BIOTESTY W EKOTOKSYKOLOGII

Intensywny rozój nowych technologii, postępująca urbanizacja oraz konsumpcyjny styl życia człowieka przyczyniają się do niekorzystnych często nieodwracalnych zmian w środowisku. Do powietrza, wód powierzchniowych i gleb dostaje się niezliczona ilość różnorodnych zanieczyszczeń i substancji pochodzących głównie ze źródeł antropogennych. W wyniku przemieszczania, przemian chemicznych, biologicznych oraz fotochemicznych szkodliwych substancji następuje zróżnicowanie ich stężenia w poszczególnych niebiotycznych elementach środowiska. Stąd związki chemiczne przedostają się do roślin, organizmów zwierzecych a ostatecznie także do organizmów ludzkich. Zanieczyszczenia te mogą wywoływać liczne niekorzystne efekty dlatego też ważne jest kontrolowanie stanu środowiska.

Kontrola substancji toksycznych możliwa jest dzięki różnego rodzaju testom. Znane są nam dwa rodzaje testów: testy toksykologiczne oraz biotesty czy testy ekotoksykologiczne. Pierwsze stosowane są toksykologii do ilościowej oceny toksyczności substancji chemicznej an podstawie pomiaru toksyczności u organizmów laboratoryjnych. Dzięki czemu można ocenić ryzyko oddziaływania tych substancji na zdrowie i życie człowieka. Naomiast zasadniczym celem biotestu jest zbadanie losów substancji chemicznych i skutków ich działania w ekosystemach.

Ważną rolę w standaryzacji testów toksyczności odgrywa Organizacja ds. Współpracy Ekonomicznej i Rozwoju OECD. Zajmuje się ona przygotowywaniem, opracowywaniem oraz rozpowszechnianiem ostatecznych wersji szczegółowych procedur dotyczących testowania substancji chemicznych, badań ich degradacji i gromadzenia w organizmach i środowisku. Aktualnie istnieje ponad 400 takich procedur, znależć je można na stronie organizacji.

Normą wprowadzoną do kodesku etycznego przeprowadzających testy toksyczności jest zasada trzech R, która nakazuje:

- zmniejszenie liczby zwierząt wykorzystywanych w doświadczeniach

- zastępowanie zwierząt metodami alternatywnymi

- doskonalenie stosowanych metod

prawo Unii Europejskiej nie wymusza jednak całkowitego zakazu doświadczeń na kręgowcach o ile przeprowadzający je ponoszą odpowiedzialność za słuszność tych badań. Za cele usprawiedliwiające prowadzenie doświadczeń na zwierzętach uważa się:

• opracowywanie, wytwarzanie i testowanie nowych leków

• zapobieganie, diagnozowanie i leczenie chorób ludzi, zwierząt i roślin

• ochrona śrdowiska naturalnego dla dobra ludzi i zwierząt

Zakaz testowania kosmetyków na zwierzętach w Polsce w 2004 w UE w 2009

Testy toksyczności powinny umożliwić ostateczną ocenę ryzyka dla środowiska, a więc zarówno narażenie na oddziaływanie substancji toksycznych, jak i powodowane przez nie skutki. Procedury związane z szacowaniem ryzyka wymagają rozpoznania zagrożenia, oceny zależności między dawką (stężeniem) a reakcją organizmów, oceny ekspozycji na substancję toksyczną i scharakteryzowanie ryzyka - czyli określenia, jakie mogą być nieodwracalne skutki działania danej substancji na różne składowe ekosystemu i w jakich warunkach mogą wystąpić. Oceny ryzyka dokonywane są w jednakowy sposób w różnych krajach, w UE postępowanie określają stale uaktualniane dyrektywy, które mają na celu harmonizowanie zasad prowadzenia oceny ryzyka.

