Replikacja DNA w

komórkach

prokariotycznych i

eukariotycznych

Replikacja materiału genetycznego jest
jednym

z

podstawowych

procesów

zachodzących w żywych komórkach.

Zadaniem replikacji jest przygotowanie
dla potomstwa informacji genetycznej
zawartej w cząsteczce macierzystej DNA,
a stabilność genetyczna organizmów i
gatunków jest zachowana tylko wtedy,
gdy

replikacja

jest

kompletna

i

przeprowadzana

z

dużym

stopniem

wierności.

Z

małymi

wyjątkami,

DNA

ulega

replikacji tylko raz na każdy cykl
podziałowy i podlega kontroli tylko na
poziomie inicjacji.

Raz

rozpoczęta

przebiega

aż

do

zakończenia syntezy całego replikonu
(fragmentu DNA znajdującego się w
czasie replikacji, w obrębie działania tego
miejsca i pod jego kontrolą).

Bezpośrednią

syntezę

kwasu

deoksyrybonukleotydowego w komórce,
poprzedza

synteza

deoksyrybonukleozydów, a następnie ich
fosforylacja do trójfosforanów (dNTP).

Semikonserwatywność replikacji DNA

Model

dwuniciowej

helisy

DNA,

zaproponowany przez Watsona i Cricka, a w
nim komplementarność dwóch łańcuchów
wchodzących w skład cząsteczki DNA,
sugeruje w jaki sposób DNA może się
powielać,

zachowując

w

cząsteczkach

potomnych wszystkie parametry matryc.

W myśl tego założenia, replikacja cząsteczki
DNA prowadzi do powstania dwu nowych
jego cząsteczek, z których każda jest
złożona w połowie z uprzednio istniejącego i
w

połowie

z

nowo

syntetyzowanego

materiału. Taki wynik syntezy, zwanej
replikacja

semikonserwatywną,

jest

konsekwencją

rozdzielenia

dwu

nici

tworzących wyjściową cząsteczkę DNA i
syntezy nowych komplementarnych nici
polinukleotydowych.

Podstawowe etapy procesu replikacji

W procesie replikacji DNA zawsze można

wyróżnić trzy podstawowe etapy:

1. Inicjacja

replikacji

DNA,

czyli

zapoczątkowanie syntezy DNA w ściśle
określonym miejscu startu:

a) rozpoznanie określonych sekwencji

nukleotydowych,

miejsc

inicjacji

replikacji,

b) otwarcie widełek replikacyjnych przy

aktywnym udziale białek inicjacyjnych,
replikacyjnych i regulacyjnych,

c) synteza startera.

2. Elongacja, czyli proces wydłużania

łańcuchów DNA w kierunku 5'-»3',
prowadzący

do

syntezy

całego

chromosomu.

3. Terminacja replikacji, mająca na

celu:

a) wycięcie startera,

b) dobudowanie brakującego fragmentu

DNA,

c)

rozdzielenie,

czyli

dekatenację

cząsteczek nowo powstałego DNA.

Inicjacja replikacji

Pojęcie inicjacji w procesie replikacji ma
dwa znaczenia:
-pierwsze

dotyczy

rozpoczęcia

cyklu

replikacyjnego genomu komórki,
-drugie

dotyczy

startu

syntezy

poszczególnych fragmentów DNA.

W chromosomie bakteryjnym znajduje się
tylko jedno miejsce inicjacji syntezy DNA
(ang. origin), natomiast w chromosomach
organizmów eukariotycznych jest ich wiele,
(średnio co ok. 20 kz), w których
rozpoczynają się nowe rundy replikacji.

Są to charakterystyczne regiony DNA
nazwane

ars

(ang.

autonomous

replicating seąuences), odkryte po raz
pierwszy w komórkach drożdży w tej
samej liczbie co replikony (ok. 400 na
genom).

Miejsca

te

zawierają

specyficzne

sekwencje, z których jedne służą do
wiązania białek inicjatorowych, w innych
następuje

rozerwanie

wiązań

wodorowych, umożliwiając rozpoczęcie
replikacji, a w jeszcze innych miejscach
dochodzi

do

przyłączenia

białek

wspomagających syntezę DNA.

Replikacja DNA jest inicjowana przez
krótkie

odcinki RNA,

służące

jako

startery dla polimerazy DNA.

Poza

nielicznymi

wyjątkami

syntezę

starterów prowadzą prymazy, grupa wysoce
wyspecjalizowanych enzymów, różniących
się między sobą budową i właściwościami.

Ryc. Do syntezy nowego łańcucha DNA
potrzebny jest matrycowy ssDNA o polarności
3'-*5' oraz komplementarny odcinek o odwrotnej
polarności z wolnym końcem 3'OH zwany
starterem (ang. primer). W warunkach in vivo
jest to fragment RNA. Dołączanie pojedynczych
nukleotydów do już istniejącego łańcucha
odbywa się tylko w jednym kierunku, od końca
5' do 3'.

W

odróżnieniu

od

prokariotycznych,

prymazy

eukariotyczne

syntetyzują

startery zawsze o określonej długości i
rozpoczynają

syntezę

od

dowolnego

nukleotydu, nie tak jak w przypadku
bakterii, w których zawsze rozpoczynają
syntezę od ATP lub GTP.

Najczęściej w procesie inicjacji replikacji
bierze

udział

wiele

różnych

białek,

tworzących wspólnie z prymazą duży
kompleks

inicjacyjny,

nazywany

primosomem.

Tylko w nielicznych przypadkach synteza
startera odbywa się z udziałem polimerazy
RNA.

Elongacja łańcuchów DNA

Replikacja przebiega równocześnie wzdłuż
obu przeciwstawnie spolaryzowanych nici
DNA.

Obydwa łańcuchy podwójnej helisy ulegają
rozdzieleniu, dzięki czemu każdy z nich
może służyć jednocześnie jako matryca do
zsyntetyzowania

łańcuchów

dopełniających (komplementarnych).

W procesie elongacji cząsteczki DNA,
polimeraza DNA dobudowuje kolejne
nukleotydy zawsze w kierunku 5'-*3.

Powoduje to, że synteza jednej nici odbywa
się w sposób ciągły (nić wiodąca — ang.
leading strand),
natomiast drugiej (nić opóźniona — ang.
lagging strand) odbywa się w kawałkach,
tzw. fragmentach Okazaki (nazwanych tak
od nazwiska odkrywcy),
które

następnie-przy

udziale

ligazy

polinukleotydowej - łączone są między
sobą, dając w efekcie końcowym długi
łańcuch polinukleotydowy.

Elongacja,

podobnie

jak

inicjacja,

wymaga

udziału

wielu

białek

enzymatycznych, potrzebnych do syntezy
nowych cząsteczek DNA.

Dobudowa kolejnych nukleotydów do
łańcucha

DNA

jest

reakcją

endoenergetyczną, wymagającą nakładu
energii niezbędnej do tworzenia wiązań
fosfodiestrowych pomiędzy kolejnymi
nukleotydami.

Donorem tej energii są dNTP.
W procesie replikacji dNTP hydrolizują
do dNMP i pirofosforanu, który w
kolejnym

etapie

tej

reakcji

ulega

hydrolizie

do

dwóch

cząsteczek

ortofosforanu z udziałem pirofosfatazy,
uwalniając energię (rzędu 25 kJ/mol),
wykorzystywaną

do

syntezy

wiązań

fosfodiestrowych.

Terminacja replikacji

Końcowy etap replikacji wymaga wycięcia
starterów RNA, uzupełnienia powstałych
luk

po

starterach

oraz

połączenia

powstałego DNA w kompletne chromosomy.
Mechanizm terminacji replikacji, będący
pod kontrolą specyficznych białek jest inny
dla

DNA

komórek

prokariotycznych

(chromosom

kolisty)

i

komórek

eukariotycznych (chromosom liniowy).

