Laboratorium z biochemii

Ćwiczenie 5

Kinetyka reakcji enzymatycznej

Wyznaczenie stałej Michaelisa

Enzymy są biokatalizatorami, syntetyzowanymi przez organizmy. Przy udziale enzymów zachodzą wszystkie procesy metaboliczne, a zmiany stężenia lub aktywności poszczególnych enzymów umożliwiają dostosowanie szybkości przebiegu procesów do aktualnych potrzeb organizmu oraz precyzyjną ich koordynację.

Enzymy zwiększają szybkość reakcji i tym samym obniżają czas osiągnięcia stanu równowagi. Enzym wykazuje swoją aktywność tylko wtedy, kiedy istnieją optymalne dla niego warunki. Dotyczy to utrzymania odpowiedniego pH, właściwej temperatury oraz obecności ewentualnych aktywatorów i kofaktorów. W przeciwieństwie do katalizatorów niebiałkowych większość enzymów charakteryzuje się wysoką specyficznością substratową, tzn. każdy z nich katalizuje przekształcenie jednego lub kilku pokrewnych substratów.

O specyficzności substratowej enzymu decyduje część białkowa - apoenzym, w której zlokalizowane jest tzw. centrum aktywne, miejsce do którego przyłącza się substrat. Jest to kilka łańcuchów bocznych aminokwasów, które dzięki strukturze przestrzennej enzymu znajdują się blisko siebie, bardzo często w obszarze hydrofobowym. Cząsteczka substratu może przyłączyć się do enzymu tylko wtedy, kiedy jest przestrzennie dopasowana do centrum aktywnego. Substrat zostaje związany z enzymem licznymi, słabymi oddziaływaniami, w których uczestniczą grupy łańcuchów bocznych aminokwasów centrum aktywnego, a następnie zostaje przekształcony w produkt, który odłącza się od enzymu. Czyli podczas reakcji enzymatycznej tworzy się nietrwały kompleks enzymu z substratem (kompleks ES). Ulega on dużo łatwiej właściwej reakcji chemicznej niż wolny substrat. Powstaje produkt reakcji oraz wolny enzym.

Przy niskim stężeniu substratu i przy stałej, określonej ilości enzymu, nie wszystkie cząsteczki enzymu są połączone z cząsteczkami substratu. Enzym nie jest wysycony substratem i nie wykazuje wtedy maksymalnej aktywności katalitycznej, a szybkość reakcji zależy nie tylko od stężenia enzymu, ale i od stężenia substratu.

Przy wystarczająco dużym stężeniu substratu enzym jest maksymalnie wysycony (enzym jest tylko w kompleksie ES) i reakcja osiąga szybkość maksymalną - V_max. Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie może spowodować wzrostu szybkości reakcji. Szybkość ta jest stała, tzn. zależy tylko od stężenia enzymu - V_max = k₃ ∙ [S].

Zależność pomiędzy szybkością reakcji enzymatycznej i stężeniem molowym substratu określa równanie Michaelisa-Menten:

Wykreślona na podstawie tego równania zależność szybkości reakcji od stężenia substratu przyjmuje postać hiperboli (Rys. 1).

Wartości v dla poszczególnych stężeń substratu oznaczające przyrost ilości (stężenia) produktu w jednostce czasu dotyczą każdorazowo szybkości początkowej (v = v₀). Oznacza to, że reakcję należy prowadzić w warunkach, gdy ilość (stężenie) powstałego produktu reakcji jest wprost proporcjonalna do czasu.

Przy bardzo małych stężeniach substratu zależność v od [S] ma przebieg liniowy, szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia substratu (reakcja I rzędu). Przy stężeniu substratu znacznie przewyższającym wartość K_m szybkość reakcji osiąga wartość maksymalną (V_max) i jest niezależna od dalszego wzrostu stężenia substratu (poziomy odcinek krzywej hiperbolicznej), zależy tylko od stężenia enzymu. Jeżeli [S] = K_m, to v = ½ V_max, tzn. szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej.

