Biotesty stosowane w ekotoksykologii.

Co to są biotesty?

Biotest

- test biologiczny

przeprowadzony z udziałem organizmów

żywych; określenie ilości lub pomiar

aktywności substancji biologicznie

czynnej; np. leków, hormonów, witamin,

czynników toksycznych; stosowany w

badaniach biologicznych, biologiczno-

chemicznych, diagnostyce medycznej, a

także w ekologii.



Biotest (gr. bios - życie + łac. testari =

świadczyć), można zdefiniować jako

eksperymentalną próbę biologiczną, której

celem jest wykazanie obecności substancji

toksycznych w środowisku albo poznaniu

jej szkodliwości poprzez ilościowe

oszacowanie wpływu tej substancji na

żywy organizm (na podstawie porównania

z próbą kontrolną). Pomiar toksyczności

jest bowiem jeszcze jednym przykładem

pomiaru względnego tak powszechnego w

dziedzinie klasycznej analityki chemicznej.

OCENA EFEKTÓW

TOKSYCZNYCH



Badania toksyczności próbek środowiskowych mogą

stanowić podstawę do rozwiązania trzech

zasadniczych problemów:



- ocena ryzyka, czyli prawdopodobieństwo

wystąpienia negatywnego oddziaływania danego

czynnika na żywy organizm,



- określenie jak wysoka jest jego toksyczność,

poprzez wyznaczenie dawki wywołującej efekt

toksyczny,



- próba wykrycia odległych skutków ekspozycji

organizmu na czynniki toksyczne, takie jak np.:

mutageny, kancerogeny, czy też związki wykazujące

właściwości teratogenne i/lub embriotoksyczne.



Badania ekotoksykologiczne można prowadzić w dwojaki

sposób:

poprzez badania epidemiologiczne, polegające na

obserwacji pewnej populacji ludzkiej narażonej na określone

zanieczyszczenia środowiska

- poprzez stosowanie metod laboratoryjnych prowadzonych

z wykorzystaniem różnych modeli doświadczalnych i

podjęcie próby wykorzystania uzyskanych wyników do

oceny wielkości narażenia człowieka.

W zależności od stosowanego modelu, metody laboratoryjne

dotyczyć mogą badań toksyczności w stosunku do:



- całego organizmu



- wybranego narządu

metody in vivo



- hodowli komórek

metody in vitro



- reakcji enzymatycznych



W przypadku przeprowadzania badań z

wykorzystaniem prostych modeli doświadczalnych

in vitro, jak i badań na zwierzętach otrzymuje się

zależność między dawką (stężeniem) czynnika

toksycznego a odpowiedzią biologiczną, czyli

reakcją organizmu na tę dawkę.



Na podstawie zależności: dawka – odpowiedź

wyznaczyć można wartości wskaźników będące

ilościową miarą toksyczności badanej substancji.

Siłę toksycznego oddziaływania na organizmy

żywe określają takie wskaźniki jak EC25 lub EC50

oraz ED25 lub ED50, czyli stężenie danej toksyny

w środowisku lub jej dawka, która wywołuje

określony efekt biologiczny w wysokości 25% lub

50% jego maksymalnej wartości.

Toksyczność ostra - oddziaływanie danej substancji,

które zaburza procesy biologiczne w takim

stopniu, iż następuje śmierć. Miarą takiego efektu

jest dawka śmiertelna - LD50 (ang. Lethal Dose),

czyli dawka wywołująca po określonym czasie

śmierć 50% osobników badanej populacji.



Dłuższy czas obserwacji i opisowy charakter

wyników charakteryzuje metody badania

toksyczności podostrej (subletalnej) i przewlekłej

(chronicznej). Dotyczą one całego organizmu i

polegają na obserwacji procesów komórkowych i

biochemicznych, funkcji fizjologicznych i

zachowania się osobników. Z kolei po śmierci

zwierząt przeprowadza się obserwacje zmian

makro- i mikroskopowych w narządach, które

zaszły podczas ekspozycji na toksynę.

Ogólnie rzecz biorąc wyróżnia się dwie grupy

zastosowań metod biologicznych

- biomonitoring, który może być realizowany

w dwojaki sposób:
- w oparciu o typowe badania analityczne

próbek materii ożywionej (bioty)

traktowanych jako tzw. pasywne próbniki

akumulacyjne dla zanieczyszczeń,
- poprzez obserwację biowskaźników

(odpowiednich organizmów roślinnych i

zwierzęcych);

- bioanalityka, która jest związana z

wykorzystaniem substancji aktywnych

biologicznie jako receptorów określonych

zanieczyszczeń. Ze względu na sposób

wykorzystania składnika biologicznego

można mówić o:
- bioczujnikach, gdy składnik aktywny

biologicznie (bakterie, wirusy,enzymy,

przeciwciała, itd.) stanowi część aktywną

odpowiedniego czujnika.