Miejsce terminacji replikacji w kolistym
chromosomie

bakteryjnym,

np.

w

komórkach E. coli, jest położone dokładnie
naprzeciwko miejsca inicjacji (ori C) i
obejmuje obszar 800 par zasad.

Występują

tam

cztery

sekwencje

nukleotydowe, nazwane ter — miejsca
wiązania białka terminacyjnego —które jest
supresorem replikacji.

Sekwencje ter A i B oraz ter C i D ułożone
są

po

dwie

na

każdym

ramieniu

chromosomu i znajdują się w tej samej
odległości od osi symetrii.

Widełki

replikacyjne,

poruszające

się

zgodnie z ruchem zegara, prześlizgują się
swobodnie przez miejsca ter D i A, są
natomiast zatrzymywane przez C i B.

Widełki

poruszające

się

w

kierunku

przeciwnym prześlizgują się przez B i C, a
są zatrzymywane przez A i D.

W

ten

sposób,

jeżeli

ruch

widełek

replikacyjnych

jakiegokolwiek

ramienia

zostanie opóźniony, terminacja i tak
zakończy

się

zawsze

w

obszarze

terminalnym.

W każdym chromosomie eukariotycznym
jest wiele replikonów, z których żaden nie
posiada sekwencji terminalnych.

Replikacja każdego replikonu kończy się w
momencie fizycznego zetknięcia się widełek
podążających ku sobie z przeciwnych
kierunków.

W procesie terminacji replikacji, po
degradacji starterów RNA, uzupełnione
zostają luki tylko wewnątrz cząsteczki DNA.

Natomiast przy końcu 5' potomnej nici,
powstaje luka długości kilku do kilkuset
par zasad (luka wielkości startera lub
fragmentu Okazaki).

Wiedza o mechanizmach uzupełniania
powstałych luk jest ciągle niekompletna.

W 1973 roku Olovnikov zwrócił uwagę na
fakt, że chromosomy liniowe z każdą
rundą replikacyjną tracą fragment DNA
na

swych

końcach

—

telomerach

(charakterystycznych

wielokrotnie

powtarzających

się

sekwencjach

nukleotydowych,

które

stabilizują

i

chronią

chromosomalny

DNA

przed

działaniem nukleaz oraz biorą udział w
pełnej terminacji replikacji, zapewniając
utrzymanie

niezmiennej

długości

cząsteczek DNA.
Zjawisko utraty końcowych fragmentów
chromosomów

wynika

z

właściwości

polimerazy DNA, syntetyzującej tylko w
kierunku 5'-»3' i braku zdolności do
syntezy DNA w kierunku 3'-*5'. Powoduje
to

niepełną

replikację

(ang.

the

endreplication problem), a konsekwencją
jest

utrata

fragmentu

komórkowego

materiału genetycznego i starzenie się
komórek, związane z zanikiem zdolności
replikacyjnych.

Zjawisko niepełnej replikacji liniowej

cząsteczki DNA. Polimerazy DNA nie

potrafią dobudować brakującego fragmentu

DNA do końca 5’ .

Rola telomerazy w pełnej replikacji liniowej
cząsteczki DNA; (dobudowa brakującego
fragmentu DNA do końca 5').

Autorzy telomerowej hipotezy starzenia się
komórek zakładają, że każdemu podziałowi
komórkowemu

towarzyszy

utrata

niewielkiego, końcowego fragmentu każdego
chromosomu.

Skrócenie DNA do odpowiedniej długości
powoduje włączenie programu starzenia,
które prowadzi do zatrzymania podziałów
komórkowych.

W

hodowlach

in

vitro

ludzkich,

normalnych

fibroblastów,

pobieranych od dawców w okresie płodowym,
po urodzeniu i aż do późnej starości
stwierdzono, że w czasie przypadającym na
podwojenie populacji komórek następuje
skracanie telomerów o około 2 tysiące par
zasad DNA, przy czym komórki wykonują o
10 podziałów mniej na każdy tysiąc traconych
zasad DNA. Jednocześnie zmniejsza się
całkowita ilość DNA, a to odsuwa podejrzenie
transpozycji.

W przypadku cząsteczek DNA linearnych
istnieje kilka sposobów zapobiegania utracie
końcowych

fragmentów

w

procesie

terminacji replikacji:

I. Cyrkulizacja chromosomów.

II. Wykorzystanie sekwencji palindromowych
końcowych

nici DNA.

Sekwencje palindromowe mogą zawijać się
w struktury szpilki do włosów na ramieniu
zakończonym grupą 3'-OH.

Powstaje układ starter — matryca i koniec
niedoreplikowany może być uzupełniony
przez wspólną akcję polimerazy i ligazy.

Polimeraza DNA wykorzystuje zawinięty
koniec 3'-OH jako starter, a specyficzna
endonukleaza rozróżniająca sekwencję
palindromową

odcina

ją

po

doreplikowaniu brakującego odcinka.

Odcięty palindrom rozwija się stając się
końcem 5' chromosomu, a tym samym
matrycą

do

replikacji

brakującego

fragmentu końca 3' DNA.

Polimeraza DNA uzupełnia powstałą po
rozwinięciu lukę, uzupełniając koniec 3'.

Ligaza kończy proces terminacji, łącząc
całość w ciągłą strukturę dwuniciowego
DNA.

Struktura sekwencji palindromowej
fragmentu DNA — sekwencji o odwróconej
symetrii, tzn. że komplementarny do niej
odcinek DNA ma identyczne uporządkowanie
zasad i w odpowiednich warunkach
termicznych tworzy strukturę szpilki do
włosów.

III.

Wykorzystanie

sekwencji

powtarzających

się

przez

tworzenie

konkatamerów — oddzielnych cząsteczek
DNA

połączonych

wiązaniami

kowalencyjnymi w jedną dużą cząsteczkę,
np. na obu końcach genomu faga T7
występują kilkusetnukleotydowe odcinki
sekwencji powtarzających się.

Mogą one tworzyć między sobą wiązania
wodorowe,

łącząc

razem

pojedyncze

cząsteczki fagowego DNA.
Umożliwia to doreplikowanie brakujących
odcinków i połączenie poszczególnych
cząsteczek w jedną dużą, czyli wytworzenie
konkatamerów.

Podczas ładowania DNA do potomnych
wirionów, specyficzna endonukleaza odcina
od

konkatameru

pojedyncze

genomy

fagowego DNA.

IV. Pełna replikacja DNA z udziałem
telomerazy.

Cząsteczki DNA jądrowego w komórkach
eukariotycznych

zakończone

są

tzw.

telomerowym

DNA,

położonym

w

heterochromatynowym obszarze na końcach
ramion chromosomów.

Jest

on

konserwatywny

ewolucyjnie

i

charakteryzuje

się

tandemowo

powtarzającymi się prostymi sekwencjami
nukleotydów (kilkaset par zasad u drożdży
czy orzęsków do kilku tysięcy pz u
kręgowców), a także dużą zawartością
guaniny w nici biegnącej w kierunku 5'-»-3'
końca cząsteczki DNA.

Po degradacji startera RNA do wiszącego
końca 3' macierzystej nici DNA zostaje
dosyntetyzowana sekwencja telomerowa
w kierunku 5'-*3' dzięki telomerazie.

Ta wydłużona nić staje się celem ataku
primazy, syntetyzującej starter RNA,
dając

możliwość

polimerazie

DNA

przeprowadzenia

nieciągłej

syntezy

potomnej nici, która zapełni lukę.