Takie stężenie substratu (w mol/dm³), przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej nosi nazwę stałej Michaelisa - K_m. Stała ta mówi o powinowactwie enzymu do substratu. Zazwyczaj K_m równa jest stałej dysocjacji kompleksu ES na E i S, tzn. im jest ona niższa, tym łatwiej kompleks ES powstaje, a trudniej rozpada się, gdyż jest silniejsze wiązanie enzymu z substratem. Wartości K_m dla większości enzymów wahają się w granicach od 10^-5 do 10^-3 mol/dm³.

Niska wartość K_m oznacza, że enzym ma duże powinowactwo do substratu, dzięki czemu reakcja osiąga szybkość maksymalną przy stosunkowo niskim stężeniu substratu. Duża wartość K_m wskazuje na małe powinowactwo enzymu do substratu, a reakcja osiąga V_max dopiero przy odpowiednio wyższym stężeniu substratu. Przy tym samym stężeniu substratu im niższa jest wartość Km, tym większa jest szybkość reakcji.

Doświadczalnie można wyznaczyć wartość K_m dla danego enzymu z pomiarów szybkości początkowych reakcji przy różnych stężeniach substratu. Jednak z wykresu hiperboli trudno jest oszacować, czy osiągnięta została rzeczywiście V_max reakcji. A co za tym idzie, nie ma wtedy pewności, że wyznaczona wartość K_m jest dokładna. Z tego powodu, do wyznaczania wartości Km wykorzystywana jest zależność 1/v od 1/s, czyli równanie Lineweavera-Burka, które jest przekształceniem równania Michaelisa-Menten:

Znajomość wartości K_m ma istotne znaczenie przy opracowywaniu metod oznaczania aktywności enzymów a także wpływu różnych związków na kinetykę katalizowanych reakcji

Opracowano szereg metod oznaczania aktywności enzymów, które wykorzystywane są w diagnostyce różnych chorób (do takich enzymów należy np. dehydrogenaza mleczanowa, aminotransferaza alaninowa, aminotransferaza asparaginianowa, kinaza kreatynowa). Są to enzymy wskaźnikowe, oznaczanie ich aktywności w surowicy krwi chorego pozwala wyciągać wnioski o stanie jego zdrowia. Szybkość każdej reakcji enzymatycznej (aktywność enzymu) należy oznaczać w takich warunkach, aby v = V_max, gdyż tylko wtedy szybkość reakcji zależy od stężenia enzymu. Stężenie substratu musi więc być dużo większe od K_m (minimum 10 razy).

Typ reakcji katalizowanej przez enzym stał się podstawą klasyfikacji enzymów. Zgodnie z tą zasadą Międzynarodowa Unia Biochemiczna dokonała podziału enzymów na sześć głównych klas, a każdy enzym uzyskał ściśle określający go numer klasyfikacyjny.

Oksydoreduktazy (pierwsza klasa enzymów) katalizują reakcje utleniania i redukcji, w tym włączanie tlenu do jakiejś cząsteczki. Do tej klasy należą takie grupy enzymów jak: dehydrogenazy, reduktazy, peroksydazy, oksydazy. Niektóre z nich wymagają do swojego działania koenzymów (np. NAD⁺, NADP⁺, NADPH+H⁺, FAD). Ogólna reakcja katalizowana przez oksydoreduktazy: A^- + B → A + B^-.

Transferazy (druga klasa) katalizujące reakcje, w których dochodzi do przeniesienia jakiejś grupy z jednego substratu na drugi. Niektóre transferazy wymagają do swojego działania koenzymów (np. fosforanu pirydoksalu, pirofosforanu tiaminy). Do tej klasy należą takie grupy enzymów jak: aminotransferazy, acylotransferazy, kinazy (fosfotransferazy).

Ogólna reakcja katalizowana przez transferazy: A + B -X → A-X + B.

Hydrolazy (trzecia klasa enzymów) katalizują reakcje hydrolizy, nie wymagają do swojego działania koenzymów. Większość enzymów tej klasy charakteryzuje się niską specyficznością substratową, skierowaną w stosunku do typu hydrolizowanego wiązania. Do tej klasy należą np.: glikozydazy, esterazy, peptydazy.

