Obecność komórek

Obecność komórek

produkujących przeciwciała

produkujących przeciwciała

w zawiesinie splenocytów

w zawiesinie splenocytów

myszy (PFC).

myszy (PFC).

Agnieszka

Agnieszka

Czajka

Czajka

Antygen

Antygen

jest to każda substancja, która

jest to każda substancja, która

wykazuje dwie cechy:

wykazuje dwie cechy:

•

Immunogenność

Immunogenność

czyli zdolność wzbudzania

czyli zdolność wzbudzania

przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej

przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej

swoistej,

swoistej,

•

Antygenowość

Antygenowość

czyli zdolność do reagowania

czyli zdolność do reagowania

z przeciwciałami oraz TCR.

z przeciwciałami oraz TCR.

Antygeny grasiczozależne- wymagają udziału

Antygeny grasiczozależne- wymagają udziału

limfocytów T do wzbudzenia odpowiedzi,

limfocytów T do wzbudzenia odpowiedzi,

Antygeny grasiczoniezależne - nie wymagają

Antygeny grasiczoniezależne - nie wymagają

udziału limfocytów T w indukcji odpowiedzi.

udziału limfocytów T w indukcji odpowiedzi.

•

Antygeny monowalentne i poliwalentne.

Antygeny monowalentne i poliwalentne.

Odporność

Odporność

humoralna

humoralna

komórkowa

komórkowa

-Biorą udział limfocyty T i B

- Związana z wytwarzaniem
swoiście
reagujących z antygenem
przeciwciał,
mogących unieszkodliwiać
drobnoustroje
na drodze wielu różnych
mechanizmów.

- Powstają swoiście
uczulone
na dany antygen limfocyty
T,
mające zdolność
rozpoznawania
„odmienności” własnych
komórek i ich niszczenia.

Przemiany, jakim podlegają limfocyty

Przemiany, jakim podlegają limfocyty

podczas aktywacji:

podczas aktywacji:

•

Dojrzewanie limfocytów B w szpiku kostnym,

Dojrzewanie limfocytów B w szpiku kostnym,

–

Limfocyty proB,

Limfocyty proB,

–

Limfocyty preB,

Limfocyty preB,

–

Niedojrzałe limfocyty B,

Niedojrzałe limfocyty B,

–

Dojrzałe limfocyty B,

Dojrzałe limfocyty B,

•

Aktywacja limfocytów B

Aktywacja limfocytów B

–

BCR+kostymulanty(CD40,kompleksCD19/CD21

BCR+kostymulanty(CD40,kompleksCD19/CD21

/CD81/Leu13, CD22),

/CD81/Leu13, CD22),

•

Aktywacja limfocytów T

Aktywacja limfocytów T

–

Teoria dwóch sygnałów.

Teoria dwóch sygnałów.

Przeciwciała:

Przeciwciała:

Funkcja:

Funkcja:



Neutralizowanie

Neutralizowanie

wirusów

wirusów

i toksyn (IgG, IgA)

i toksyn (IgG, IgA)



Opsonizacja

Opsonizacja



Aktywacja

Aktywacja

dopełniacza

dopełniacza



Udział w fagocytozie

Udział w fagocytozie



ADCC – udział w

ADCC – udział w

cytotoksyczności

cytotoksyczności

1.Fragment Fab
2. Fragment Fc
3. Łańcuch ciężki
4. Łańcuch lekki
5. Miejsce wiązania

antygenu

6. Regiony zawiasowe

Test PFC (Plaque-Forming Cells

Test PFC (Plaque-Forming Cells

Assay).

Assay).

Wykrywanie komórek produkujących

Wykrywanie komórek produkujących

przeciwciała.

przeciwciała.

Zasada działania:

Zasada działania:



w

obecności

dopełniacza,

w

obecności

dopełniacza,

komórki

komórki

wytwarzające Ig

wytwarzające Ig

wywołują lizę erytrocytów, co

wywołują lizę erytrocytów, co

objawia się pojawieniem łysinek.

objawia się pojawieniem łysinek.

PFC

PFC

Bezpośrednie

Bezpośrednie

Pośrednie

Pośrednie

wykrywa komórki

wykrywa komórki

wykrywa komórki

wykrywa komórki

produkujące przeciwciała IgM

produkujące przeciwciała IgM

produkujące przeciwciała IgG

produkujące przeciwciała IgG

Materiał:

Materiał:

•

Myszy szczepu BALB / c

Myszy szczepu BALB / c

–

Immunizowane erytrocytami owcy

Immunizowane erytrocytami owcy

4% SRBC

4% SRBC

–

Nieimmunizowane (kontrolne - NaCl)

Nieimmunizowane (kontrolne - NaCl)

•

•

Mieszanina reakcyjna wypełniająca

Mieszanina reakcyjna wypełniająca

komory

komory

:

:

–

0,5 ml zawiesiny komórek śledzionowych

0,5 ml zawiesiny komórek śledzionowych

–

0,3 ml MEM

0,3 ml MEM

–

0,1 ml 20% SRBC w MEM

0,1 ml 20% SRBC w MEM

–

0,1 ml wyadsorbowanego dopełniacza świnki

0,1 ml wyadsorbowanego dopełniacza świnki

morskiej

morskiej

Metoda:

Metoda:

•

Immunizacja myszy wywołuje odpowiedz pierwotną, produkcję

Immunizacja myszy wywołuje odpowiedz pierwotną, produkcję

przeciwciał,

przeciwciał,

•

Kontakt z erytrocytami prowadzi do ich opłaszczania przez

Kontakt z erytrocytami prowadzi do ich opłaszczania przez

przeciwciała i aktywacji dopełniacza,

przeciwciała i aktywacji dopełniacza,

•

Aktywowany dopełniacz prowadzi do lizy erytrocytów i powstaniu

Aktywowany dopełniacz prowadzi do lizy erytrocytów i powstaniu

łysinek.

łysinek.

Podawanie
myszom
SRBC

4 dni

Usunięcie
śledziony

Dodanie
limfocytów do
ciekłej agarozy
zawierającej
SRBC

+
dopełniacz
na 1h, 37°C

Tworząca
się
łysinka

Jedna łysinka to
jedna komórka
produkująca
przeciwciała.

Wyniki:

Wyniki:

•

Spodziewane wyniki:

Spodziewane wyniki:

–

W populacji komórek śledzionowych pobranych od

W populacji komórek śledzionowych pobranych od

myszy immunizowanych SRBC

myszy immunizowanych SRBC

występują komórki

występują komórki

produkujące przeciwciała.

produkujące przeciwciała.

–

Odpowiedz immunologiczna u myszy

Odpowiedz immunologiczna u myszy

immunizowanej SRBC wykazuje

immunizowanej SRBC wykazuje

większą

większą

ilość

ilość

komórek produkujących przeciwciała, niż u myszy

komórek produkujących przeciwciała, niż u myszy

kontrolnej.

kontrolnej.

•

Uzyskane wyniki:

Uzyskane wyniki:

?

?

Obliczenia:

Obliczenia:

Ilość komórek produkujących przeciwciała

Ilość komórek produkujących przeciwciała

anty – SRBC na milion (10

anty – SRBC na milion (10

6

6

) śledzionowych

) śledzionowych

komórek limfatycznych.

komórek limfatycznych.

•

PFC/10

PFC/10

6

6

–

–

liczba komórek produkujących przeciwciała na milion

liczba komórek produkujących przeciwciała na milion

śledzionowych komórek limfatycznych

śledzionowych komórek limfatycznych

•

L śr

L śr

– średnia liczba łysinek produkowana w komorach

– średnia liczba łysinek produkowana w komorach

•

V śr

V śr

– średnia objętość mieszaniny wlanej do komór

– średnia objętość mieszaniny wlanej do komór

•

Gęstość

Gęstość

– gęstość komórek w mieszaninie reakcyjnej

– gęstość komórek w mieszaninie reakcyjnej

•

Żywotność

Żywotność

– żywotność komórek w zawiesinie

– żywotność komórek w zawiesinie

PFC/10

6

=

L śr * 10

6

Gęstość * żywotność * Vśr

Przykładowe wyniki:

Przykładowe wyniki:

Kontrola

Kontrola

SRBC

SRBC

Lśr – 0

Lśr – 0

Lśr – 80

Lśr – 80

Vśr – 0,1

Vśr – 0,1

Vśr – 0,13

Vśr – 0,13

gęstość – 10

gęstość – 10

8

8

gęstość – 10

gęstość – 10

6

6

żywotność – 0,93

żywotność – 0,93

żywotność – 0,75

żywotność – 0,75

PFC/10

PFC/10

6

6

»

»

0

0

•

PFC/10

PFC/10

6

6

= - 738,5

= - 738,5

- 778,6

- 778,6

- 813,3

- 813,3

- 848,0

- 848,0

- 940,48

- 940,48

PFC/10

6

823,78

1h

czas

PFC/10

6

SRBC
» 823,78

Literatura:

Literatura:

•

P.M. Lydyard, A. Whelan, M.W. Fanger

P.M. Lydyard, A. Whelan, M.W. Fanger

„Immunologia. Krótkie wykłady”

„Immunologia. Krótkie wykłady”

Wydawnictwo Naukowe PWN, Wydanie

Wydawnictwo Naukowe PWN, Wydanie

pierwsze, Warszawa 2006.

pierwsze, Warszawa 2006.

•

W. Ptak, M. Ptak, M. Szczepanik

W. Ptak, M. Ptak, M. Szczepanik

„Podstawy immunologii” Wydawnictwo

„Podstawy immunologii” Wydawnictwo

Lekarskie PZWL, Wydanie pierwsze,

Lekarskie PZWL, Wydanie pierwsze,

Warszawa 2008.

Warszawa 2008.