- biotestach, gdy materiał biologiczny

stanowi „oryginalne” urządzenie kontrolno

- pomiarowe.

Porost - brodaczka kępkowa

Usnea hirta

SPOSOBY PRZEPROWADZANIA

BADAŃ Z WYKORZYSTANIEM

BIOTESTU

W literaturze spotyka się informacje na temat trzech głównych

sposobów przeprowadzania badań z wykorzystaniem

biotestu:

1A. testy toksyczności realizowane w laboratorium, podczas

których substancja toksyczna jest sztucznie wprowadzana

do czystej wody lub osadu. Wykonywany jest w celu

przeprowadzenia wzorcowania biotestu, który następnie

zostanie wykorzystany do oszacowania toksyczności próbek

rzeczywistych

1B. testy toksyczności prowadzone w laboratorium na bazie

pobranych próbek rzeczywistych (woda, gleba i osady).

Toksyczność takich próbek jest porównywana z

toksycznością próbek wzorcowych

2. testy przeprowadzane in situ, z wykorzystaniem populacji

organizmów żyjących w warunkach naturalnych

Podstawowych informacji na temat skażenia danego elementu

środowiska dostarczają biotesty realizowane z wykorzystaniem

pojedynczego gatunku roślinnego lub zwierzęcego (ang. single

species tests), reprezentującego określony poziom troficzny.

W celu dokładniejszego zbadania skomplikowanego zjawiska

interakcji potencjalnie toksycznych związków chemicznych z

organizmami zasiedlającymi określone ekosystemy

przeprowadza się niekiedy eksperymenty w mikrosystemach

(ang. microcosm).

Jeszcze rzadziej wpływ toksyn na populacje gatunków roślinnych

i/lub zwierzęcych, ich strukturę i funkcjonowanie bada się w

kosztownych mezosystemach – izolowanych wycinkach jeziora

lub sztucznych strumieniach (ang. mesocosm), do których w

sposób kontrolowany doprowadza się związki chemiczne.

Układy te poddawane są naturalnej zmienności warunków

środowiskowych (wiatry, temperatura, nasłonecznienie).

TESTY BAKTERYJNE

Biotesty stanowią ważny element

bioanalityki i biomonitoringu.



Bioluminescencja morskich

bakterii Vibrio fischeri znalazła

szerokie zastosowanie w

testach toksyczności. Biotesty

takie stanowią użyteczne

narzędzie wykorzystywane do

oceny stopnia

zanieczyszczenia wód ,

osadów dennych i gleb.

Toksyczność każdego z tych

ekosystemów jest określana

na podstawie pomiaru

bioluminescencji bakterii,

które w trakcie swoich funkcji

życiowych emitują światło.

Pomiaru luminescencji

dokonuje się przed i po

inkubacji zawiesiny bakteryjnej

z badaną próbką.

Bakterie Vibrio fischeri.

MIKROBIOTESTY

Konieczność wykonywania analiz wielu próbek

środowiskowych w stosunkowo krótkim czasie doprowadziła

do wzrostu znaczenia szybkich zminiaturyzowanych testów

toksyczności, zwanych mikrobiotestami, testami

alternatywnymi, czy też testami drugiej generacji.

Mikrobiotesty działają w oparciu o organizmy jednokomórkowe

lub małe wielokomórkowce, które w wyniku kontaktu z

próbką ciekłą wykazują specyficzną odpowiedź.

Ze względu na liczne zalety, testy alternatywne stosowane są

najczęściej w postaci baterii biotestów opartych na

wykorzystaniu organizmów należących do różnych

poziomów troficznych. Ponieważ mikroorganizmy stanowią

podstawowe ogniwo w łańcuchu pokarmowym, wszelkie

niekorzystne zmiany w nich zachodzące, w sposób

bezpośredni lub pośredni mogą wpływać na organizmy

wyższych poziomów troficznych, a w dalszym etapie na

stan całego ekosystemu.