Gdy w dalszym etapie starter RNA
zostanie zdegradowany i znów powstaje
przerwa na końcu 5' potomnej nici, to
tym razem dotyczy to sekwencji te-
lomerowej, a nie kodującej informację.

V. Wykorzystanie zjawiska rekombinacji
telomerów w pełnej replikacji
chromosomów liniowych.

Enzymy biorące udział w replikacji
DNA

Badania replikacji DNA wykazały, że proces
ten jest bardzo złożony, bierze w nim udział
co najmniej kilkanaście różnych białek,
które są charakterystyczne dla kolejnych
etapów syntezy DNA oraz typowe dla
komórek

prokariotycznych,

eukariotycznych lub wirusów.

Białka niezbędne do replikacji DNA można
podzielić na:

— białka inicjacyjne — które kierują
inicjacją od źródła replikacji i tworzą
kompleks replikacyjny (np. produkt genu
Dna A, gyraza — topoizomeraza II,
polimeraza RNA,

-białka replikacyjne, niezbędne do

syntezy

polimerów

nukleotydowych

w

miejscu inicjacji replikacji i całego genomu
(np. polimeraza DNA, produkty genów
DnaB-DnaC,

primaza,

białka

współdziałające),

— białka terminacyjne, niezbędne do pełnej
replikacji

DNA

(np.

telomeraza

—

polimeraza DNA, zależna od RNA),

— białka regulacyjne, ułatwiające inicjację
replikacji,

np.

w

miejscu

OriC

u

prokariontów lub w miejscach ars u
eukarioritów, oraz powodujące inaktywację,
czyli supresję innych potencjalnych miejsc
inicjacji

w

bakteryjnym

DNA

(np.

topoizomeraza I, rybonukleaza H, białko
HU, produkt genu DnaA).

W warunkach patologicznych do procesu
replikacji włączają się jeszcze inne białka, np. po
naświetleniu komórki promieniami UV, lub gdy
gen DnaA ulegnie deaktywacji w wyniku mutacji,
inicjacja replikacji zostanie poddana kontroli
grupy genów RecA-LexA, odpowiedzialnych za
regulację naprawy DNA typu SOS.

Białka odpowiedzialne za przygotowanie
matrycy do replikacji:

-Białka SSB,
-Helikazy,
-Topoizomerazy.

Białka SSB:

Białka wiążące się z jednoniciowym DNA —
SSB (ang. single strand binding), które
zapobiegają ponownemu połączeniu się
rozdzielonych nici dsDNA i są niezbędne w
przygotowaniu matrycy ssDNA do replikacji.

Białka SSB pokrywają cały obszar szkieletu
fosfocukrowego

łańcucha,

pozostawiając

wolne zasady gotowe do tworzenia par.

Nie wiążą się z dwuniciowym DNA, lecz
ułatwiają

jego

destabilizację

poprzez

wychwytywanie

i

utrwalanie

miejsc

zdenaturowanych.

W

czasie

replikacji

mogą

być

przemieszczane

z

jednych

odcinków

jednoniciowej matrycy na inne, wchodząc
w cykl kołowy.
Dodatkowo niektóre z tych białek mają
zdolność stymulacji aktywności polimeraz
DNA, otwierania dwuniciowego DNA w
miarę ruchu widełek replikacyjnych w
sposób ciągły oraz po ufosforylowaniu
mogą katalizować denaturację ds DNA.

B. Helikazy

Helikazy

rozwijają

podwójny

heliks

kosztem energii ATP (ATP-azy zależne od
DNA) potrzebnej do rozerwania wiązań
wodorowych, łączących łańcuchy DNA.
Enzym zużywa 2 cząsteczki ATP na każde
zerwane wiązanie wodorowe.

Niektóre helikazy mogą wykorzystywać
energię hydrolizy innych NTP, np.
produkt genu DnaB w komórkach E. coli,
który in vitro odwija DNA z szybkością 35
nukleotydów na sekundę. Mechanizmy
regulujące aktywność tego enzymu nie są
dokładnie zdefiniowane.

Wiadomo, że szybkość syntezy DNA w
widełkach replikacyjnych wynosi około
1000 nukleotydów na sekundę.

Musi więc istnieć mechanizm koordynujący
szybkość odwijania tego biopolimeru z
szybkością replikacji.

Wykazano, że istnieje interakcja pomiędzy
podjednostką holoenzymu polimerazy III
DNA a białkiem DnaB.
Interakcja

r-DnaB

powoduje

prawdopodobnie zmianę konformacji DnaB,
co zwiększa ponad 10-krotnie szybkość
odwijania DNA przez DnaB.

Helikazy

rozkręcają

heliks

DNA

rozpoczynając od regionu bogatego w
pary AT : od sekwencji oriC lub ars,
łącząc

się

z

ramieniem

widełek,

służącym do syntezy nici opóźnionej. Ich
ruch ma więc kierunek 5'-»3'.
Nie jest to jednak regułą.

Helikaza rep wyizolowana z komórek E.
coli działa wzdłuż nici przeciwnie
zorientowanej, poprzedzając syntezę nici
wyprzedzającej (wiodącej).

Skuteczność

otwierania

dwuniciowej

struktury DNA in vivo jest wynikiem
współdziałania helikazy rep z helikazami
nici

opóźnionej

oraz

białek

odpowiedzialnych

za

konformację

cząsteczki DNA,

np. białek SSB, które stabilizują powstały
jednoniciowy ssDNA, białek DnaA, HU
(histon-like protein), IHF (integration host
factor) oraz obu podjednostek gyrazy
(GyrA i GyrB).

Białka HU i IHF są dimerami, które po
związaniu

z

DNA

wywołują

zmianę

konformacji,

polegającą

na

zagięciu

(ang.bending) heliksu.

Istotna różnica między nimi polega na
tym,

że

HU

wiąże

się

z

DNA

niespecyficznie, natomiast IHF rozpoznaje
specyficzną

sekwencję.

Dane

doświadczalne sugerują, że białka te mogą
zastępować

się

wzajemnie

tylko

w

warunkach in vitro.

W obrębie regionu oriC wykazano również
wiązanie białka Fis ze specyficznymi
sekwencjami

zlokalizowanymi

w

sąsiedztwie

R2

i

R4

—

sekwencji

wiążących białka Dna A.

Fis jest małym zasadowym białkiem, które
wiąże się z DNA i podobnie jak białka HU
oraz IHF powoduje jego zagięcie. Fis nie
wykazuje jednak homologii z białkami HU
i IHF.

Ostatnio udowodniono, że w obecności
DnaA, IHF i HU jedna z nici w sekwencji
M i R jest chroniona przed działaniem
nukleazy P.

Wymienione białka ułatwiają inicjację
replikacji

w

miejscu

oriC

oraz

równocześnie powodują inaktywację, czyli
supresję innych potencjalnych miejsc
inicjacji w bakteryjnym DNA.

Topoizomerazy (odwracalne nukleazy).

Enzymy biorące udział w przygotowaniu
matrycy do replikacji.
Są to białka odpowiedzialne za konformację
replikującego się DNA oraz za usuwanie
napięcia związanego ze skręceniem się DNA.

Rozwijanie kolistej cząsteczki DNA w
procesie replikacji powoduje tworzenie
dodatnich superskrętów, które muszą być
usuwane, aby umożliwić kontynuowanie
syntezy DNA.

Usuwanie

odbywa

się

dzięki

kompensującemu działaniu gyrazy, która
wprowadza ujemne skręty superhelikalne,
hydrolizując ATP.

Topoizomerazy dzieli się na dwie grupy:

Topoizomerazy grupy I:

-nacinają tylko jedną nić podwójnej helisy;
-biorą udział w replikacji (katalizują
zapętlanie się jednoniciowego kolistego
DNA oraz łączenie się dwóch kolistych
cząsteczek

jednoniciowego

DNA

w

cząsteczkę dwuniciową).

