Spektrometria mas

Spektrometria mas

ZNACZĄCE POSTACIE SPEKTROMETRII MAS

ZNACZĄCE POSTACIE SPEKTROMETRII MAS

1

st

MS

Joseph John
Thomson (1856 -
1940) Cambridge
University, Great
Britain;

Nobel

Prize in Physics
1906

Ion Chemistry

Francis William Aston
(1877 - 1945)
Cambridge University, Great
Britain;

Nobel Prize in

Chemistry 1922

Ion Trap Technique

Wolfgang Paul
(1913 - 1993)
University of Bonn,
Germany;

Nobel

Prize in Physics
1989

ESI of Biomolecules

John B. Fenn (1917)
Virginia
Commonwealth
University, Richmond,
Virginia

Fragmentation
Mechanisms

Fred W. McLafferty
(1923)
Cornell University
Ithaca, New York

Peptide Sequencing
using MS

Klaus Biemann (1926)
MIT, Cambridge,
Massachusetts

MALDI

Franz Hillenkamp (1936)
University of Münster,
Germany

Mechanisms and Applications

R. Graham Cooks (1941)
Department of Chemistry,
Purdue University
West Lafayette, Indiana

Mechanism of MALDI &
ESI

Michael Karas (1952)
University of Frankfurt,
Germany

Joseph Thompson: IZOTOPY HELU

Joseph Thompson: IZOTOPY HELU

1911

ZASADA POWSTAWANIA WIDMA MAS

ZASADA POWSTAWANIA WIDMA MAS

Droga jonów w polu elektrycznym i magnetycznym:

Droga jonów w polu elektrycznym i magnetycznym:

rezultat

rezultat

działających sił:

działających sił:

•

Siła pola magnetycznego

Siła pola magnetycznego

(F

(F

m

m

)

)

•

Siła odśrodkowa

Siła odśrodkowa

(F

(F

c

c

)

)

•

Energia kinetyczna w polu elektrycznym

Energia kinetyczna w polu elektrycznym

(E)

(E)

F

m

m

= Bev

B = natężenie pola magnetycznego

F

c

c

= mv

2

/r

v = prędkość cząstki

E

k

= eU = ½ mv

2

e = ładunek jonu

m = masa cząstki
r = promień toru
U = natężenie pola elektrycznego
E

k

= energia kinetyczna cząstki

2

2

2

2

2m

r

e

B

m

eU

F

F

m

m

= F

= F

c

c

B

B

ev = mv

ev = mv

2

2

/

/

r

r

v =

v =

B

B

er/m

er/m

2U

r

B

e

m

2

2



ZASADA POWSTAWANIA WIDMA MAS

ZASADA POWSTAWANIA WIDMA MAS

WIDMO MASOWE

WIDMO MASOWE

Stosunek masy jonu do jego ładunku w funkcji
intensywności sygnału

m/z

In

te

n

s

y

w

n

o

ś

ć

1 Th = 1

1 Th = 1

Dalton

Dalton

/liczbę ładunków

/liczbę ładunków

MASY ATOMOWE - IZOTOPY

MASY ATOMOWE - IZOTOPY

Węgiel

12

C 12.0000*

98.89

13

C 13.0033

1.11

Chlor

35

Cl 34.9689

75.77

37

Cl

36.9659

24.23

* Masa uznana jako dokładnie 12 przez UPAC

Symbol

Masa atomowa

Zawartość izotopu, %

M(C) = 0.9889(12.0000) + 0.0111(13.0033) = 12.011

M(Cl) = 0.7577(34.9689) + 0.2423(36.9659) = 35.453

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH

PIERWIASTKÓW

PIERWIASTKÓW

1

1

H

H

1.008

1.008

1.00783

1.00783

99.99

99.99

2

2

H

H

2.01410

2.01410

0.016

0.016

12

12

C

C

12.011

12.011

12.0000 (std)

12.0000 (std)

