES] = ([ET] – [ES]) /
[S] /

K

M

Rozwiązujemy go względem [ES]

i otrzymujemy: ES = [ET]

Lub:

[S]/K

M

1 + [S] /
K

M

ES = [ET]

Wyrażenie [ES] podstawiamy do równania V = k

3

x

[ES]

V = k

3

[ET]

Szybkość maksymalną reakcji

V

max

uzyskuje

reakcja wtedy gdy każda cząsteczka enzymu i
wszystkie miejsca aktywne są wysycane substratem

a wtedy [S] jest dużo większe od K

M

w takim razie

[S]/[S] + K

M

jest bliskie

1

.

Więc

V

max

= k

3

[ET] .

Podstawiając

V

max

do poprzedniego

równaniu otrzymujemy równanie Michaelisa-
Menten -

V = V

max

[S]/K

M

[S] / K

M

[S]

[S] /
K

M

[S]

[S] /
K

M

Równanie M-M opisując następujące parametry
kinetyczne enzymu wskazuje, że:

1.

Jeśli

stężenie substratu [S] jest znacznie mniejsze od K

M

to szybkość reakcji V = [S] V

max

/ K

M

co oznacza, że

szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia
substratu.

2.

Przy dużych

stężeniach substratu większych od K

M

, V = V

max.

W

tym przypadku szybkość reakcji nie zależy już od
stężenia substratu ponieważ jest

maksymalna

.

3.

K

M

opisuje również szczególną sytuację, w której

[S] = K

M

wtedy szybkość działania enzymów [V] o

kinetyce M-M będzie równa

½ szybkości

maksymalnej V

max

!! Wynika to

z następującego rozumowania:

Jeśli

V = V

max

a

K

M

= [S]

to

V

max

więc

V= 1/2 V

max

[S]

[S] /
K

M

[S]

[S] /
[S]

Definicja:

Stała Michaelisa to takie stężenie substratu

przy którym enzym osiąga połowę szybkości
maksymalnej. Wyrażamy ją w
molach na dcm

3/

[mol/dcm

3

].

K

M

charakteryzuje specyficzność substratową a nie

powinowactwo enzymu do substratu i dla większości
enzymów zawiera się w przedziale 10

-1

do 10

-7

M.

Wartość K

M

zależy od

temperatury i stężenia jonów (siły jonowej).
W standardowych warunkach nie
opisuje jednak powinowactwa enzymu do substratu!!.

I.

K

M

oznacza stężenie substratu w którym połowa

miejsc

aktywnych jest obsadzona. Znając wartość tej

stałej możemy

obliczyć ułamek obsadzonych miejsc ƒ

ES

posługując

się

następującym wzorem:

ƒ

ES

= V/ V

max

=

Znaczenie wartości K

M

i V

max

[S]

[S] /
[S]

II. Z definicji K

M

wiąże się ze stałymi szybkości

reakcji ponieważ
K

M

=

k

2

+ k

3

/ k

1.

Jeśli jednak k

2

jest >>> k

3

to

dysocjacja
kompleksu ES do E + S jest szybsza od tworzenia
E + P możemy
więc powiedzieć, że K

M

= k

2

/k

1.

Oznacza to, że w

tych
warunkach

K

M

jest równe stałej dysocjacji

kompleksu ES
bowiem:

Jest więc miarą siły tworzenia kompleksu ES i
decyduje o
stabilności tego kompleksu.

K

ES

=[S][E]

[ES
]

=
k

2

/k

1

Duże K

M

oznacza więc słabe wiązanie, a małe silne

wiązanie substratu do enzymu. Może określić jego
powinowactwo do substratu tylko w takim
przypadku kiedy k

2

jest wielokrotnie większe od k

3

.

Liczba obrotów enzymu

Liczba obrotów enzymu

to liczba cząsteczek substratu

przekształcona w produkt reakcji w jednostce czasu w

warunkach pełnego wysycenia enzymu

. Jej wartość jest

równa stałej k

3

zgodnie z równaniem: V

max

=

k

3

[ET]. Jeśli stężenie miejsc aktywnych [ET] jest znane

to V

max

ujawnia liczbę obrotów enzymu.

Jak obliczamy stężenie miejsc

aktywnych?