TESTY OPARTE NA

WYKORZYSTANIU ROŚLIN

W przypadku testów toksyczności opartych na

wykorzystaniu roślin (fitotesty) jako czynnika

aktywnego zastosowanie znajdują glony

(zielenice, sinice, okrzemki), rzęsa wodna i

ukorzenione makrofity (roślina i jej nasiona)

wodne i lądowe. Reprezentują one organizmy o

szczególnym znaczeniu dla swoich siedlisk

naturalnych: dostarczają tlen, zapewniają obieg

substancji organicznych, kontrolują jakość wody

oraz równowagę gleby i osadów dennych.

Zmiany zachodzące w roślinach mogą bezpośrednio

wpływać za strukturę i funkcjonowanie całego

ekosystemu.

Rośliny takie jak algi i makrofity

znalazły szerokie zastosowanie

jako biowskaźniki in situ w kontroli

jakości wody ze względu na ich

zdolność akumulacji związków

chemicznych, jak i fakt, że pod

względem biomasy stanowią

znaczną immobilną część

środowiska wodnego.

ZASTOSOWANIE ALG JAKO ELEMENTU

AKTYWNEGO FITOTESTÓW



Wybór gatunku glonu do danego

testu zależy od jego dostępności,

wymagań hodowli i łatwości

użycia. Na podstawie tych

kryteriów zaleca się stosowanie

mikroalg (w postaci

mikrobiotestu), wśród których

dwa najczęściej testowane

gatunki należą do rodziny zielenic.

Są to algi Selenastrum

capricornutum oraz Scenedesmus

quadricauda i S. subspicatus.

Sinice i okrzemki są rzadziej

stosowane ze względu na ich

powolny wzrost i wymagające

warunki hodowli.

Algi morskie.

ZASTOSOWANIE ROŚLIN NACZYNIOWYCH JAKO ELEMENTU

AKTYWNEGO FITOTESTÓW

Badanie toksyczności z wykorzystaniem testów opartych na

wykorzystaniu roślin naczyniowych przeprowadza się głównie w

stosunku do pestycydów, wielopierścieniowych węglowodorów

aromatycznych (WWA) i metali ciężkich.

Rzęsa wodna

Makrofity niezwykle rzadko znajdują zastosowanie w testach

toksyczności. Jeśli jednak w literaturze napotyka się na tę grupę

roślin, to przedstawione badania najczęściej dotyczą rzęsy wodnej

(Lemna minor i L. gibba) - gatunku reprezentatywnego dla

wszystkich roślin naczyniowych.

Rzęsa wodna jest gatunkiem swobodnie pływającym, nie

zakorzenionym w podłożu.

Jej małe rozmiary, łatwość hodowli i
krótki czas rozmnażania
(dwukrotny wzrost liczebności
następuje w ciągu 1-4 dni)
decydują o wykorzystaniu jej
jako materiału biologicznego.

Rzęsa wodna.

2. Rośliny zakorzenione
Zakorzenione rośliny submersyjne

i emersyjne niezwykle rzadko

znajdują zastosowanie w

testach toksyczności. Duże

rozmiary, powolny wzrost i

brak ustalonych metod

przeprowadzania testów

przyczyniły się do

sporadycznego ich stosowania

w formie materiału

biologicznego. W literaturze

spotkano informacje o

wykorzystaniu wywłócznika

kłosowego (Myriophyllum

spicatum) i różnolistnego (M.

hydrophyllum). Rośliny mogą

być hodowane w laboratorium

lub pozyskiwane do testów z

naturalnych źródeł.

Wywłócznik kłosowy.

ZASADA „3 R”

eduction – zmniejszenie liczby zwierząt

wykorzystywanych w doświadczeniach

eplacement – zastępowanie zwierząt metodami

alternatywnymi

efinement – doskonalenie stosowanych metod

esponsibility – odpowiedzialność:



opracowywanie, wytwarzanie i testowanie nowych

leków



zapobieganie, diagnozowanie i leczenie chorób ludzi,

zwierząt i roślin



ochrona śrdowiska naturalnego dla dobra ludzi i

zwierząt

TESTY OPARTE NA WYKORZYSTANIU

ORGANIZMÓW ZWIERZĘCYCH

Testy toksyczności ostrej z wykorzystaniem

gatunków organizmów zwierzęcych

przeprowadza się znacznie częściej niż

fitotesty.

Przykłady organizmów zwierzęcych w

biotestach:



Pierwotniaki - Rozwinięcie metodyki

przeprowadzania kilkupokoleniowego testu

polegającego na hamowaniu wzrostu

pierwotniaków.