Ogólna reakcja katalizowana przez hydrolazy: A-B + H₂O → A-OH + BH.

Liazy (czwarta klasa) katalizują reakcje niehydrolitycznego rozpadu wiązań lub syntezy, która przebiega bez dostarczenia energii z rozpadu ATP. Należą tu takie grupy enzymów jak: syntazy, dekarboksylazy.

Ogólna reakcja katalizowana przez liazy: A-B ↔ A + B.

Izomerazy (piąta klasa) katalizują reakcje izomeryzacji: A-B-C ↔ A-C-B. Należą tu między innymi: mutazy, epimerazy, racemazy.

Ligazy (szósta klasa) przeprowadzają reakcje syntezy wiązań, które wymagają energii najczęściej z rozkładu ATP: A + B + ATP → A-B + ADP + P_i. Syntetazy i karboksylazy to grupy enzymów należące do tej klasy.

Jednostki aktywności enzymatycznej

Jednostka aktywości enzymatycznej (U) jest to ilość enzymu katalizująca przekształcenie jednego mikromola substratu w ciągu jednej minuty w warunkach optymalnych dla danego enzymu.

Jeden katal (kat) jest to aktywność katalityczna powodująca przekształcenie jednego mola substratu w ciągu jednej sekundy w warunkach optymalnych dla danego enzymu.

Inwertaza

Inwertaza (sacharaza) - enzym należący do grupy hydrolaz, został po raz pierwszy wyizolowany z ekstraktu drożdży przez Berthelota w 1860 roku. Inwertaza powoduje hydrolizę dwucukru sacharozy do glukozy i fruktozy.

Sacharoza to disacharyd zbudowany z α-D-glukozy i β-D-fruktozy połączonych wiązaniem glikozydowym α,β-1,2. W większych ilościach występuje w burakach cukrowych i trzcinie cukrowej.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

Doświadczenie składa się z dwóch etapów: z wyznaczenia krzywej wzorcowej do oznaczania cukrów redukujących wobec nadmiaru sacharozy oraz z wyznaczenia stałej Michaelisa dla inwertazy metodą ustalonego czasu. (Z wyznaczonej krzywej wzorcowej będzie można odczytać ilość mikromoli cukrów redukujących powstałych z hydrolizy sacharozy pod wpływem inwertazy drożdżowej).

1. Wyznaczanie krzywej wzorcowej do oznaczania cukrów redukujących wobec nadmiaru sacharozy

Zasada metody

Glukoza redukuje kwas 3,5-dinitrosalicylowy do barwnego związku, który wykazuje maksimum absorbancji przy długości fali 550 nm, a sama utlenia się do kwasu glukonowego. Reakcja przeprowadzana jest w środowisku zasadowym, w którym formy pierścieniowe monocukrów przekształcają się w formy łańcuchowe. Fruktoza również pośrednio powoduje powstanie pomarańczowego zabarwienia, ponieważ w środowisku zasadowym może przekształcić się w aldozę na skutek tautomerycznych przekształceń cząsteczki.

Absorbancja kolejnych prób o wzrastającym stężeniu cukrów redukujących będzie wzrastać proporcjonalnie, co należy przedstawić w postaci krzywej wzorcowej. Wartości absorbancji wyznaczyć na osi rzędnych, a ilość μmoli cukrów redukujących w próbie na osi odciętych.

Odczynniki

1. Roztwór wzorcowy (0,005 mol/dm³ glukoza, 0,005 mol/dm³ fruktoza).

2. 1 mol/dm³ roztwór sacharozy.

3. 0,25 mol/dm³ bufor octanowy pH 4,7.

4. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylowy, 1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

Wykonanie doświadczenia

Tabela 1

Nr probówki	1	2	3	4	5	6
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
Roztwór wzorcowy	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	-
Woda	0,8	0,6	0,4	0,2	-	1,0
1 mol/dm^3 roztwór sacharozy	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
0,25 mol/dm^3 bufor octanowy pH 4,7	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Ilość μmoli cukrów redukujących w próbie

1. Do 6 probówek skalowanych na 10 cm³ dodać odczynniki według tabeli 1.

2. Do wszystkich probówek dodać po 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego, dokładnie wymieszać.

3. Probówki wstawić na 10 minut do wrzącej łaźni wodnej.

4. Probówki wyjąć z łaźni, oziębić i uzupełnić wodą do 10 cm³.

5. Dokonać pomiaru absorbancji przy długości fali 550 nm wobec próby ślepej (probówka 6).

6. Na papierze milimetrowym sporządzić wykres zależności absorbancji od ilości μmoli cukrów redukujących w próbie.

2. Wyznaczanie stałej Michaelisa dla inwertazy metodą ustalonego czasu

Zasada metody

Stałą Michaelisa wyznacza się doświadczalnie z pomiarów szybkości reakcji przy różnych stężeniach początkowych substratu. Do określenia szybkości reakcji wykorzystuje się metodę kolorymetryczną oznaczania ilości powstającego produktu - glukozy. Metoda ta wykorzystuje właściwości redukujące glukozy (sacharoza jest dwucukrem, który tych właściwości nie posiada). Szybkość reakcji w opisanym poniżej doświadczeniu to przyrost ilości cukrów redukujących powstałych w jednakowym, ustalonym czasie inkubacji każdej próbki.

Odczynniki

1. 1 mol/dm³ roztwór sacharozy.

2. 0,25 mol/dm³ bufor octanowy pH 4,7.

3. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylowy, 1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

4. Roztwór inwertazy.

Uwaga! 1 mol/dm³ roztwór sacharozy należy przygotowywać zawsze na świeżo przed każdym doświadczeniem.

Wykonanie doświadczenia

Tabela 2

Nr probówki	1 1'	2 2'	3 3'	4 4'	5 5'	6 6'
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
1 mol/dm^3 roztwór sacharozy	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	1,0
Woda	0,95	0,9	0,8	0,6	0,4	-
Bufor octanowy pH 4,7	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
St. początkowe sacharozy	0,011	0,033	0,066	0,133	0,20	0,333

1. Przygotować 12 probówek skalowanych na 10 cm³ i oznaczyć je od 1 do 6 i od 1' do 6'.

2. Dodać odczynniki według tabeli 2, zawartość probówek dokładnie wymieszać.

3. Do probówek od 1' do 6' dodać po 1,5 cm³ wody.

4. Do probówek od 1 do 6 dodać po 1,5 cm³ roztworu inwertazy w odstępach co 30 sekund (1,5 cm³ enzymu dodać do probówki 1, po 30 sekundach dodać 1,5 cm³ roztworu enzymu do probówki 2, po dalszych 30 sekundach do probówki 3, itd.). Po dodaniu enzymu zawartość probówek wymieszać.

5. Dokładnie po 5 minutach od chwili dodania enzymu, do każdej probówki (1-6) dodać co 30 sekund (w podany powyżej sposób) po 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego.

6. Do probówek od 1' do 6' dodać również po 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego.

7. Zawartość wszystkich probówek dokładnie wymieszać i ogrzewać przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej.

8. Probówki ochłodzić, uzupełnić wodą do 10 cm³.

9. Dokonać pomiaru absorbancji prób od 1 do 6 przy długości fali 550 nm wobec prób ślepych (probówki od 1' do 6'). Wyniki zapisać w zeszycie.

10. Na podstawie otrzymanych wyników absorbancji odczytać z wykonanej krzywej wzorcowej (doświadczenie 1) ilości μmoli cukrów redukujących w próbie. Jest to ilość powstającego produktu, który przy stosowaniu stałego czasu inkubacji jest miarą szybkości reakcji.

11. Na papierze milimetrowym narysować:

1. wykres zależności szybkości reakcji-v (μmole/5 min) od początkowego stężenia sacharozy-substratu (mol/dm³). Na podstawie wykresu odczytać wartość K_m.

2. wykres zależności 1/v od 1/s. Na podstawie wykresu obliczyć wartość K_m.

1

---