Enzymy o kinetyce M-M mają jedno miejsce aktywne na

cząsteczkę

enzymu.

A/ Do tej analizy możemy stosować tylko jednorodny

preparat

enzymu.

B/ Musimy znać stężenie białka tego enzymu w

analizowanym

roztworze.

C/ Jego masę molowa (cząsteczkową).

Dzieląc ilość białka w preparacie przez masą
cząsteczkowa obliczymy ilość cząsteczek enzymu.
Znając liczbę cząsteczek w
mieszaninie reakcyjnej oraz ilość powstającego
produktu w jednostce czasu wyliczymy ile produktu
powstało z udziałem jednej cząsteczki enzymu w
ciągu sekundy.

Np. 10

-6

M anhydrazy węglanowej w warunkach

wysycenia substratem katalizuje syntezę 0,6M
H

2

CO

3

/sekundę oznacza to, że k

3

= 6 x 10

5

s

-1

. Jeden

cykl katalityczny przebiega w ciągu 1,7s.
Perfekcja kinetyczna – kryterium K

kat

/K

M

Jeśli stężenie substratu [S] jest wielokrotnie większe
od K

M

to szybkość reakcji jest równa k

3.

Jednak w

warunkach fizjologicznych enzymy nie są wysycone
substratem a stosunek [S]/K

M

= od 0,1 do 1,0.

Gdy

stężenie [S] jest znacznie mniejsze od

k

3

=

V

max

[ET
]

K

M

to szybkość reakcji jest wielokrotnie mniejsza od k

3

.

Jak możemy opisać kinetykę tych enzymów w takich
warunkach? Jakie liczby ją opiszą. Przypomnijmy
równania 1/ [ES] = [E] [S] / K

M

;

i 2/

V = k

3

x [ES]. Oba równania możemy połączyć

i otrzymamy

V= (k

3

/K

M

) [E][S],

a gdy [S] jest <<<K

M

to stężenie wolnego enzymu [E]

jest bliskie całkowitemu stężeniu enzymu [ET], więc

V = (k

3

/K

M

) [S] [ET]

Tak więc gdy [S] jest wielokrotnie mniejsze od K

M

szybkość reakcji zależy od wartości

k

3

/K

M

oraz od

[S]

!!

Co ogranicza tę szybkość?

Wiemy, że stosunek k

3

/K

M

zależy od k

1

, k

2

i k

3

bowiem

K

M

= (k

2

+ k

3

)/ k

1

więc po uwzględnieniu

tej zależności

otrzymujemy

k

3

/K

M

= k

3

k

1

/(k

2

+ k

3

)

Załóżmy, że k

3

jest znacznie większe od k

2

to wartość k

2

możemy pominąć i wtedy iloraz k

3

/K

M

zbliża się do

wartości k

1

.

To oznacza, że górna granica wartości k

3

/K

M

zbliża się do k

1.

A stała k

1

określa nam szybkość tworzenia

kompleksu ES. Jaką wartość może osiągnąć ta stała
szybkości? Nie może być ona większa niż kontrolowana
przez dyfuzje szybkość –częstotliwość z jaka spotykają
się enzym i substrat!!! Zakładając, że każde spotkanie
jest efektywne !!! Wartość ta wynosi 10

8

– 10

9

M

-1

s

-1

.

Ograniczenie to dotyczy wszystkich enzymów.
Kryterium K

kat

/K

M

Rozpatrzy co się dzieje jeśli, przeciwnie, substrat jest w
stężeniu, które wysyca całkowicie enzym o mechanizmie
reakcji bardziej złożonym niż ten który omawialiśmy. W
tym przypadku maksymalna szybkość enzymu oznaczona
jako k

kat

zależy nie tylko od k

3

lecz od innych stałych

szybkości. Dla tych enzymów odpowiednim parametrem
kinetycznym jest k

kat

/K

M.

Dla szczególnie perfekcyjnie i

szybko działających enzymów wartość ta wynosi 10

8

–

10

9

M

-1

s

-1

, a ich szybkość ogranicza tylko szybkość

efektywnych zderzeń. Dalszy wzrost szybkości enzymy
osiągają przez skrócenie czasu dyfuzji. Jak?