Enzym dołącza się do biopolimeru przez
resztę tyrozyny, znajdującą się w centrum
aktywnym enzymu, przerywając wiązanie
fosfodiestrowe. Cząsteczka jest związana z
końcem 5'-P, a koniec 3'OH pozostaje
wolny (w komórkach prokariotycznych) lub
odwrotnie (w komórkach eukariotycznych).

Przecięta nić może swobodnie się obrócić
wokół drugiej nici.

Energia

przeciętego

wiązania

zostaje

zachowana

w

wysokoenergetycznym

wiązaniu

fosfotyrozyny,

dlatego

spontaniczne

odtworzenie

wiązania

fosfodiestrowego nie wymaga nakładu
energii i zachodzi bez udziału koenzymów.

Topoizomerazy bakteryjne, podobnie jak
helikazy, wymagają obecności Mg

+

i

powodują relaksację superhelis zwiniętych
tylko

w

kierunku

ujemnym,

tzn.

przeciwnym do skrętu podwójnej helisy,
natomiast topoizomerazy eukariontów nie
mają żadnych wymagań co do kierunku
zwinięcia superhelisy.

Topoizomerazy grupy II :

Nacinają obie nici DNA, zmieniając liczbę
zwojów superhelisy nie przez zwijanie czy
rozwijanie

cząsteczki,

lecz

przez

jej

skręcanie, powodując powstawanie lub
relaksację dwóch zwojów na każdą reakcję
nacinania i łączenia, np. zmiana kierunku
skrętu superhelisy przez gyrazę.

Topoizomerazy są również odpowiedzialne za
rozdzielanie zaplecionych genomów po
zakończeniu replikacji kolistych cząsteczek
DNA bakterii, bakteriofagów lub plazmidów.

W

procesie

rozdziału

potomnych

chromosomów

czynne

są

dwie

topoizomerazy klasy II:

-gyraza,

-topoizomeraza IV.

Gyraza prawdopodobnie działa na etapie
inicjacji

i

elongacji,

wprowadzając

negatywne

superhelisy

i

usuwając

nagromadzające się w replikowanej
cząsteczce DNA pozytywne helisy.

Wytworzenie superhelisy DNA ułatwia
dołączenie kompleksu inicjacyjnego w
miejscu

inicjacji

(OriC)

cyklu

replikacyjnego.

Relaksacja dodatnio skręconych
superzwojów powstających w genomie na
skutek ruchu widełek i skręcanie nici
rodzicielskiej w superzwoje ujemne ułatwiają
rozsuwanie matryc DNA.

Polimerazy DNA

Są

to

enzymy

należące

do

grupy

nukleotydylotransferaz

syntetyzujące

z

odpowiednich

deoksyrybonukleotydów

trójfosforanowych cząsteczki DNA.

Typy polimeraz:

-Polimerazy

DNA

komórek

prokariotycznych: polimeraza DNA I,
polimeraza DNA II, polimeraza DNA III,
-Polimerazy

DNA

komórek

eukariotycznych,
-Polimerazy DNA indukowane zakażeniem
wirusowym.

Polimerazy DNA nie rozróżniają matryc
bakteryjnych

od

zwierzęcych

czy

wirusowych,

nie

rozpoznają

zatem

sekwencji zasad w łańcuchu matrycy.

Różnią się między sobą budową, szybkością
katalizy,

obecnością

lub

brakiem

towarzyszących

im

aktywności

nukleolitycznych oraz wymaganiami w
stosunku do struktury matryc, które mogą
wykorzystywać.

Polimerazy

DNA

odpowiedzialne

za

replikację DNA w komórce nie potrafią
rozpocząć

polimeryzacji

de

novo

od

wolnych deoksyrybonukleotydów, potrafią
jedynie dobudowywać kolejne nukleotydy
do końca 3'OH istniejącego już łańcucha
nukleotydowego.

Wszystkie

polimerazy

DNA do reakcji replikacji wymagają
obecności starterów (primerów).

Polimerazy

DNA

są

enzymami

wielofunkcyjnymi.

W zależności od warunków i przebiegu
procesu replikacji mogą:

-katalizować

tworzenie

wiązań

fosfodiestrowych,

powodując

wydłużanie

cząsteczki DNA, zawsze w kierunku od
końca 5'-»3‘,

-pełnić funkcje egzonukleaz — zarówno w
kierunku 5'-*3', jak i w kierunku 3'-*5'.

Zdolność do degradacji jednoniciowego DNA
jest bardzo istotna w procesie syntezy i
naprawy

DNA.

Dodatkowo

niektóre

polimerazy

mogą

katalizować

reakcję

pirofosforolizy

DNA

i

wymiany

pirofosforanu.

Polimerazy DNA komórek
prokariotycznych:

Polimeraza DNA I

Najlepiej poznana polimeraza DNA.
Może

katalizować

prawidłowo

polimeryzację DNA bez udziału innych
białek wspomagających. Łatwo wiąże się
z

jednoniciowym

DNA

oraz

z

dwuniciowym

DNA

zawierającym

pęknięcia, luki w jednej z nici lub
odcinki zdenaturowane, natomiast nie
wiąże się z dwuniciowym DNA o
nieuszkodzonej strukturze.

W procesie replikacji polimeraza DNA I
wycina startery RNA oraz wypełnia
powstałe luki.

Jako

egzonukleaza

3'->5'

kontroluje

prawidłowość procesu polimeryzacji, tzn.
rozpoznaje, a następnie wycina źle
sparowany ostatni nukleotyd rosnącej
części łańcucha, co umożliwia włączenie w
to miejsce zasady sparowanej prawidłowo i
jest bardzo istotne dla zachowania
wierności replikacji.

Ponadto rozpoznaje i wycina końcową 3'-
deo-ksyrybozę, pozostałą po depurynacji
lub depirymidynacji oraz zde-naturowane
końce dwuniciowego DNA.

Brak lub obniżenie aktywnoś ci 3'-*5'
egzonukleazy powoduje natychmiastowy
wzrost liczby mutacji.

Jako egzonukleaza 5'-*3' polimeraza DNA I
wycina starterowy RNA oraz bierze udział
w naprawie DNA.
Różni

się

od

egzonukleazy

3'-»5'

kierunkiem działania, wyborem substratu
oraz sposobem działania.

W centrum aktywnym polimerazy DNA I
wyróżnia się aż sześć specyficznych miejsc:

1) miejsce dołączenia matrycy obejmuje w
jej

jednoniciowym

odcinku

obszar

aktualnie

kopiowany,

lecz

także

kilkunukleotydowe fragmenty po obu jego
stronach,
2) miejsce dla startera oraz łańcucha
rosnącego o odwrotnej polarności matrycy,
3) miejsce rozpoznawania wolnej grupy 3'-
OH łańcucha rosnącego,
4) miejsce dołączania substratu,
5) miejsce hydrolizy źle sparowanej zasady
przez egzonukleolityczną aktywność 3'-*5',
6) miejsce działania egzonukleazy 5'.

Schemat budowy polimerazy DNA I.
Hydroliza wiązania peptydowego pomiędzy
aminokwasami 223 i 224 (treoniną i
waliną) powoduje rozpad cząsteczek na
dwie części, z których jedna pełni funkcję
polimerazy DNA, a druga egzonukleazy
5'-»3'.

Większy,

zwany

fragmentem

Klenowa,

zawiera aktywność po-limerazową i 3'-»5'
egzonukleolityczną.

Mniejszy

fragment

wykazuje

aktywność

5'-»3'

egzonukleolityczną.

Polimeraza DNA II.

