Aminokwasy
ednogenne
Aminokwasy
egzogenne
Alanina
Fenyloalanina
Arginina
Histydyna
Asparagina
Izoleucyna
Aspraginian
Leucyna
Cysteina
Lizyna
Glicyna
Metionina
Glutamina
Treonina
Glutaminian
Tryptofan
Prolina
Walina
Seryna
Tyrozyna
Nadprodukcja aminokwasów
• 2-oksoglutaran + NH4= aminokwas
• NH4< 2 mmol/ l
• Enzym: Syntetaza glutaminowa
szczawiooctan
asparaginian
treonin
a
Rodziny biosyntetyczne
aspragina
metioni
na
izoleucyn
a
lizyna
pirogronian
alanina
Rodziny biosyntetyczne
walina
leucyna
Rodziny biosyntetyczne
α-ketoglutaran
glutaminia
n
glutami
na
prolina
arginina
Mechanizm kontroli
• Normalne stężenie aminokwasu
powoduje represję genów syntezy
enzymów uczestniczących w jego
wytwarzaniu
• Nadmiar aminokwasu powoduje
zahamowanie aktywności enzymów
uczestniczących w jego wytwarzaniu
Warunki nadprodukcji
• Przepuszczalność błony cytoplazmatycznej
• Stężenie biotyny
• Zmiana preferencji metabolicznych przez hamowanie
jednego z odgałęzień szlaku metabolicznego
• Dodatek prekursorów przeciwdziałających regulacji
metabolicznej szlaku ( np. 2-oksomaślan –
nadprodukcja Ile)
• Regulacja aktywności enzymów w obrębie szlaku
metabolicznego
• Mutanty ( auksotrofy) nie syntezujące enzymu i
blokada odgałęzienia szlaku metabolicznego
• Mutanty regulatorowe ( układ sprzężenia zwrotnego)
Warunki nadprodukcji
• Mutanty ( auksotrofy) nie syntezujące enzymu i
blokada odgałęzienia szlaku metabolicznego
• Mutanty regulatorowe ( zakłócony układ sprzężenia
zwrotnego)
• Mutanty konstytutywne : depresja genów syntezy
enzymów wybranych odgałęzień szlaku
metabolicznego
• Mutanty syntezujące enzymy szlaku produkcyjnego
niewrażliwe na inhibicję produktem
• Projektowanie i konstrukcja szczepów metodami
inżynierii genetycznej. Mutacja genetyczna z uzyciem
technologii rekombinowanego DNA.
Mutanty żywieniowe
Kwas glutaminowy
Otrzymywanie kwasu
L-glutaminowego
• W postaci glutaminianu sodu
tradycyjnie był otrzymywany metodą
kwaśnej hydrolizy bogatych w ten
aminokwas białek pszenicy.
Opracowanie jednostopniowej
syntezy praktycznie wyeliminowało
tą metodę. Obecnie glutaminian sodu
produkowany jest wyłącznie metodą
mikrobiologiczną.
Kwas glutaminowy… czym
właściwie jest?
To aminokwas endogenny o kwaśnym
odczynie,
obecny prawie we wszystkich
białkach.
Jest on ważnym neuroprzekaźnikiem
pobudzającym
w korze mózgowej ssaków.
Uczestniczy w
przemianach
azotowych, poprzez przemianę w
glutaminę. Kwas glutaminowy jest stosowany w
leczeniu układu nerwowego.
Zdolność do wytwarzania tego
metabolitu wykazują m.in.:
Corynebacterium
Brevibacterium
Microbacterium
Kwas L-glutaminowy
przykładem nadprodukcji
przy zastosowaniu
bakterii z rodzaju
Corynebacterium oraz
Brevibacterium
Dlaczego właśnie te
mikroorganizmy?