98.89

98.89

13

13

C

C

13.00336

13.00336

1.11

1.11

14

14

N

N

14.0067

14.0067

14.0031

14.0031

99.64

99.64

15

15

N

N

15.0001

15.0001

0.36

0.36

16

16

O

O

15.9994

15.9994

15.9949

15.9949

99.76

99.76

17

17

O

O

16.9991

16.9991

0.04

0.04

18

18

O

O

17.9992

17.9992

0.20

0.20

19

19

F

F

18.998

18.998

18.9984

18.9984

100.0

100.0

28

28

Si

Si

28.0855

28.0855

27.9769

27.9769

92.17

92.17

29

29

Si

Si

28.9765

28.9765

4.71

4.71

30

30

Si

Si

29.9738

29.9738

3.12

3.12

32

32

S

S

32.066

32.066

31.9721

31.9721

9

9

5

5

.

.

0

0

4

4

33

33

S

S

32.9715

32.9715

0.76

0.76

34

34

S

S

33.9679

33.9679

4.20

4.20

35

35

Cl

Cl

35.4527

35.4527

34.9689

34.9689

75.77

75.77

37

37

Cl

Cl

36.9659

36.9659

24.23

24.23

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH

PIERWIASTKÓW

PIERWIASTKÓW

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH

PIERWIASTKÓW

PIERWIASTKÓW

31

31

P

P

30.9738

30.9738

30.9738

30.9738

100.0

100.0

79

79

Br

Br

79.9094

79.9094

78.9183

78.9183

50.52

50.52

81

81

Br

Br

80.9163

80.9163

49.48

49.48

126

126

I

I

126.9045

126.9045

126.9045

126.9045

100.00

100.00

M(Br):

M(Br):

[%

[%

79

79

Br x 78.9183] + [%

Br x 78.9183] + [%

81

81

Br x 80.9163]

Br x 80.9163]

[50.52 x 78.9183] + [49.48 x 80.9163] = 79.9094

[50.52 x 78.9183] + [49.48 x 80.9163] = 79.9094

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH

SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH

PIERWIASTKÓW

PIERWIASTKÓW

C

1

C

10

C

100

m/z R.I.

X 100

X+1 1.1

m/z R.I.

X 100

X+1 11.0

m/z R.I.

X 100

X+1 110

X+2 60

X+3 22

m/z

SKŁAD IZOTOPOWY – OBWIEDNIA IZOTOPOWA

SKŁAD IZOTOPOWY – OBWIEDNIA IZOTOPOWA

Masa cząsteczkowa respiryny C

33

H

40

N

2

O

9

Masy atomowe:

Masy izotopów:

C: 33 x 12.011 = 396.363 C: 33 x 12.0000 =
396.000

H: 40 x 1.0079 = 40.316 H: 40 x 1.0078 =
40.312

N: 2 x 14.0067 = 28.013 N: 2 x 14.0031 =
28.006

O: 9 x 15.9994 = 143.995 O: 9 x 15.9949 =
143.954

608.687

608.687

608.272

608.272

MASA CZĄSTECZKOWA

MASA CZĄSTECZKOWA

MASA MONOIZOTOPOWA

MASA MONOIZOTOPOWA

PORÓWNANIE PROFILU IZOTOPOWEGO

PORÓWNANIE PROFILU IZOTOPOWEGO

WIDMA ZMIERZONEGO I OBLICZONEGO

WIDMA ZMIERZONEGO I OBLICZONEGO

WIDMO MAS A STRUKTURA MOLEKUŁY

WIDMO MAS A STRUKTURA MOLEKUŁY

Jonizacja cząsteczek wiązką

elektronów

RODZAJE JONIZACJI

RODZAJE JONIZACJI

Miękka

Twarda

METODY JONIZACJI

METODY JONIZACJI

WIDMO EI KWASU OCTOWEGO

WIDMO EI KWASU OCTOWEGO

ZALEŻNOŚĆ STOPNIA FRAGMENTACJI

ZALEŻNOŚĆ STOPNIA FRAGMENTACJI

OD SIŁY POLA ELEKTRYCZNEGO

OD SIŁY POLA ELEKTRYCZNEGO

To MS

Orific

e

Plate

Curtain
Plate

Drying
Gas

Curtain
Gas

LC

Droplet Formation

Desolvation

& Fission

Gas Phase Ion

Generation

5kV

Nebulizing
Gas

ESI

ESI

+

+

+
+

+

REDUKCJA KROPLI I POWSTAWANIE JONÓW

REDUKCJA KROPLI I POWSTAWANIE JONÓW

ESI

ESI

Tryb jonów
dodatnich

Tryb jonów
ujemnych

[M+H]

+

[M+nH]

n+

i [M+Na

+

]

+

[M-H]

-

•[M-nH]

n-

i [M+I

-

]

-

•

Potrójny

Potrójny

Kwa

Kwa

drupol (QqQ)

drupol (QqQ)

– 2 kwadrupole filtrujące masy i jedna

cela zderzeń.

•

Pułapka jonowa

Pułapka jonowa

(IT)

(IT)

– Pojedyncza pułapka działa jako

analizator mas i cela zderzeń.

•

Hybrydy

Hybrydy

(

(

np

np

. LIT)

. LIT)

– Instrument wygląda jaki QqQ ale jeden

kwadrupol pełni rolę pułapki jonów.

ESI

ESI

Q1

Q2

Q3

Q0

Cela

zderzeń

Filtrowanie jonów

Filtrowanie jonów

POTRÓJNY KWADRUPOL

POTRÓJNY KWADRUPOL

Akumulacja jonów

• Q1 selkcjonuje [M+H]

+

• Q2 fragmentuje wyselkcjonowany jon.
• Q3 filtruje i monitoruje tylko wybrany jon.

Q0

Q1

Q2

Q3

N

2

CAD Gas

Precursor ion
selection

Ion accumulation

Fragmentation

POTRÓJNY KWADRUPOL

POTRÓJNY KWADRUPOL

WIDMO ESI ZWIĄZKU O NISKIEJ MASIE

WIDMO ESI ZWIĄZKU O NISKIEJ MASIE

WIDMO ESI SYNTETYCZNEGO

WIDMO ESI SYNTETYCZNEGO

OLIGONUKLEOTYDU

OLIGONUKLEOTYDU

WIDMO ESI KOMPLEKSÓW 18-C-6

WIDMO ESI KOMPLEKSÓW 18-C-6

Z KATIONAMI LITOWCÓW

Z KATIONAMI LITOWCÓW

WIDMO ESI PEPTYDU O MASIE 16952,20 Da

WIDMO ESI PEPTYDU O MASIE 16952,20 Da

ROZDZIELCZOŚĆ SPEKTROMETRU MAS

ROZDZIELCZOŚĆ SPEKTROMETRU MAS

FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

y

3

b

2

y

2

y

1

b

3

a

2

a

3

HO NH

3

+

| |

R

1

O R

2

O R

3

O R

4

| || | || | || |
H -- N --- C --- C --- N --- C --- C --- N --- C --- C --- N --- C --
COOH
| | | | | | |
H H H H H H H

b

2

-H

2

O

y

3

-H

2

O

b

3

- NH

3

y

2

- NH

3

FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO

G

V

D

L

K

mass

0

In

te

n

si

ty

mass

0

MS/MS

Identyfikacja

peptydu

IDENTYFIKACJA PEPTYDÓW/BIAŁEK PRZY

IDENTYFIKACJA PEPTYDÓW/BIAŁEK PRZY

UŻYCIU MS/MS

UŻYCIU MS/MS

TANDEM MS

TANDEM MS

Peptide Mass Fingerprinting (PMF)

„

„

ODCISK PALCA” W MS

ODCISK PALCA” W MS

p53

G6PDH

Trypsin
+ Gel punch

PROTEOMIKA - MS

PROTEOMIKA - MS

Trx

MPSER

……

GTDIMR

PAKID

……

HPLC

do
MS/MS

MPSER

GTDIMR

PAKID

.