Biotesty dzielimy ze względu na:

-efekty: testy toksyczności ostrej i chronicznej

- miejsce przeprowadzania testu: in situ i laboratoryjne

- rodzaj analizowanej próbki: próbki środowiskowe oraz przygotowane w laboratorium związki chemiczne i ich mieszaniny

- czas uwidocznienia efektów (rys)

Uwzględniając ogromną różnorodność gatunków żyjących w naturze, lista organizmów wykorzystywanych do testów stanowi bardzo niewielką ich cząstkę. Ponadto gatunki te muszą spełniać określone kryteria aby ich badanie dawało możliwość wnioskowania o toksyczności danej substancji dla różnych gatunków. Jest to niestety warunek bardzo trudny do spełnienia gdyż nawet gatunki bardzo blisko spokrewnione może charakteryzować bardzo specyficzna wrażliwość na działanie tej samej substancji toksycznej. Co więcej znaczne różnice we wrażliwości obserwuje się między różnymi stadiami rozwojowymi czy też w różnych okresach życia jednego gatunku. Tym bardziej żaden organizm testowy nie jest tak naprawdę reprezentatywny dla większych jednostek taksonomicznych (rząd, gromada). Dlatego gatunki muszą spełniać następujące warunki:

• szeroko dostępny z kultur laboratoryjnych, wylęgarni, hodowli lub łatwy do zbierania w terenie

• łatwa hodowla w warunkach laboratoryjnych

• dostępność w ilościach potrzebnych dla danego testu

• znany genotyp, rodowód lub historia rozwoju danej kultury (np. bakterii)

• krótkie cykle życiowe

W badaniach środowisk wodnych często wykorzystywane są mikroorganizmy ze względu na niskie koszty pozyskiwania, łatwe w reprodukcji oraz mają istotne znaczenie dla środowiska.

Inne cechy muszą spełniać gatunki biowskaźnikowe, które są używane do biomoniotringu substancji chemicznych w środowisku mianowicie powinny one być:

• łatwe do oznaczenia

• długo żyjące i łatwe do odłowu w ciągu roku

• szeroko rozprzestrzenione i pospolite

• umożliwiające porównania na odległych od siebie stanowiskach

• wystarczająco liczne

• prowadzące osiadły tryb życia

• odporne na stres związany z dotykaniem, przetrzymywaniem oraz transportowaniem

• zdolne do tolerancji niskich dawek różnych toksyn

• wykazujące mierzalną odpowiedź, proporcjonalną do stężenia badanej substancji

• przejawiać podobny typ odpowiedzi na ten sam czynnik stresowy niezależnie

Jeszcze jednym rodzajem organizmów wykorzystywanym w biomonitoringu i ocenie skutków powodowanych przez substancje toksyczne, są tzw. gatunki posterunkowe, czyli różne gatunki zwierząt udomowionych, hodowlanych czy też lokalnych.

Z faktu, że poszczególne gatunki wchodzące w skład dowolnego zespołu mogą się zasadniczo różnić pod względem wrażliwości na rozmaite substancje toksyczne, pojawiają się trudności z oszacowaniem ryzyka środowiskowego. Zagrożenia ekosystemów płynące z działalności człowieka pociągnęły za sobą konieczność określenia „bezpiecznych stężeń” zapewniających ochronę ekosystemów oraz opracowanie racjonalnych metod oceny ryzyka środowiskowego. Często nawet przybliżony szacunek ryzyka jest lepszy niż całkowity brak informacji. Zdając sobie sprawę ze wszystkich trudności i niedoskonałości metod badawczych trzeba korzystać z obliczeń matematycznych do przybliżonej oceny ryzyka. Jedną z metod jest metoda ekotoksykologii stosowanej znanej jako SSD (ang. Species sensitivity distributions, rozkład wrażliwości gatunków). Badaniom ekotoksykologicznym poddaje się tylko nieliczne gatunki z zespołu (zaznaczone na rys. Czarnymi kropkami) co pozwala na oszacowanie rozkładu wrażliwości dla całego zespołu (linia ciągła). Metoda polega na wyznaczeniu empirycznego rozkładu wrażliwości organizmów w zespole (ekosystemie) na podstawie testów nielicznych tylko gatunków reprezentujących ten zespół, a następnie określeniu bezpiecznego stężenia badanej substancji na podstawie tak oszacowanego rozkładu. Miarą wrażliwości gatunku jest z reguły stężenie, przy którym nie zaobserwowano negatywnych skutków działania substancji na badane organizmy, np. NOEC, lub stężenie powodujące minimalne skutki, np. EC₁₀ obliczane z kolei na podstawie doświadczalnie poznanych zależności dawka-reakcja (stężenie-reakcja).

