PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA

Nukleotydy i kwasy nukleinowe

OH

OH

H

O

H

H

H

OH

HOCH

2

H

OH

H

O

H

H

H

OH

HOCH

2

ryboza

2-deoksyryboza

N

1

2

3

4

5

6

N

PIRYMIDYNA

cytozyna

tymina

uracyl

N

N

1

2

3

4

5

6

N

N

7

8

9

PURYNA

adenina

guanina

O

N

zasada

cukier

1’

2’

3’

4’

5’

CH

2

P

O

O

-

O

-

reszta kwasu
ortofosforowego

Nukleotydy

O

N

1’

2’

3’

4’

5’

CH

2

P

O

O

-

O

-

nukleotyd

O

N

1’

2’

3’

4’

5’

CH

2

OH

nukleozyd

CH

2

P

O

O

-

O

-

mono

foforan nukleozydu

CH

2

P

O

O

O

-

P

O

O

-

O

-

di

foforan nukleozydu

CH

2

P

O

O

O

-

P

O

O

-

O

P

O

O

-

O

-

tri

foforan nukleozydu

Nukleotydy

wiązanie

N-glikozydowe

wiązanie

estrowe

koniec 5’ łańcucha

koniec 3’ łańcucha

O

cukier

1’

2’

3’

4’

5’

fosforan

N

zasada

N

O

zasada

cukier

1’

2’

3’

4’

5’

O

cukier

1’

2’

3’

4’

5’

fosforan

fosforan

N

zasada

Fragment łańcucha kwasu nukleinowego

wiązanie

fosfodiestrowe

wiązanie

fosfodiestrowe

OH

Kwasy nukleinowe

DN
A

kwas rybonukleinowy

bierze udział

w rozkodowywaniu

informacji zawartej w DNA

koduje informację o budowie

i działaniu całego organizmu

kwas deoksyrybonukleinowy

RNA

CH

2

P

O

O

-

O

-

mono

foforan nukleozydu

CH

2

P

O

O

O

-

P

O

O

-

O

P

O

O

-

O

-

tri

foforan nukleozydu

DNA dATP, dGTP, dCTP,

dTTP

RNA ATP, GTP, CTP,

UTP

Podwójna helisa DNA

G C

A T

komplementarne parowanie zasad

5’ GGTACCAATTCAAAGCTTATG 3’
3’ CCATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’

Enzymy restrykcyjne

Kpn I

GGTAC



C

C



CATGG

5’

GGTAC

3’

3’

C

5’

5’

C

AATTCAAAGCTTATG 3’

3’

CATGG

TTAAGTTTCGAATAC 5’

Hind III

A



AGCTT

TTCGA



A

5’ GGTACCAATTCA

A

3’

3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

5’

5’

AGCTT

ATG 3’

3’

A

TAC 5’

Alu I

AG



CT

TC



GA

5’

CT

TATG 3’

3’

GA

ATAC 5’

5’ GGTACCAATTCAA

AG

3’

3’ CCATGGTTAAGTT

TC

5’

5’ GGTACCAATTCA

A

|||||||||||||

||||

|||

3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

AGCTT

ATG 3’

|

A

TAC 5’

5’ GGTACCAATTCA

A

||||||||||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

AGCTT

ATG 3’

|

A

TAC 5’

5’ GGTACCAATTCA

A

||||||||||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

AGCTT

ATG 3’

|

A

TAC 5’

Hind III

A



AGCTT

TTCGA



A

Hind III

5’ GGTACCAATTCA

A

3’

|||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

5’

5’

AGCTT

ATG 3’

|||
3’

A

TAC 5’

5’ GGTACCAATTCA

A

3’

|||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

5’

5’

AGCTT

ATG 3’

|||
3’

A

TAC 5’

ligaza

5’ GGTACCCGGGCAA
||||||||||||||||||||
3’ CCATGGGCCCGTTTCGA

AGCTTATG 3’
|
ATAC 5’

5’ GGTACCAATTCAA
||||||||||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGTTGGCC

CCGGTATG 3’
|
ATAC 5’

Xma I

A



CCGGT

TGGCC



A

Age I

ligaza

C



CCGGG

GGGCC



C

5’ GGTACCAATTCAA 3’
|||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGTTGGCC 5’

5’CCGGTATG 3’
||||
3’ATAC 5’

5’ GGTAC

CCGG

T

ATG

|||||||||||||
3’ CCATG

GGCC

A

TAC

3’

5’

C



CCGGG

GGGCC



C

A



CCGGT

TGGCC



A

Xma I

Age I

5’ GGTAC

3’

|||||
3’ CCATGGGCC 5’

5’CCGGGCAAAGCTTATG 3’
||||||||||||
3’CGTTTCGAATAC 5’

