Śledziona – potencjalne

źródło nowych wysp w

transplantacji

Anna Klimaszewska

Biotechnologia III

grupa 2

Transplantacja wysp trzustkowych

stwarza możliwość zahamowania lub
wyeliminowania powikłań
narządowych cukrzycy. Ostatnie próby
kliniczne dotyczące przeszczepu
allogenicznych wysp trzustkowych
odniosły bardzo pozytywne rezultaty:
rok po operacji 85% dorosłych
pacjentów było zdolnych do
utrzymania normoglikemii bez
konieczności podawania insuliny
egzogennej.

PROBLEM KLINICZNY

 Transplantacja wysp trzustkowych u dzieci jest aktualnie

ograniczona przez wymóg:

• długoterminowej immunosupresji
• młodego wieku dawców

 Wymagane jest zatem alternatywne źródło wysp trzustkowych

pozwalające na przezwyciężenie tych trudności

Cel doświadczeń

stwierdzenie czy rozwijająca się śledziona

ptasich embrionów jest zdolna do

wytwarzania komórek produkujących

insulinę (insulin-producing cells IPCs)

badanie efektu zmian wzajemnego

stosunku tkanek (śledziony do nabłonka

trzustki) i całkowitej ilości tkanek u

rekombinantów

Cel 1:

Cel 2 i 3:

METODY

METODY cd.

 Rekombinanty chimerycznych embrionów

kurczaka i przepiórki zostały skonstruowane
przez rekombinacje śledziony embrionu
przepiórki z nabłonkiem trzustki kurczaka

 Suma i stosunek mezenchymy śledzionowej do

epitelium trzustki kurczaka były zmieniane w
każdym eksperymencie:

w doświadczeniu 1:
rekombinacja w stosunku 1:1 (12 rekombinantów)

METODY cd.

w doświadczeniu 2:
rekombinacja w stosunku 2:1 (9

rekombinantów)

w doświadczeniu 3:
rekombinacja w stosunku 2:2 (5 rekombinatów)

reakcje kontrolne:
pobranie (dzień 0) reprezentatywnych nabłonków trzustkowych
kurczaka i śledziony przepiórek

METODY cd.

Hodowla in vitro

 całonocna inkubacja rekombinantów w 1%
agarozie z medium RPMI 1640 (10% surowica
płodowa cielęca, 1% L-glutamina, 0,3%
penicylina/streptomycyna)

siedmiodniowa inkubacja rekombinantów w
medium RPMI w aparacie do hodowli

Przygotowanie do barwienia

utrwalenie tkanki 4%
paraformaldehydem

ANALIZA

 immunohistochemia fluorescencyjna
• przeciwciała specyficzne dla komórek beta (przeciwciała

przeciw insulinie świnki morskiej) i komórek przepiórki
(QCPN mouse anti-quail-specific nucleolar antigen) +
znakowane wtórne przeciwciała

• skrawki zostały wybarwione DAPI (4',6-diaminoino-2-

fenylindol)

 mikroskopia fluorescencyjna
 analiza reakcji kontrolnych
• W celu zidentyfikowania:
tkanek śledziony przeprowadzono hybrydyzacje in situ

ze specyficznym markerem rozwojowym tlx-1 (hox-11)

nabłonka trzustki zastosowano przeciwciała przeciwko

insulinie

WYNIKI

 reakcje kontrolne wypadły negatywnie

 dośw. 1:

rekombinując jedną śledzionę przepiórki z jednym

nabłonkiem trzustkowym kurczaka otrzymano IPC-ty

pochodzenia śledzionowego u 5 z 12 rekombinantów

(42%)

 dośw. 2:
rekombinując 2 śledzione przepiórek z 1 nabłonkiem

trzustkowym kurczaka otrzymano IPC-ty pochodzenia

śledzionowego u 3 z 9 rekombinantów (33%)

 dośw. 3:
rekombinacja w stosunku 2:2 - IPC-ty pochodzenia

śledzionowego u 4 z 5 rekombinantów (80%)

Ogólnie 12 (46%) z 26 rekombinantów zawierało IPC-ty

pochodzenia śledzeniowego

Przykłady morfologii „śledzionowych wysp”

widzianych w mikroskopie fluorescencyjnym

WNIOSKI

I.

Wstępne wyniki sugerują, że rozwijające się
ptasie śledzony mogą różnicować się w IPC-ty
(46% rekombinantów)

II.

Przy podwajaniu ilości każdej tkanki wzrasta
proporcjonalnie udział % rekombinantów, u
których zaobserwowano ten proces

III.

Stosunek śledzionowej mezenchymy do
nabłonków trzustki kurczaka nie miał na to
wpływu

IV.

Śledziona jest potencjalnie idealnym źródłem
wysp w transplantacji dziecięcej

ŹRÓDŁO

The spleen—a potential source of new islets
for transplantation?
Stuart A. Robertson, Autumn M. Rowan-Hull, Paul

R.V. Johnson

Paediatric Surgical Research Laboratory, Nuffield

Department of Surgery, University of Oxford,

John Radcliffe Hospital,

OX3 9DU Oxford, United Kingdom
Received 8 October 2007; accepted 9 October

2007