Pierścienice - Pijawka lecznicza (Hirudo

medicinalis L.). Parametr mierzony i

wielkość oznaczana - Ruchliwość, liczba

osobników unikających kontaktu z próbką,

zmiana kształtu ciała, apetyt.

Zastosowanie - Ocena toksyczności wody

w jeziorze, osadów dennych i modelowej

mieszaniny metali ciężkich na podstawie

obserwacji zmian zachowania pijawek.



Mięczaki - Postać larwalna małży –

glochidium (Anodonta cygnea zellensis).

Parametr mierzony i wielkość oznaczana –

żywotność. Zastosowanie - Wpływ pH i

twardości wody na toksyczność Cd, Cu i Zn

dla larwy małży słodkowodnej.

Pijawka lekarska.



Stawonogi – rozwielitka (Daphnia magna).

Parametr mierzony i wielkość
oznaczana – Liczebność potomstwa,
śmiertelność, ruchliwość.
Zastosowanie – Ocena jakości
wody rzecznej, ocena toksyczności wód
opadowych, określenie wpływu wieku
osobników na wyniki testu toksyczności
ostrej, ocena toksyczności oczyszczonych
ścieków przemysłowych i nie oczyszczonych
ścieków szpitalnych.



Ryby- Okoń błękitnoskrzeli (Lepomis

macrochirus). Parametr mierzony i wielkość
oznaczana –Długość osobnika, masa
mokra, śmiertelność, masa wątroby,
stężenie MBP w wątrobie
(białek kompleksujących metale).
Zastosowanie - Ocena toksyczności osadów
rzecznych zanieczyszczonych przez kadm.



Ssaki - samica szczura. Parametr mierzony i wielkość oznaczana - 1Aktywność

etoksyrezorufiny (EROD) zależnej od P450 1A1, 1aktywność

pentoksyrezorufiny (PROD) zależnej od P450 2B, masa wątroby, 2stężenie

białek mikrosomalnych w wątrobie, stężenie tyroksyny (T4) w surowicy,

powierzchnia i wysokość komórki folikuliny (hormonu żeńskiego). Zastosowanie

- Ocena toksyczności ekstraktów z gleby zawierającej wysokie stężenia

polichlorowanych bifenyli, pochodzącej z nieczynnego składowiska odpadów.

WYKAZ ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH

HODOWANYCH W POLSCE

Myszy – szczepy wsobne

MYSZY – szczepy kongeniczne

(szczepy kongeniczne różnią się krótkim

odcinkiem jednego chromosomu a

otrzymuje się je na drodze szeregu

krzyżówek genetycznych połączonych z

równoczesną selekcją).

MYSZY – specjalne modele

(transgeniczne, linie selekcyjne, szczepy

z mutacją, mieszańce)

MYSZY – stada niekrewniacze

SZCZURY – szczepy wsobne

SZCZURY – stada niekrewniacze

CHOMIKI – syryjski i dżungarski

GERBILE – myszoskoczki

KOTY - kot europejski (czyli nasze

dachowce) – służ jako :model

neurofizjologiczny, badania

neurofizjologiczne

KRÓLIKI

NORNICA RUDA

OPOS LABORATORYJNY

PRZEPIÓRKA JAPOŃSKA

ŚWINKI MORSKIE

Opos.

CZY EKSPERYMENTOWAĆ NA

ZWIERZĘTACH?!

DOŚWIADCZENIA NA ZWIERZĘTACH NIGDY

NIE WZBUDZAŁY TAK WIELKICH EMOCJI JAK

DZISIAJ. NIEZALEŻNIE OD OGRANICZEŃ

PRAWNYCH I DOBREJ WOLI NAUKOWCÓW,

NIE DA SIĘ UNIKNĄĆ TAKICH PRAKTYK. CO

ZROBIĆ, BY JAK NAJMNIEJ ZWIERZĄT

SKŁADAŁO OFIARĘ ŻYCIA NA OŁTARZU

NAUKI, A TE, KTÓRE POŚWIĘCONO, NIE

MUSIAŁY CIERPIEĆ?

Człowiek zabijał i nadal zabija zwierzęta z wielu powodów,

najczęściej jednak, żeby je zjadać. Zwierzęta doświadczalne

stanowią szczególną grupę ofiar i choć ich liczba w stosunku do

liczby zjedzonych jest nieznacząca, to właśnie wykorzystywanie

zwierząt w nauce budzi największe emocje. To o myszkach i

chomikach, a tym bardziej kotach i psach, lubimy myśleć jako o

naszych "braciach mniejszych" i zastanawiać się, czy zasłużyły

na taki los.