Polimeraza DNA II jest zbudowana z jednego
łańcucha polipeptydowego. Występuje w
liczbie ok. 40 cząsteczek na komórkę.
Wykazuje

tylko

jedną

aktywność

egzonukleolityczną 3'-»5'. Może stanowić
alternatywną drogę uzupełniania luk w nici
nieciągłej, z udziałem RNazy H wycinającej
startery lub bierze udział w naprawie DNA.
In vitro polimeraza ta wymaga jako matrycy
dwuniciowego DNA, zawierającego duże luki.
Aktywność polimerazy DNA II jest ok. 300
razy mniejsza od aktywności polimerazy DNA
III.

Polimeraza DNA III

Synteza obu nici DNA w procesie replikacji
chromosomu E. coli jest katalizowana
przez składający się z 10 podjednostek
białkowych

kompleks

enzymatyczny,

nazwany holoenzymem polimerazy III DNA
(forma natywna polimerazy DNA III).
Katalityczny rdzeń holoenzymu tworzą trzy
podjednostki: a (132 kDa), ε (27 kDa), θ
(10

kDa).

Aktywność

polimerazy

syntetyzującej siostrzaną nić DNA w
kierunku

od

5'

do

3'

warunkuje

podjednostka a. Podjednostka ε, działając
jak

nukleaza,

wycina

nieprawidłowo

sparowane nukleotydy w kierunku 3'-»5'.
Dzięki tej aktywności holoenzym Pol III
popełnia

błąd

jedynie

raz

na

10

syntetyzowanych nukleotydów.

Polimerazy DNA komórek
eukariotycznych

Komórki

eukariotyczne

posiadają

co

najmniej pięć polimeraz DNA oznaczonych
a, β, γ, δ, ε. Polimerazy a, β, δ, ε występują
w jądrze komórkowym, a polimeraza γ w
jądrze i w mitochondriach.

Polimerazy DNA eukariotyczne, podobnie
jak prokariotyczne, katalizują elongację
startera zależną od matrycy, dobudowując
do końca 3'-kolejne nukleotydy, używając
aktywowanych substratów dNTP .

Głównym

enzymem

replikacyjnym

jest

polimeraza DNA δ. Współdziała on w czasie
replikacji z białkiem pomocniczym PCNA,
które przytrzymuje enzym na matrycy DNA.

Polimeraza DNA α jest odpowiedzialna za
rozpoczynanie replikacji poprzez syntezę
starterów.

Polimeraza DNA γ uczestniczy w replikacji
genomu mitochondrialnego (ta polimeraza
jest

kodowana

przez

gen

jądra

komórkowego).

Polimeraza DNA β uczestniczy w naprawie
DNA.

Polimeraza DNA ε – dokładna funkcja nie jest
znana (replikacja).

Polimerazy DNA pochodzenia
wirusowego

Wirusy zwierzęce można podzielić na trzy
grupy, biorąc pod uwagę ich zależność od
polimeraz DNA komórek gospodarza:

1) wirusy niosące informację o swoistych
polimerazach DNA (np. Herpes, Yaccinia,
bakteriofagi grupy T),
2) wirusy całkowicie zależne od polimeraz
DNA komórek gospo darza, np. Polyoma, SV
40, Adeno wirusy),
3) wirusy, które przynoszą polimerazę DNA
w białkach wirionu, o pochodzeniu dotąd
nieustalonym,
4) polimerazy DNA zależne od RNA.

Odwrotne transkryptazy, czyli polimerazy

DNA zależne od RNA są enzymami
posiadającymi dwie aktywności:

1) polimerazy DNA zależnej od RNA lub

DNA,

2) rybonukleazy H — hydroli żującej

wiązania fosfodiestrowe RNA w
hybrydach DNA-RNA.

Wyniki badań aktywności polimerazowej

odwrotnej transkryp tazy wykazały, że
synteza

łańcucha

polideoksyrybonukleotydowego

na

matrycy RNA przebiega w kierunku 5'-
*3' poprzez wydłużanie starterowego
RNA, związanego z miejscem pbs (ang.
primer binding site).

W genomie wirusa HIV-1 miejsce to
zlokalizowane jest 100—150 nukleotydów od
końca 5' wirusowego RNA. Utworzony
pierwszy produkt odwrotnej transkrypcji (ang.
strong stop cDNA), przenoszony jest na koniec
3' tej samej lub innej cząsteczki wirusowego
RNA i pełni funkcję startera dla dalszej syntezy
nici (-)DNA.

Równolegle z tworzeniem nici (-)DNA zachodzi
degradacja matrycowego RNA przez
rybonukleazę H, która pozostawia krótki
odcinek wirusowego RNA, przy końcu 3',
związany z nicią (-)DNA.
Odcinek ten jest bogaty w puryny (ang.
polypurine track — ppt) i służy jako starter
syntezy nici (+) DNA na matrycy DNA.

Ligazy

Polimeraza

DNA

może

dodawać

deoksyrybonukleotydy

do

łańcucha

primera, ale nie może katalizować reakcji
połączenia dwóch łańcuchów DNA.

Tworzenie

wiązania

fosfodiestrowego

między dwoma łańcuchami DNA (np.
fragmentami Okazaki) katalizuje ligaza.

Liczba cząsteczek ligazy w komórce
bakteryjnej odpowiada liczbie cząsteczek
polimerazy DNA I, co sugeruje ścisłe
współdziałanie

tych

enzymów

w

replikacji.

Stwierdzono, że ligaza wymaga obecności
wolnej grupy OH na 3' końcu jednego
łańcucha i grupy fosforanowej na 5'
końcu drugiego łańcucha oraz źródła
energii.

Łańcuchy

łączone

przez

ligazę,

najczęściej

są

częścią

dwuniciowej

cząsteczki DNA. Enzym ten nie może
łączyć dwóch cząsteczek jednoniciowego
DNA.

Ligazy różnych organizmów wymagają
różnych źródeł energii. Ligazy bakteryjne
wymagają

obecności

NAD+

jako

koenzymu i źródła energii, natomiast
ligazy wszystkich eukariontów, a także
niektórych bakteriofagów, wykorzystują
do tego celu ATP.

W komórkach organizmów wyższych
występują co najmniej dwie ligazy różniące
się wielkością, lecz o takiej samej funkcji.
Jedna z nich dominuje w szybko dzielących
się komórkach, a druga w komórkach w
stanie spoczynkowym.

Replikacja DNA w komórkach
prokariotycznych

Replikacja kolistego chromosomu E. coli
rozpoczyna się zawsze w jednym miejscu,
zwanym początkiem lub miejscem startu
(inicjacji) replikacji.

Powstające w tym miejscu widełki
replikacyjne biegną w dwóch przeciwnych
kierunkach wzdłuż kolistej cząsteczki DNA,
doprowadzając do replikacji całej cząsteczki.

Jeżeli replikujący się chromosom jest
kolisty, rozdzielające się nici w miejscu
powstawania widełek replikacyjnych tworzą
„oczko" rozszerzające się w obie strony
(forma ta nosi nazwę theta, gdyż
przypomina kształtem tę grecką literę).

Jeżeli chromosom jest liniowy, wtedy
oczko powiększa się prowadząc do
całkowitego rozdzielenia nici DNA.

U E. coli miejsce inicjacji replikacji
(ang. Origin of replication ) nosi nazwę
oriC.

Minimalna sekwencja oriC (245 par
zasad), niezbędna do autonomicznej
replikacji DNA w komórce bakteryjnej,
została określona na podstawie analizy
mutantów delecyjnych E. coli.

W jej obrębie znajdują się cztery 9-
nukleotydowe powtórzone odcinki DNA,
nazwane Rl, R2, R3, R4, o sekwencji
najwyższej zgodności (ang, consensus
seąuence) TTAT(C/A)CA(C/A)A.