.....

BIAŁKO

BIAŁKO

PEPTYDY

PEPTYDY

(tryptic peptides)

(tryptic peptides)

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA BIAŁEK

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA BIAŁEK

DO PEPTYDÓW

DO PEPTYDÓW

>Białko 1
acedfhsa

k

dfqea

sdfp

k

ivtmeeewe

ndadnfe

k

qwfe

>Białko 2
ace

k

dfhsadfqea

sdfp

k

ivtmeeewe

n

k

dadnfeqwfe

>Białko 3

MASMGTLAFD EYGRPFLIIK
DQDRKSRLMG LEALKSHIM
A AKAVANTMRT SLGPNGLD
KMMVDKDGDVTV TNDGAT
ILSM MDVDHQIAKL MVELS
KSQDD EIGDGTTGVV VLAG
ALLEEAEQLLDRGIHP IRIAD

Sekwencja Masa (

M+H

)

Peptydy trypt.

4842.05

4842.05

14563.36

acedfhsak
dfgeasdfpk
ivtmeeewendadnfe
k
gwfe

acek
dfhsadfgeasdfpk
ivtmeeewenk
dadnfeqwfe

SQDDEIGDGTTGVVVLAGALLEEAEQLL
DR2
DGDVTVTNDGATILSMMDVD HQIAK
MASMGTLAFDEYGRPFLIIK2
TSLGPNGLDK
LMGLEALK
LMVELSK
AVANTMR
SHIMAAK
GIHPIR
MMVDK
DQDR

BIBLIOTEKA PEPTYDÓW TRYPTYCZNYCH

BIBLIOTEKA PEPTYDÓW TRYPTYCZNYCH

RT:

0.01 - 80.02

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

R

el

at

iv

e

A

bu

nd

an

ce

1389

1991

1409

2149

1615 1621

1411

2147

1611

1995

1655

1593

1387

2155

1435

1987

2001 2177

1445

1661

1937

2205

1779

2135

2017

1313

2207

1307

2329

1105

1707

1095

2331

NL:
1.52E8
Base Peak F: +
c Full ms [
300.00 -
2000.00]

S#:

1708

RT:

54.47

AV:

1

NL:

5.27E6

T:

+ c d Full ms2 638.00 [ 165.00 - 1925.00]

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

R

e

la

tiv

e

A

b

u

n

d

a

n

ce

850.3

687.3

588.1

851.4

425.0

949.4

326.0

524.9

589.2

1048.6

397.1

226.9

1049.6

489.1

629.0

LC

S#:

1707

RT:

54.44

AV:

1

NL:

2.41E7

F:

+ c Full ms [ 300.00 - 2000.00]

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

R

e

la

tiv

e

A

b

u

nd

a

nc

e

638.0

801.0

638.9

1173.8

872.3

1275.3

687.6

944.7

1884.5

1742.1

1212.0

783.3

1048.3

1413.9

1617.7

MS

MS/MS

Ion

Source

MS-1

collision

cell

MS-2

TANDEM MS

TANDEM MS

S

S

e

e

k

k

w

w

e

e

n

n

c

c

j

j

a

a

S#:

1708

RT:

54.47

AV:

1

NL:

5.27E6

T:

+ c d Full ms2 638.00 [ 165.00 - 1925.00]

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

R

e

la

tiv

e

A

b

un

da

nc

e

850.3

687.3

588.1

851.4

425.0

949.4

326.0

524.9

589.2

1048.6

397.1

226.9

1049.6

489.1

629.0

MS/MS instrument

MS/MS instrument

Analiza przy użyciu
baz danych

ANALIZA DANYCH

ANALIZA DANYCH

PMF online

• Mascot

• www.matrixscience.com

• ProFound

– http://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.e

xe

• MOWSE

• http://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi-bin/mowse

• PeptideSearch

• http://www.narrador.embl-

heidelberg.de/GroupPages/Homepage.html

• PeptIdent

• http://us.expasy.org/tools/peptident.html