wektor

trawienie enzymem restrykcyjnym

Klonowanie DNA

DNA zawierający wstawkę,
którą chcemy przeklonować

trawienie

enzymem

restrykcyjnym

wstawka

ligacja wektora
ze wstawką

plazmid ze wstawką gotowy

do wprowadzenia do bakterii

bufor

Reakcja PCR

mieszanina reakcyjna

dNTP

starter1

starter2

polimeraza Taq

dwuniciowa
matryca DNA

sekwencja docelowa

Cykl syntezy DNA w reakcji PCR

etap 1 - denaturacja matrycy

etap 2 - przyłączenie starterów

etap 3 - wydłużanie starterów

CYKL 1

denaturacja 94C

jednoniciowa
matryca DNA

CYKL 1

przyłączenie startera do matrycy 40-65C

starter 1

starter 2

CYKL 1

wydłużanie startera 72C

starter 1

starter 2

powstają cząsteczki
dłuższe od sekwencji
docelowej

CYKL 2

denaturacja matrycy 94C

matryca

DNA, który powstał

w cyklu 1

CYKL 2

przyłączenie startera do matrycy 40-65C

CYKL 2

wydłużanie starterów 72C

powstają cząsteczki

dłuższe od sekwencji

docelowej

powstają cząsteczki

o długości sekwencji

docelowej

94°C

15s

94°C

3 min

65°C

15s

72°C

30s

te

m

pe

ra

tu

ra

czas

15x

72°C

30s

4°C



1x

1x

94°C

15s

94°C

3 min

65°C

15s

72°C

30s

te

m

pe

ra

tu

ra

czas

15x

72°C

30s

4°C



1x

1x

Profil termiczny reakcji PCR

cykl

podstawowy

cykle dodatkowe

Zastosowanie metody PCR (1)

DIAGNOSTYKA MIKROORGANIZMÓW (JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA)

zakażenia bakterią

Chlamydia trachomatis (chlamydioza)

Chlamydia pneumoniae (chlamydioza układu

oddechowego)

Mycobacterium tuberculosis (gruźlica)
Borrelia burgdorferii (borelioza)

zakażenia pierwotniakiem Toxoplasma gondii

zakażenia wirusem HIV

CMV (cytomegalia)
Herpes simplex (opryszczka narządów płciowych)
zapalenia wątroby typu B (HBV) i typu C (HCV)

DIAGNOSTYKA CHORÓB NOWOTWOROWYCH

diagnostyka mutacji w genach BRCA1 i BRCA2

diagnostyka ryzyka nowotworowego - mutacje genów kodujących białka
naprawcze,
odpowiedzialne za nadwrażliwość na estrogeny

diagnostyka zagrożenia nowotworem szyjki macicy – wykrywanie wirusa
HPV (wirus
brodawczaka ludzkiego)

Zastosowanie metody PCR (2)

DIAGNOSTYKA CHORÓB GENETYCZNYCH

hemochromatoza

mukowiscydoza

dystrofia mięśniowa (Duchennea i Beckera)

choroba Alzheimera (genotypowanie ApoE)

dziedziczna skłonność miażdżycowa

Choroba Parkinsona

CCR5 (mutacja odpowiedzialna za odporność na HIV)

DIAGNOSTYKA NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ O PODŁOŻU GENETYCZNYM
(polegającej na braku plemników w nasieniu - mikrodelecje na
chromosomie Y)

USTALANIE POKREWIEŃSTWA I OJCOSTWA

KRYMINALISTYKA

BADANIE ŻYWNOŚCI W KIERUNKU MODYFIKACJI GENETYCZNEJ GMO
(kukurzydza, soja, zboża, pomidory, ziemniaki, buraki cukrowe etc.) -
analiza jakościowa i ilościowa

BADANIA MIKROBIOLOGICZNE ŻYWNOŚCI
(Staphylococcus aureus, Salmonella species, Shigella species, Listeria
species)

BADANIA NAUKOWE
(biologia molekularna, biotechnologia, badania ewolucyjne, antropologia,
badania środowiskowe)

Ustalanie ojcostwa (1)

1. Pobranie materiału do badań

2. Kodowanie
próbek

3. Izolacja DNA

4. Amplifikacja DNA

5. Elektroforeza DNA

x – dziecko nie odziedziczyło

żadnego allela od mężczyzny

# - dziecko odziedziczyło allel

nieobecny u mężczyzny

wszystkie allele dziecka

pochodzą od matki i od
mężczyzny

7. Analiza statystyczna

Ustalanie ojcostwa (2)

6. Analiza genotypów badanych osób

wykluczenie
ojcostwa

potwierdzenie ojcostwa

mieszanina

jednoniciowych

cząsteczek DNA

jednoniciowa wyznakowana

sonda komplementarna

do cząsteczki A

hybrydyzacja

w warunkach ostrych

hybrydyzacja

w warunkach łagodnych

tylko cząsteczka A tworzy

stabilną dwuniciową cząsteczkę

cząsteczki A, C i E tworzą

stabilne dwuniciowe cząsteczki

Hybrydyzacja

Sekwencjonowanie DNA

denaturacja

dwuniciowy DNA

jednoniciowy DNA
(matryca do sekwencjonowania)

przyłączenie znakowanego startera

starter

podział na 4 oddzielne reakcje

wydłużania startera

A T C G

rozdział produktów reakcji sekwencjonowania

w żelu poliakrylamidowym

pozostałe składniki reakcji

Sekwencjonowanie DNA

A T C G

G
A
C
C
T
G
A
C
T
G
T
A

5’

3’

plazmid pUC18/cDNAPPRas2

ze wstawką 0,8 kp

mieszanina A:
startery A1 i A2

A1

A2

B2

B1

0,6 kb

0,35 kb

Część praktyczna

mieszanina B:
startery B1 i B2

1 - wzorce wielkości
2, 3, 4 - produkty reakcji A, w której jako matrycy
użyto lizatu bakterii)
5 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji A,
w której jako matrycy użyto czystego plazmidu
6 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji A,
do której nie dodano żadnej matrycy
7 - produkty reakcji B, w której jako matrycy
użyto lizatu bakterii)
8 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji B,
w której jako matrycy użyto czystego plazmidu
9 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji B,
do której nie dodano żadnej matrycy
10 - wzorce wielkości

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1,35 kb

1,08 kb

0,87 kb

0,6 kb

0,28 kb

0,23 kb

0,31kb

0,6 kb

0,35 kb

0,19 kb

A

B