W pierwszym etapie inicjacji replikacji
powstaje

aktywny

kompleks

rozpoczynający replikację zależną od
sekwencji oriC, 20—30 cząsteczek białka
DnaA wiąże się kooperatywnie z czterema
sekwencjami

Rl,

R2,

R3

I

R4,

zlokalizowanymi w regionie wspomnianej
sekwencji

.

Powstanie

nukleoproteinowego kompleksu prowadzi
do znacznych zmian topologii kwasu
deoksyrybonukleinowe-go. Dochodzi do
zawinięcia

łańcucha

DNA

wokół

cząsteczek białka DnaA, prowadząc do
lokalnego rozwinięcia helisy DNA w
bogatych w pary AT sekwencjach L, M i R.
W tworzeniu rozwiniętej struktury DNA
białko DnaA wymaga współudziału innych
czynników białkowych, np. białek HU i
IHF, które wiążą się z oriC pomiędzy
sekwencjami Rl i R2, a następnie
powodują zagięcie (ang. bending) helisy.

Komórka, w zależności od warunków
fizjologicznych,

wykorzystuje

kilka

alternatywnych

mechanizmów

inicjacji

replikacji.

Do niezbędnych w inicjowaniu replikacji
bakteryjnego genomu należą białka:
a)

inicjacyjne

(produkt

genu

DnaA,

polimeraza RNA, giraza),
b) replikacyjne (polimeraza DNA, DnaB-
DnaC, prymaza, białka współdziałające),
c)

regulacyjne

(topoizomeraza

I,

rybonukleaza H, białko HU, białko IHF,
produkt genu DnaA).

Ułatwiają one inicjację replikacji w miejscu
oriC i równocześnie powodują inaktywację,
czyli supresję innych potencjalnych miejsc
inicjacji w bakteryjnym DNA.

Primosom

Przygotowanie jednoniciowej matrycy nie
wystarczy

do

rozpoczęcia

procesu

powielania cząsteczki DNA.
Polimerazy DNA odpowiedzialne za
replikację nie mogą rozpo cząć reakcji
polimeryzacji de novo od wolnych dNTP.
Do rozpoczęcia syntezy nowej nici DNA
enzymy wymagają obecności starterów
RNA, które w końcowym etapie replikacji
są usuwane np. u E coli dzięki aktywności
egzonukleazowej 5'--*3' polimerazy I.

Enzymem odpowiedzialnym za syntezę
starterów RNA jest produkt genu DnaG
— prymaza DnaG, obecna w komórce
prokariotycznej w liczbie od 50 do 100
cząsteczek.

Jest to niespecyficzna polimeraza RNA,
syntetyzująca

startery

zawierające

zarówno

rybo-,

jak

i

deoksyrybonukleotydy, za wyjątkiem
pierwszego i prawdopodobnie drugiego
nukleotydu,

które

zawsze

są

rybonukleotydami.
Prymaza dnaG rozpoznaje sekwencję
GTC i od niej rozpoczyna syntezę
startera, chociaż w obecności białka
DnaB prymaza jest mniej specyficzna i
rozpoznaje sekwencje PuPyPy (puryna
— pirymidyna — pirymidyna).

Podczas replikacji chromosomu E. coli
prymaza wiąże się z matrycą DNA w
sąsiedztwie białka Dna B, tworząc wspólnie
z

innymi

białkami

duże

kompleksy

enzymatyczne nazwane przez Kornberga
prymosomami, które stabilizują dupleks
matrycy

i

startera,

co

jest

ważne

szczególnie w przypadku bardzo krótkich
starterów,

słabo

utrzymywanych

przez

wiązania wodorowe.
Prymaza

łączy

się

z

kompleksem

przedinicjacyjnym, w którym białka dnaA
połączone z czterema miejscami na oriC w
pobliżu

13-nukleotydowych

odcinków

bogatych w pary AT rozpoczynają proces
rozplatania matrycowego DNA i syntezy
odcinka starterowego RNA.
Białka dnaB i dnaC łączą się z białkiem
dnaA,

rozrywają

wiązania

wodorowe

pomiędzy

komplementarnymi

zasadami

dwuniciowej helisy i zapętlają jednoniciowy
DNA, stabilizowany przez białka wiążące
jednoniciowy DNA (SSB — ang. single
strand binding protein}.

Hipotetyczna struktura prymosomu [wg. Kornberga, 1983].

Powstanie

aktywnego

kompleksu

inicjującego zapoczątkowuje białko n' —
zawsze w takiej okolicy matrycy, która
jest zdolna do tworzenia struktury
szpilki do włosów.
Mając aktywność ATP-azy białko n'
może przekształcać energię wiązań
chemicznych

ATP

w

energię

mechaniczną.
Białko to dołączone do matrycy ssDNA
w primosomie, jest miejscem dołączenia
kompleksu BC (białka DnaB-DnaC).
Białko n', wspólnie z białkiem dnaB,
działają jako helikazy i rozdzielają nici
podwójnej helisy, umożliwiając ruch
pry-mosomu względem matrycy.

Kompleks BC jest odpowiedzialny za
miejsce przyłączenia prymosomu do
DNA, za wytworzenie w nim pętli i
dołączenie prymazy oraz pozostałych
białek współdziałających.
Prymaza syntetyzuje krótkie odcinki
startera w pętli matrycy, a zablokowanie
jej, np. przez topoizomerazę I, RNazę H
lub wysokie stężenie białka H, powoduje
włączenie się do inicjacji replikacji
polimerazy RNA.
Ponieważ

enzym

ten

rozpoczyna

transkrypcję nie tylko w sąsiedztwie
sekwencji oriC, lecz także w wielu
innych regionach matrycy DNA, to
niezbędna jest obecność RNazy H, która
hydrolizuje transkrypty zlokalizowane
poza sekwencją oriC.
Synteza DNA w systemie zależnym od
polimerazy RNA jest 10-krotnie mniej
wydajna niż w reakcji zależnej od
prymazy dnaG.

Replisom

Budowa widełek replikacyjnych i stały
kierunek 5'-»-3' replikacji wymusza dwa
różne mechanizmy syntezy nici prowadzącej
oraz nici opóźnionej.

Ponieważ polimeryzacja nici prowadzącej
zachodzi zgodnie z kierunkiem przesuwania
się widełek replikacyjnych, konieczny jest
tylko jeden starter RNA, który podlega
ciągłej elongacji przez polimerazę III DNA.

Na nici opóźnionej syntetyzowanych jest
wiele starterów zapoczątkowujących syntezę
fragmentów Okazaki.

Rozplatanie

helisy

DNA,

synteza

starterów RNA oraz synteza siostrzanych
nici DNA w komórce może zachodzić
równocześnie

w

wieloenzymatycznym

kompleksie

zwanym

replisomem,

zlokalizowanym

w

widełkach

replikacyjnych.

Może on być formowany na etapie
inicjacji replikacji prawdopodobnie z
udziałem białka DnaA w replikonie, tzn.
w miejscu genomu zdolnym do replikacji,
zawie rającym miejsce ori.

W komórkach E. coli dwie cząsteczki
holoenzymu polimerazy III, różniące się
składem podjednostek, tworzą asymetryczny
dimer, położony w pobliżu helikazy DnaB i
prymazy wchodzącej w skład prymosomu.

Helikazy są odpowiedzialne za rozdzielenie
nici rodzicielskiego DNA, natomiast prymazy
za syntezę startera i zapętlenie nici
opóźnionej, co zmienia kierunek syntezy
DNA o 180

0

. W wyniku tego procesu,

kierunek syntezy nici opóźnionej staje się
taki sam jak na nici prowadzącej, a więc
zgodny z ruchem widełek replikacyjnych.