OCENA EFEKTÓW TOKSYCZNYCH

Badania toksyczności próbek środowiskowych mogą przyczynić się do rozwiązania trzech zasadniczych problemów:

- oceny ryzyka, czyli prawdopodobieństwa wystąpienia negatywnego oddziaływania danego czynnika na żywy organizm

- określenie jak wysoka jest jego toksyczność, poprzez wyznaczenie dawki wywołującej efekt toksyczny

- próba wykrycia odległych skutków eksopzycji organizmu na czynniki toksyczne

Badania toksykologiczne można prowadzić na dwa sposoby:

- poprzez badania epidemiologiczne, polegające na obserwacji pewnej populacji ludzkiej narażonej na określone zanieczyszczenia środowiska, co umożliwia bezpośrednie oszacowanie ryzyka narażenia człowieka

- poprzez stosowanie metod laboratoryjnych prowadzonych z wykorzystaniem różnych modeli doświadczalnych i podjęcie próby wykorzystania uzyskanych wyników do oceny wielkości narażenia człowieka.

W zależności od stosowanego modelu metody laboratoryjne dotyczyć mogą badań toksyczności w stosunku do:

- całego organizmu - hodowli komórek

metody in vivo metody in vitro

- wybranego narządu - reakcji enzymatycznych

W przypadu prowadzenia badań z wykorzystaniem prostych modeli doświadczalnych in vitro oraz badań na zwierzętach otrzymuje się zależność między dawką (stężeniem) czynnika toksycznego a odpowiedzią biologiczną, czyli reakcją organizmu na tę dawkę. W badaniach toksykologicznych parametrem mierzonym jako odpowiedź biologiczna może być np. hamowanie wzrostu komórek, aktywność odpowiedniego enzymu, przyśpeiszony oddech osobnika, żywotność lub śmiertelność, itp.

Na podstawie zależności dawka - odpowiedź wyznaczyć można wartości wskaźnikowe będące ilościową miarą toksyczności badanej substancji. Siłę toksycznego oddziaływania na organizmy żywe określają takie wskaźniki jak EC₂₅ lub EC₅₀ ( Effective Concentration) oraz ED₂₅ lub ED₅₀ (Effective Dose) czyli stężenie danej toksyny w środowisku lub jej dawka wywołująca określony efekt biologiczny w wysokości 25% lub 50% jako maksymalnej wartości. Innym stosowanym wskaźnikiem jest IC₅₀ (inhibition Concentration), czyli stężenie czynnika toksycznego w środowisku które powoduje osłabienie (zahamowanie) o połowę danego procesu, np. wzrostu.

W przypadku toksyczności ostrej występuje takie oddziaływanie danej substancji, które zaburza procesy biologiczne w takim stopniu, że następuje śmierć. Miarą takiego efektu jest dawką śmiertelna LD₅₀ (Lethal Dose) czyli dawka wywołująca po określonym czasie śmierć 50% osobników badanej populacji. Często stosuje się także parametr określający stężenie śmiertelne danej substancji w wodzie, glebie lub powietrzu - LC₅₀ (Lethal Concentration). Określenie toksyczności ostrej jest zwykle wstępnym etapem oceny oddziaływania danej substancji na organizm i pozwala ukierunkować dalsze badania toksyczności.