U bakterii kwasu glutaminowego istnieje silna preferencja
syntezy L-glutaminianu do innych aminokwasów:
- duża aktywność syntazy cytrynianowej (powstaje cytrynian),
- bardzo niska aktywność dehydrogenazy 2-oksoglutaranowej,
• - duża aktywność dehydrogenazy glutaminowej (70*silniejsze
powinowactwo do 2-oksoglutaranu niż dehydrogenaza 2-
oksoglutaranowa)
Duża aktywność dehydrogenazy glutaminowej, zależnej od
NADPH,
Wytworzenie dostatecznej ilości NADPH, podczas przemiany
cukru w szlaku HMP,
Przy czym największe
znaczenie praktyczne mają:
B.Favum
C.glutamicum
Dlaczego dochodzi do
zahamowania syntezy L-
glutaminy w komórkach?
• Głównym czynnikiem ograniczającym
nadprodukcję kwasu glutaminowego
jest wewnątrzkomórkowe stężenie
tego produktu, które w sprzężeniu
zwrotnym powoduje zahamowanie
syntezy tego aminokwasu.
BIOGENEZA KWASU
GLUTAMINOWEGO
C.glutamicum:
1. Dehydrogenaza glutaminowa
2. Dehydrogenaza
2-oksoglutaranowa
3. Liaza cytrynianowa
4. Syntaza jabłczanowa
5. Karboksylaza
fosfoenylopirogronianowa
6. Układ dehydrogenazy
pirogronianowej
Jak zwiększyć
przepuszczalność błony?
• Kontrola zawartości biotyny w
pożywce
Inne sposoby
przepuszczalności błony
komórkowej
• Poddanie błony działaniu
detergentów,
• Dodatek penicylin i cefalosporyn,
• Zahamowanie syntezy
nienasyconych kwasów tłuszczowych
oraz fosfolipidów
• Otrzymanie zależnych od glicerolu
mutantów auksotroficznych
Pozostałe warunki kontrolujące
biosyntezę L-glutaminianu
• Źródło węgla stanowi melasa burczana,
powinna być uboga w biotynę
- Może tez być glukoza, octan, sacharoza
bądź etanol
• Źródłe azotu jest gazowy amoniak lub
mocznik
• Temp. 30-36
0
C
• pH poczatkowe 7-8
• Intensywne nawietrzanie (3-5mmoli
O
2
/ml hodowli/1 min)
•
Wydajność konwersji substratu do
Wydajność konwersji substratu do
kwasu glutaminowego w
kwasu glutaminowego w
optymalnych warunkach wynosi 50%,
optymalnych warunkach wynosi 50%,
czyli ze 100 g cukru można uzyskać
czyli ze 100 g cukru można uzyskać
50 g aminokwasu.
50 g aminokwasu.
Wydzielanie kwasu L-
glutaminowego
z komórki
1 – detergenty
2 – antybiotyki (penicylina, cefalosporyny)
• Oddzielenie biomasy za pomocą wirówki
ślimakowej
• ZALETY:
- Ciągłość odprowadzania osadu
- Dla zawiesin o stężeniu 2-50%obj
- Wydajność 0,4-60 m
3
/h
Oddzielenie płynu
pohodowlanego od biomasy
Frakcjonowanie, zatężanie,
oczyszczanie
Percypitacja do pH
izoelektr
=
3.2
Kwas solny HCl
Przesącz
Filtrac
ja
Przemywanie kryształów
Stabilizacja
produktu
• Wydajność konwersji substratu do
kwasu glutaminowego w
optymalnych warunkach wynosi 50%,
czyli ze 100g cukru można uzyskać
50 g aminokwasu.
Stabilizacja produktu
Suszenie sublimacyjne jest powszechnie
stosowana metoda utrwalania biopreparatów.
Proces ten zawiera kilka etapów:
•Zamrażanie produktów w komorze
sublimacyjnej, gdzie przy stopniowo
obniżanym ciśnieniu następuje intensywne
parowanie części wody, a następnie
samozamrożenie
•Suszenie sublimacyjne (sublimacja lodu)
•Usuwanie pary wodnej z sublimatora
Dystrybucja produktu
• Światowa produkcja kwasu L-
glutaminowego, jako glutaminianu
monosodowego, szacowana jest na
blisko 400 00ton rocznie.
• 100g produktu kosztuje około 90zł