Dzięki połączeniu się z drugą cząsteczką
holoenzymu i zapętleniu nici opóźnionej,
dimer może równocześnie katalizować
syntezę

obydwu

nici

siostrzanych

i

poruszać się zgodnie z ruchem widełek
replikacyjnych.

Matryca nici opóźnionej po zakończeniu
syntezy

fragmentu

Okazaki

może

oddysocjowywać bez naruszenia struktury
dimeru oraz bez odłączenia enzymu od nici
wiodącej.

Holoenzym polimerazy III syntetyzuje
opóźnioną nić DNA, nie może jednak
usunąć

primerów

RNA

i

wypełnić

pozostających po nich luk. Funkcję tę pełni
polimeraza I DNA, która przyłącza się do
przerw w nici pozostających po syntezie
fragmentów

Okazaki,

wypełnia

luki,

jednocześnie usuwając primery.

Egzonukleolityczną aktywność polimerazy I
DNA wspomaga RNaza H, która nie może
zastąpić Poi I, ponieważ jedynie polimeraza
potrafi

usunąć

ostatni

rybonukleotyd

startera,

jednak

nie

może

połączyć

wiązaniem fosfodiestrowym sąsiadujących
ze sobą sparowanych nukleotydów.
Produktami reakcji katalizowanej przez
holoenzym Poi III i Poi I są dwie
dwuniciowe cząsteczki DNA, zawierające
przerwy w miejscach rozpoczęcia syntezy
primerów.
Syntezę

wiązania

fosfodiestrowego

pomiędzy

sąsiadującymi

ze

sobą,

sparowanymi

nukteotydami

katalizuje

ligaza DNA.

Źródłem energii w tej reakcji jest hydroliza
jednej

cząsteczki

NAD+

na

każde

powstające wiązanie fosfodiestrowe.

W komórkach E. coli para widełek
replikacyjnych startuje w różnych
kierunkach z regionu oriC i okrąża cały
chromosom w ciągu 42 minut.

Dwukierunkowa replikacja chromosomu
bakteryjnego rozpoczyna się, od sekwencji
oriC, a kończy się, gdy widełki replikacyjne
spotykają się w regionie terminatorowym.

Schemat replisomu — miejsca równoczesnego
rozplatania helisy DNA, syntezy starterow RNA i
siostrzanych nici DNA [wg Jachymczyk 1987 w
Biologii molekularnej pod redakcją Z. Lassoty]

Po zakończeniu procesu syntezy nici
potomnych, DNA ma postać dwóch
kowalencyjnie zamkniętych, kolistych,
splecionych ze sobą cząsteczek.

Muszą one ulec rozdzieleniu, czyli
dekatenacji podczas ostatniego etapu
replikacji.

Jeżeli obie cząsteczki potomne nie mają
nacięć w łańcuchach DNA, to jedynie
topoizomerazy klasy II mogą katalizować
dekatenację, (gyraza lub topoizomeraza
IV).

Niektórzy autorzy sugerują, że gyraza
działa na etapie inicjacji i elongacji,
wprowadzając negatywne supereheliksy, a
głównym enzymem odpowiedzialnym za
dekatenację jest topoizomeraza IV.

Replikacja DNA w komórkach
eukariotycznych

DNA komórek eukariotycznych ma postać
silnie upakowaną. Cząsteczka DNA jest
pozornie skrócona ok.10 000 razy. Nie
licząc małych genomów mitochondriów i
chloroplastów

(DNA

cytoplazmatyczne),

DNA

jądrowe

jest

biblioteką

prawie

wszystkich genów komórkowych.
Replikacja

DNA

jądrowego

i

cytoplazmatycznego przebiega w różny
sposób i w różnym czasie.
Synteza DNA cytoplazmatycznego zachodzi
w fazie Gl lub, jak twierdzą niektórzy
autorzy, w ciągu całego cyklu komórkowego,
podczas gdy replikacja DNA jądrowego ma
miejsce zazwyczaj okresowo i zajmuje
jedynie ułamek wspomnianego cyklu.

W

komórkach

ssaków

synteza

DNA

jądrowego trwa przez ok. 6—8 godzin.

Okres ten jest zwykle oddzielony czasowo
od fazy mitotycznej przez okresy, w których
nie zachodzi synteza DNA, określanych
jako przerwa l (ang. gap l — G1) i przerwa
2 (ang. gap 2 — G2), które pojawiają się
odpowiednio przed i po fazie S.

W czasie fazy S DNA jądrowy jest
replikowany tylko jeden raz.

Zwykłe wszystkie chromosomy zaczynają
replikować w fazie S synchronicznie z
licznych miejsc startu replikacji (ok. 10
lub

więcej

w

genomie

komórek

eukariotycznych).

Dotyczy to głównie tak zwanych części
euchromatynowych

o

bardziej

rozluźnionej strukturze chro matyny.

Części

heterochromatynowe

o

chromatynie silnie skondensowanej, czym
często charakteryzują się chromosomy
płci, mogą zaczynać i kończyć replikację
z istotnym opóźnieniem.

Model replikacji DNA

W

chromosomach

eukariontów

ruch

widełek

replikacyjnych

jest

zawsze

dwukierunkowy — tak jak u bakterii.

Liczne miejsca inicjacji są rozłożone
wzdłuż

każdego

z

chromosomów

eukariotycznych w różnych odstępach, u
różnych

typów

komórek,

nawet

pochodzących z tego samego organizmu.

W komórkach zwierzęcych szybko się
dzielących,

np.

w

komórkach

embrionalnych,

liczba

jednostek

replikacyjnych w chromosomie może być
wielokrotnie wyższa niż w komórkach
somatycznych wolno się dzielących.

Im więcej jest miejsc startu replikacji i
krótsza długość replikonu, tym szybciej
przebiega replikacja chromosomu.

Wielkość poszczególnych replikonów może
się zmieniać w bardzo szerokich granicach,
od 50 do 330 kb.

Nowo powstały DNA ma zawsze budowę
nukleosomową — taką samą jak DNA nie
replikujący się.

Histony

rodzicielskiego

DNA

są

przenoszone na ramię wyprzedzające (nić
wiodąca).
Ramię opóźnione łączy się z histonami puli
komórkowej.

Jako pierwsze z replikującym się DNA łączą
się histony H3 i H4.
W

czasie

gdy

replikacja

postępuje,

dołączają się histony H2A i H2B, tworząc
właściwy rdzeń nukleosomu w odległości 5
—30 kz od widełek replikacyjnych.
Jako ostatni dołącza się histon Hl, ustalając
strukturę solenoidu.

Łączenie się replikowanego DNA z białkami
(„dojrzewanie" chromatyny) zabezpiecza
chromosomy przed powtórną replikacja w
tym samym cyklu.

Schemat

dojrzewania

„chromatyny"

—

tworzenie

struktury

nukleosompwej

replikowanego DNA [wg. Jachymczyk 1987]. Od
początku

widełek

replikacyjnych

pierwszy

nukleosom

powstaje:

a)

na

ramieniu

wyprzedzającym

w

odległości

110-125

nukleotydów, b) na ramieniu opóźnionym w
odległości 350 nukleotydów.

Replikacja DNA w mitochondriach

Mitochondrialny DNA stanowi zaledwie
0.2%

całkowitego

DNA

komórek

zwierzęcych i ma kształt kolisty.

W mitochondriach DNA występuje w kilku
kopiach.

Zazwyczaj

na

jedno

mitochondrium przypadają dwie do sześciu
cząsteczek

DNA,

chociaż

w

mitochondriach drożdży jest ich aż 50.
Stosunki ilościowe między zasadami w
DNA mitochondrialnym bardziej przy
pominają stosunki właściwe dla DNA
komórek prokariotycznych, aniżeli te,
które się stwierdza w DNA obecnym w
jądrach komórek eukariotycznych.