Zależność dawka - efekt biologiczny może również służyć przewidywaniu poziomu ryzyka, tzn wyznaczenia dawki i czasu ekspozycji, przy których prawdopodobieństwo wystąpienia efektów toksycznych jest odpowiednio niskie. W tym celu szacowane są wartości stężeń lub dawek granicznych (progowych):

- NOEL /NOEC - najwyższa dawka/ stężenie substancji toksycznej, przy którym nie obserwuje się niekorzystnego efektu jej działania

- LOEL/LOEC - najniższa dawka/ stężenie przy, którym zaobserwowano pierwsze niekorzystne zmiany

- NOAEL - najwyższa dawka lub stężenie substancji, przy której w trakcie przeprowadzanych badań nie jest wykrywalna szkodliwa zmiana

- LOAEL - najniższa dawka lub stężenie substancji przy której w trakcie przeprowadzanych badań zauważa się szkodliwą zmianę

Zaobserwowane skutki działania toksyn dotyczyć mogą zmian w morfologii, życiowej działalności, wzrostu, rozwoju lub okresu życia badanych organizmów. Wyżej wymienione wskaźniki wyrażone są w mg lub μg danej substancji na 1 kg masy ciała organizmu na 1 dobę.

W celu dokonania oceny ryzyka wykorzystuje się również graniczne stężenia efektywne EC₁₀ lub EC₁₅, które wywołują dany efekt biologiczny odpowiednio na poziomie 10% lub 15% jego maksymalnej wielkości.

O efekcie toksyznym danej substancji decyduje jej mała podatność na metabolizm, co w połączeni z właściwościami lipofilowymi znacznie utrudnia jej wydalanie powodując kumulację w organizmie. Ocenę zdolności toksyny do kumulacji w organizmie można dokonać poprzez porównanie przykładowo wartości CLD₅₀ (Cumulative Lethal Dose) z wartościami parametru LD₅₀.

Dłuższy czas obserwacji i opisowy charakter wyników charakteryzuje metody badania toksyczności podostrej i przewlekłej. Dotyczą one całego organizmu i polegają na obserwacji procesów komórkowych i biochemicznych, funkcji fizjologicznych oraz zachowania się osobników. Natomiast po śmierci zwierząt przeprowadza się obserwacje zmian makro i mikroskopowych w narządach, które zaszły podczas ekspozycji na toksynę. Dodatkowo badanie toksyczności przewlekłej obejmuje tzw. zakres badań specjalnych. Może bowiem nastąpić działanie kancerogenne związku, mutagenne bądź efekt embriotoksyczny.

SPOSÓB PRZEPROWADZENIA OCENY ZAGROŻENIA DLA ŚRODOWISKA

Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dn. 18 lutego 2003 r. (Dz. U. Nr 52, poz.467, załącznik nr 3), odnośnie sposobu dokonywania oceny ryzyka dla środowiska, celem oceny zależności dawka - odpowiedź biologiczna jest oszacowanie stężenia substancji w określonych elementach lub przedziałach środowiska, poniżej którego nie należy spodziewać się wystąpienia szkodliwych zmian w środowisku. Stężenie takie określa się jako przewidywane stężenie niepowodujące zmian w środowisku (predicted No Effect Concentration - PNEC). Wartość PNEC oblicza się wprowadzając odpowiedni współczynnik szacowania (Uncertainty Factor - UF) do wyników badań (przeprowadzonych na organizmach żywych) takich jak: LD₅₀, LC₅₀, EC₅₀, IC₅₀, NOEL/ NOEC, LOEL/LOEL lub inne odpowiedni wyniki badań. Następnie porównuje się wartości parametru PEC, czyli wartość prognozowanego stężenia substancji w środowisku (Predicted Effect Concentration) z wartością parametru PNEC. Na podstawie wartości stosunku PEC/PNEC wnioskuje się m.in. czy dotychczas podejmowane działania w celu ograniczenia ryzyka są wystarczające.