W ostatnich latach pojawiły się tzw. metody alternatywne,

pozwalające ograniczyć liczbę badanych zwierząt. Owe metody,

co warto podkreślić, są owocem żmudnej pracy samych

naukowców, choć, trzeba przyznać, przyspieszonej przez

społeczne ruchy obrońców zwierząt.

W niektórych rodzajach badań substytutem całego zwierzęcia

mogą być hodowle jego komórek oraz tkanek. Pewne

doświadczenia można wykonywać z udziałem niżej

zorganizowanych zwierząt, co do których sądzimy, iż ich

cierpienie i świadomość o nim są mniejsze niż istot stojących

wyżej na drabinie ewolucyjnej. Niestety, badania alternatywne

są zwykle droższe 5 do 10 razy od badań na całych

zwierzętach, a co ważniejsze, nie mogą całkowicie zastąpić

tych ostatnich

Ustawa o ochronie zwierząt ma dla doświadczeń na

zwierzętach dwa zasadnicze skutki.

Po pierwsze, został utworzony system komisji etycznych i nie

można przeprowadzać eksperymentów bez zasięgnięcia ich

opinii. Już sama świadomość, że projekt będzie oceniany

pod tym kątem, pozwala na ograniczenie liczby

doświadczeń, zwłaszcza tych wiążących się ze znacznym

cierpieniem zwierząt lub nie do końca przemyślanych.

Po drugie, ustawa określa, jak należy prowadzić

licencjonowane hodowle zwierząt w zdefiniowanych -

bardzo dobrych - warunkach. Oznacza to, że zwierzęta będą

mniej cierpieć, a co również ważne, ów "materiał

doświadczalny" będzie bardziej jednolity, co pozwoli

zmniejszyć ich liczbę.

Dlaczego koty powinny

powiedzieć “nie” aspirynie?



Twój kot nieco źle wygląda, a więc podajesz mu

tabletkę aspiryny razem z karmą. Zły pomysł –

aspiryna może być prawdziwym panaceum dla

człowieka, ale u kotów powoduje problemy z układem

oddechowym oraz zapalenie wątroby. Są leki, które

działają dużo gorzej u kotów – podanie paracetamolu

powoduje śmierć u tego zwierzęcia.



Lekcja jest prosta i dobrze znana każdemu

weterynarzowi. Nie oszukujemy się – nasi

czworonożni pupile to nie ludzie. Leki wywołują u nich

określone efekty, których nie wywołują u ludzi i vice

versa. W tym właśnie tkwi bezsens testowania leków

na zwierzętach i nie ma to nic wspólnego z „obroną

praw zwierząt”.

Poszczególne gatunki różnie reagują na te same substancje, np.:



Aspiryna: lek dla ludzi – trująca dla kotów i psów



Penicylina: bardzo dobry antybiotyk – zabija świnki morskie



Choroform: środek znieczulający – zabójczy dla psów



Morfina: środek uspokajający- wywołuje agresję kotów i myszy



Strychnina: trucizna dla ludzi – nieszkodliwa dla świnek morskich



Muchomor: trujący dla człowieka – nieszkodliwy dla królika



Arsen: trucizna dla ludzi- mało szkodliwy dla owiec

Wiwisekcji NIE!!!!

Wiwisekcja

(łac. vivus –

żywy + sectio –

rozdzielanie) – zabieg

operacyjny wykonywany

na żywym zwierzęciu w

celach badawczych.

Wiwisekcja kota …

Wiwisekcja małpy…

Podsumowanie

Wyniki analizy chemicznej są źródłem

informacji jakościowych i ilościowych

o różnych formach zanieczyszczeń

występujących w badanych próbkach.

Poprzez porównanie wyników

oznaczeń z odpowiednimi normami i

standardami możliwe jest również

uzyskanie ogólnych informacji co do

stopnia toksyczności badanego

materiału. Źródłem takich informacji

mogą być natomiast wyniki badań

uzyskane za pomocą odpowiednich

biotestów.

W chwili obecnej większa część testów

oparta jest na wykorzystaniu różnych

organizmów zwierzęcych jako

elementu aktywnego. Wydaje się

jednak, że wzrastać będzie znaczenie

fitotestów, co związane jest z:

- wrażliwością organizmów

roślinnych na zmiany w środowisku

życia,
- rosnącą liczbą regulacji prawnych

zalecających stosowanie fitotestów

Document Outline