PODZIAŁ METOD BIOLOGICZNYCH WYKORZYSTYWANYCH W BADANIACH ŚRODOWISKA

Metody analityczne wykorzystujące materiał biologiczny stanowią poważną konkurencję dla klasycznych metod analitycznych, głównie dzięki swojej specyficzności, szybkości i możliwości zastosowania in situ. Ich zastosowanie umożliwia dokonanie sumarycznego pomiaru obciążenia próbki przez zanieczyszczenia różnego rodzaju w skomplikowanych, złożonych matrycach środowiskowych bez praco- i czasochłonnych etapów wstępnego przygotowania pobranych próbek. Ogólnie wyróżnia się dwie grupy zastosowań metod biologicznych:

- biomonitoring, który może być realizowany przez:

• badania analityczne próbek materii ożywionej traktowanych jako tzw. pasywne próbniki akumulacyjne dla zanieczyszczeń

• poprzez obserwację biowskaźników

- bioanalityka powiązana z wykorzystywaniem substancji aktywnych biologicznie jako receptorów określonych zanieczyszczeń, ze względu na sposób wykorzystania składnika biologicznego można mówić o:

• bioczujnikach, gdy składnik aktywny biologicznie (bakterie, wirusy, enzymy, przeciwciała) stanowi część aktywną odpowieniego czujnika

• biotestach gdy materiał biologiczny stanowi oryginalne urządzenie kontrolno-pomiarowe

Biotest (gr. bios - życie, łac. testari - świadczyć) można zdefiniować jako eksperymentalną próbę biologiczną której celem jest wykazanie obecności substancji toksycznych w środowisku albo poznaniu jej szkodliwości poprzez ilościowe oszacowanie wpływu tej substancji na żywy organizm. Pomiar toksyczności jest bowiem jeszcze jednym przykładem pomiaru względnego powszechnego w klasycznej analiyce chemicznej.

SPOSOBY PRZEPROWADZANIA BADAŃ Z WYKORZYSTANIEM BIOTESTU

Istnieją trzy główne sposoby przeprowadzania badań z wykorzystaniem biotestu:

1A. testy toksyczności realizowane w laboratorium, w czasie których substancja toksyczna jest sztucznie wprowadzana do czystej wody lub osadu. Test taki informuje o toksyczności danej substancji w warunkach kontrolowanych. Wykonywany jest w celu przeprowadzenia wzorcowania biotestu, który następnie zostanie wykorzystany do oszacowania toksyczności próbek rzeczywistych.

1B. Testy toksyczności prowadzone w laboratorium na bazie pobranych próbek rzeczywistych (woda, gleba i osady). Toksyczność próbek jest porównywana z toksycznością próbek wzorcowych.

2. Testy przeprowadzane in situ z wykorzystaniem populacji organizmów żyjących w warunakch naturalnych.

Podstawowych informacji na temat skażenia danego elementu środowiska dostarczają biotesty realizowane z wykorzystaniem pojedynczego gatunku roślinnego lub zwierzęcego, reprezentującego określony poziom troficzny. Testy te przeprowadzane są według znormalizowanych procedur w ściśle określonych warunkach laboratoryjnych - optymalnych dla danego organizmu testowego. W celu dokładniejszego zbadania skomplikowanych zależności potencjalnie toksycznych związków chemicznych z organizmami zasiedlającymi określone ekosystemy przeprowadza się eksperymenty w mikrosystemach. Do dużych kilkuset litrowych naczyń wprowadza się zespoły organizmów, stymuluje się warunki naturalne dominujące w badanym elemencie środowiska. Mikrosystemy mogą być źródłem informacji o wpływie substancji toksycznych zarówno na poszczególne gatunki, poziomy troficzne jak i na całą społeczność organizmów. Jeszcze rzadziej wpływ toksyn bada się w kosztownych mezosystemach - izolowanych wycinkach jeziora lub sztucznych strumieniach, do których w sposób kontrolowany wprowadza się związki chemiczne. Układy te poddawane są naturalnej zmienności warunków środowiskowych (wiatry, temperatura, nasłonecznienie).

Według innej klasyfikacji biotesty mogą być realizowane w warunkach:

- statycznych - badana woda lub osad nie podlega wymianie w trakcie trwania testu

- półstatycznych- wymiana medium następuje w określonych odsępach czasowych (np. co 24 godziny, co tydzień), w ten sposób realizowane są testy z wykorzystaniem skorupiaka Daphnia magna

- dynamicznych - przy stalej wymianie wody, podczas testów przeprowadzanych w mezosystemach, in situ, głównie z wykorzystaniem ryb jako czynnika biologicznego.

Biotesty można również podzielić ze względu na rodzaj organizmu, będącego elementem aktywnym testu. Najczęściej wykorzystuje się:

- rosliny

- bakterie

- organizmy zwierzęce

TESTY BAKTERYJNE

Biotesty stanowią ważny element bioanalityki i biomonitoringu, przeżywające obecnie okres gwałtownego rozwoju. Jednym z przykładów jest badanie bioluminescencji morskich bakterii Vibrio Fischeri, które stanowią użyteczne narzędzie do oceny stopnia zanieczyszczenia wód, osadów dennych i gleb. Toksyczność każdego z ekosystemów określana jest na podstawie pomiaru bioluminescencji bakterii, które w trakcie swoich funkcji życiowych emitują światło.

Toksyczne działanie poszczególnych związków może wynikać z:

• oddziaływania toksyny z receptorami komórkowymi

• przerwania funkcji membrany komórkowej

• reakcji chemicznych z elementami składowymi komórki

• hamowania/ współzawodnictwa systemów enzymatycznych

Obecnie do najczęściej stosowanych urządzeń dostępnych handlowo, oparte na bioluminescencji bakterii Vibrio fischeri, należą:

• ToxAlert®10 (Merck)

• ToxAlert®100 (Merck)

• LUMIStox® (dr. Bruno Lange)

Badania toksycznosci dla tych samych związków przeprowadzone na różnych testach wykazują pewne rozbieżności. Mogą one wynikac z różnic w procedurach analitycznych poszczególnych testów, składu stosowanych reagentów oraz sposobu przygotowania bakterii przez producenta. Dlatego ważne jest wykonaie przy każdej serii badań testu dla roztworu kontrolnego [Zn⁺⁺] w postaci siedmiowodnego siarczanu cynku.

TESTY OPARTE NA WYKORZYSTANIU ROŚLIN (FITOTESTY)

W przypadku tego rodzaju testów jako czynnik aktywny wykorzystywane są glony (zielenice, sinice, okrzemki), rzęsa wodna, ukorzenione makrofity (roślina i jej nasiona) wodne i lądowe. Zmiany zachodzące w roslinach mogą bezpośrednio wpływac na zmiany całego ekosystemu. Przez długi czas najbardziej popularnym sposobem wykorzystania roślin do oceny jakosci środowiska wodnego był monitoring in situ. Dopiero niedawno znalazły one zastosowanie do oceny zagrożenia wynikającego z zanieczyszczenia środowiska wodnego.

A. Zastosowanie alg jako elementu aktywnego fitotestów

Wybór gatunku do danego testu zależy od jego dostępności, wymagań hodowli oraz łatwości użycia. Na podstawie tych kryteriów zaleca się stosowanie mikroalg (w postaci mikrobiotestu) spośród których dwa najczęściej testowane gatunki należą do zielenic są to: Selenastrum capricornutum i Scenedesmus quadricauda.

Cytometria przepływowa stanowi szybką metodę pomiaru ilości komórek w przepływającym medium, umożliwia pominięcie ograniczeń metod tradycyjnych, do których należą:

- wysoka, niemożliwa do osiągnięcia w warunkach naturalnych, gęstość komórek co prowadzi do starzenia się gatunku

- brak technik umożliwiających liczenie komórek i jednoczesne rozróżnienie pomiędzy komórkami żywymi a martwymi oraz materią zawieszoną

- niemożność wyznaczenia w czasie więcej niż jednego parametru charakteryzującego dany gatunek

- niemożność uzyskania informacji o mechanizmie toksycznego działania zanieczyszczeń

Mikroalgi są powszechnie stosowane w cytometrii przepływowej ze względu na budowę (pojedyncze komórki) i zawartość fotosyntetycznego barwnika - chlorofil a - wzbudzany przez światło niebieskie. W śrdodwisku wodnym na populacje alg składają się organizmy różnych gatunków (podczas zakwitów jest jeden gatunek) a dzięki cytometrii przepływowej możliwe jest rozdzielenie poszczególnych gatunków na podstawie odbieranego sygnału - fluorescencji.

Inną techniką przeprowadzania testów z użyciem mikroalg jest ich unieruchomienie na specjalnym podłożu - immobilizacja. Unieruchomienie zapobiega przez wymyciem komórek i spożyciem przez zwierzęta roślinożerne. Tak przygotowane hodowle utzrymują stałość procesów oddychania i fotosyntezy, po 12 miesiącach przechowywania ich w ciemności i 4 st C powracają do normalnego wzrostu. Do tej pory immobilizacja komórek alg miała zastosowanie głównie w oczyszczaniu wód ściekowych z metali ciężkich, związków azotu i fosforu. Ostatnio stosuje się je do kontroli jakości wody stosowanej podczas hodowli ryb.

B. ZASTOSOWANIE ROŚLIN NACZYNIOWYCH JAKO ELEMENTU AKTYWNEGO FITOTESTÓW

Badania toksyczności z wykorzystaniem roślin naczyniowych odnoszą się głównie do pestycydów, WWA oraz metali ciężkich. Makrofity niezwykle rzadko znajdują zastosowanie w testach toksyczności, jednak jeśli są stosowane to najczęściej dotyczy to rzęsy wodnej która jest gatunkiem reprezentatywnym dla wszystkich roślin naczyniowych. Cechami decydującymi o wykorzystaniu w biotestach są małe rozmiary, łatwość hodowli oraz krótki czas rozmnażania.

C. ROŚLINY ZAKORZENIONE

Zakorzenione rośliny bardzo rzadko znajdują zastosowanie w testach toksyczności ze względu na duże rozmiary, powolny wzrost oraz brak ustalonych metod przeprowadzania testów. W literaturze spotyka się informacje o wykorzystaniu wywłócznika kłosowego (Myriophyllum spicatum) i różnolistnego (M. hydrophyllum). Rośliny mogą być hodowane w laboratoriach lub pozyskiwane do testów z naturalnych źródeł.

TESTY OPARTE NA WYKORZYSTANIU ORGANIZMÓW ZWIERZĘCYCH

Testy wykorzystujące zwierzęta są stosowane o wiele częściej niż fitotesty, stanowiące jedynie 10% wszystkich danych na temat toksyczności. Przyczyną może być fakt, iż rośliny uważane są za mniej wrażliwe na toksyny jednak nie jest to poparte jednoznacznymi wynikami badań. Jasne jest to, że wrażliwość zarówno roslin jak i zwierząt zależy od warunków środowiska: materii organicznej, pH, temperatury, zasadowości, twardości, obecności ligandów oraz wzajemnych oddziaływań substancji toksycznych.

NOWE TENDENCJE W ZAKRESIE WYKORZYSTANIA BIOTESTÓW W BADANIACH ŚRODOWISKOWYCH

A. Zespoły (baterie) biotestów

Stosując test wykorzystujący tylko jeden gatunek nie mamy pełnego obrazu zagrożenia, ponieważ szacowana toksyczność odnosi się tylko do jednego testowanego gatunku. Wynik takiego postępowania jest obarczony błędem ujemnym w odniesieniu do całego ekosystemu. Błąd można zmniejszyć poprzez zastosowanie baterii (zespołu) biotestów, których działanie oparte jest na wykorzystaniu organizmów o różnej wrażliwości i reprezentujących różne poziomy troficzne. Postępowanie takie jest często stosowane podczas badania skomplikowanych mieszanin związków o nieznanych właściwościach.

Porównania wzajemnej wrażliwości gatunków organizmów tworzących baterię można dokonać na podstawie wartości parametru „w” obliczonej wg:

w = NOEC_x/NOEC_średnie

gdzie:

NOEC_x - stężenie substancji toksycznej, przy którym nie obserwuje sie niekorzystnego efektu jej działania, otrzymane w wyniku zastosowania badanego testu

NOEC_średnie - średnia arytmetyczna wartości NOEC, obliczona na podstawie wszystkich tworzących baterię testów

Na podstawie wartości parametru „w” wnioskuje się o czułości biotestu. Jeśli wartość „w” obliczona dla danego testu jest mnijesza od jedności w<1 to organizmy stosowane w teście są wysoko względnie wrażliwe w stosunku do badanej substancji toksycznej.

B. mikrobiotesty

Mikrobiotesty są to zminiaturyzowane testy działające w oparciu o organizmy jednokomórkowe które w wyniku kontaktu z próbką ciekłą wykazują specyficzną odpowiedź. Jako, że mikroorganizmy stanowią podstawowe ogniwo w łańcuchu pokarmowym, wszelkie zmiany ich dotyczące mogą istatnie wpływać na organizmy wyższych poziomów troficznych, a w konsekwencji na stan całego ekosystemu. Ze względu na duża powierzchnię właściwą i bezpośredni kontakt błony komórkowej z badanym medium, mikroorganizmy wykazują większą wrażliwość w stosunku do substancji toksycznych, niż bezkręgowce. Kolejną zaletą stosowania mikroorganizmów w testach toksyczności jest szybkość zmiany pokoleń, dzięki czemu można badać wpływ toksyn przy długotrwałym narażeniu, istotne są także:

- eliminacja konieczności utrzymania hodowli

- niski koszt przeprowadzenia analizy pojedynczej próbki

- możliwość jednoczesnego badania kilku próbek

- krótki czas odpowiedzi

- mała objętość badanej próbki

- niewielka przestrzeń zajmowana w laboratorium przez odpowiedni zestaw i możliwość zabrania go w teren

- decydują o rosnącym zainteresowaniu tą metodą oceny stopnia zanieczyszczenia środowiska

PODSUMOWANIE

Odpowiednie biotesty mogą być wiarygodnym źródłem informacji o toksycznym oddziaływaniu na organizmy żywe jak i środowisko różnych związków chemicznych znajdującyc się w badanych próbkach środowiskowych.

W chwili obecnej większa część testów oparta jest na wykorzystaniu organizmów zwierzęcych jako elementu aktywnego testu. Jednak cały czas wzrasta udział fitotestów co związane jest z:

- wrażliwością organizmów roślinnych na zmiany w środowisku życia

- rosnąca liczbą reguacji prawnych zalecających stosowanie fitotestów

Liczne publikacje dotyczące biotestów zawierają informacje na temat doświadczeń przeprowadzanych w mikro- i mezosystemach. Z kolei szybkie uzyskanie danych na temat staopnia skażenia danego elementu środowiska umożliwia zastosoawnia mikrobiotestów. W celu uniknięcia niedoszacoawnia toksyczności badanej próbki powszechne są zespoły biotestów.

Nie ma wątpliwości, że obszar zastosowania biotestów będzie coraz szerszy a uzyskane w ten sposób informacje będą stanowiły podstawę do podjęcia badań z wykorzystaniem kalsycznych metod analitycznych.

Nowe tendencje dotyczące biotestów:

- badania nad opracowaniem nowych typów biotestów

- wprowadzania do praktyki analitycznej handlowo dostępnych biotestów

- nowych zastosowań znanych typów biotestów

---