Mitochondrialny DNA tworzy pętlę, od
której rozpoczyna się replikacja, biegnąca
w jednym kierunku.
Może ona obejmować znaczną część DNA
mitochondrialnego,

jednak

w

danym

momencie jedynie niewielki fragment
podlega replikacji.

Synteza mitochondrialnego DNA zachodzi
w sposób ciągły podczas całego cyklu
komórkowego i nie jest skoordynowana z
cykliczną replikacją DNA jądrowego.

Synteza

DNA

zachodzi

wolniej

w

mitochondrium niż w jądrze.

Dla

DNA

mitochondrialnego

istnieje

specyficzna

struktura

widełek

replikacyjnych,

tak

zwana

struktura

przemieszczającej się pętli lub pętli D (ang.
displacement loop). W odróżnieniu od
innych sposobów replikacji kolistego DNA
zachodzi w sposób asymetryczny.

A- inicjacja replikacji; B-replikacja tylko jednej
nici; C- replikacja drugiej nici DNA inicjowana
dopiero po zrepli-
kowaniu więcej niż połowy nici pierwszej.

Replikacja DNA wirusowego

W komórce, oprócz DNA genomowego
mogą występować inne cząsteczki tego
biopolimeru,

stanowiące

odrębne

replikony, np. DNA różnych patogenów.
Replikacja DNA wirusowego w komórkach
zależy od ich wyposażenia genetycznego
oraz typu cyklu rozwojowego.

W cyklu litycznym genom DNA wirusów
może namnażać się niezależnie od genomu
gospodarza,

podczas

gdy

w

cyklu

lizogennym, gdy DNA wirusowy integruje
się

z

chromosomem

zainfekowanej

komórki, genom wirusa powiela się wraz z
genomem gospodarza, a specyficzne białka
wirusowe blokują dodatkowe replikacje.

NP. w procesie transkrypcji genomu faga
A wraz z genomem gospodarza powstaje
swoisty mRNA wirusowy, kodujący białko
zwane represorem A. Zapobiega on
replikacji wegetatywnej formy wirusa i u-
trzymuje stan lizogenii. W obecności
represora A komórka niosąca profaga nie
ulega już superinfekcji, czyli zakażeniu
nową cząstką wi rusa A, a więc wykazuje
tzw. immunię fagową. Gdy produkcja
represora A zostanie zahamowana, wirus
wchodzi w cykl lityczny. Profag uwalnia
się z chromosomu E. coli i ulega
raptownej replikacji wegetatywnej w
cytoplazmie.
Nieprecyzyjnie wycięte z genomu profagi
zawierają fragmenty genomu wirusa i
genomu

gospodarza,

mogą

więc

powodować transdukcję.

Niektóre wirusy mają zdolność replikacji
cząsteczki liniowej na kolistej matrycy
DNA zgodnie z modelem kręcącego się
koła (ang. rolling circle).

Ten sposób replikacji rozpoczyna się
przez nacięcie jednej nici. Miejsce to:
koniec

3'-OH

staje

się

punktem

startowym do syntezy dalszego ciągu
przeciętego łańcucha wokół kolistej
drugiej nici, służącej jako matryca.
Postępująca replikacja odsuwa drugą nić.
Gdy odsunięty koniec 5' zakotwiczy się w
błonie komórkowej replikacja może
prowadzić do powstania bardzo długich
cząsteczek DNA, będących wielokrotnym
powieleniem

genomu

matrycy.

Następnie,

w

zależności

od

faga,

konkatamery są rozcinane w różny
sposób

na

odcinki

odpowiadające

pojedynczym genomom fagowym.

Konkatameryzacja genomów potomnych
zapobiega

stopniowemu

skracaniu

końców 5' nici potomnych.

Utrata końców 5' cząsteczek DNA w
procesie replikacji liniowego DNA wynika
z właściwości polimerazy DNA, która nie
potrafi rozpocząć syntezy bez obecności
startera

(fragmentu

RNA,

który

w

procesie

terminacji

replikacji

ulega

degradacji)

oraz

braku

zdolności

dobudowywania kolejnych nukleotydów do
końca 3'.

Kolejne

rundy

replikacji

liniowego

genomu fagów przez skracanie końców 5'
nici potomnych doprowadziłyby do utraty
fragmentów informacji genetycznej.

Replikacja fagów ssDNA

Jednoniciowa kolista cząsteczka DNA faga

(nić (+) plus), wprowadzona do komórki,
musi przejść trzy różne etapy replikacji,
aby w końcu cyklu litycznego mogły
powstać potomne cząstki fagów:

a) przeprowadzenie formy ssDNA w formę

dsDNA

przez

dosyntetyzowanie

komplementarnej nici minus (-), tzn.
synteza nici replikacyjnej (RF),

b) namnożenie formy replikacyjnej (RF),

c) namnożenie nici (+) plus na matrycy

komplementarnej nici (-).

Po infekcji, w zakażonej komórce na
matrycy

kolistej

cząsteczki

ssDNA

wirusowego,

z

udziałem

enzymów

komórkowych, zachodzi synteza nici minus
(-).

W pierwszym etapie replikacji ssDNA
zostaje rozpleciona, ponieważ upakowanie
genomu w wirionie powoduje zwinięcie
ssDNA w kłębek, w którym pewne rejony
występują

w

postaci

dsDNA,

uniemożliwiającej przebieg replikacji.

Następnie komórkowa polimeraza RNA
rozpoczyna syntezę startera RNA, do
którego również komórkowa polimeraza
DNA dobudowuje kolejne nukleotydy.

W efekcie powstaje hybrydowa postać nici
minus, rozpoczynająca się odcinkiem RNA.

W końcowym etapie replikacji starter RNA
jest degradowany, a brakujący fragment
DNA dobudowywany. Powstaje dwuniciowa
kołowa forma ds. DNA zwana formą
replikacyjną II (RFII).
Końce 3' i 5' nici minus nie są jeszcze ze
sobą połączone.
Pod

wpływem

ligazy

DNA

następuje

cyrkularyzacja nici minus i powstaje w
pełni kołowa forma dwuniciowego DNA,
zwana RFI (formą transkrypcyjną).

Cząsteczki mRNA powstające na nici minus
w procesie translacji, powodują syntezę
wirusowych białek, niezbędnych do zajścia
drugiego etapu syntezy DNA wirusowego, a
mianowicie replikacji form RF .

Replikacja wirusów dsDNA

Fagi o dwuniciowym, liniowym DNA
najczęściej zawierają geny własnych
fagowych polimeraz DNA i RNA oraz
kilka innych genów kodujących białka
związane z replikacja jego kwasu
deoksyrybonu-kleinowego.

W tych przypadkach replikacja DNA
fagowego jest w dużym stopniu
niezależna od białek bakteryjnych.

Mechanizmy regulacji replikacji

Replikacja

DNA

może

przebiegać

z

wykorzystaniem różnych alternatywnych
mechanizmów działania.

Nawet w obrębie pojedynczej komórki
bakteryjnej

znajdują

się

dodatkowe

polimerazy DNA, pomocnicze prymazy, czy
ukryte miejsca inicjacji, nie używane w
normalnych warunkach rozwoju.

Pozwala to na wybór czasu, miejsca i
mechanizmu inicjacji rundy replikacyjnej.

Kontrola replikacji DNA zachodzi na
trzech etapach:
-na etapie regulacji inicjacji replikonów,
-na etapie ruchu widełek replikacyjnych,
-na etapie regulacji cyklu komórkowego.

Istnieje

ścisła

korelacja

pomiędzy

replikacja i masą komórki.
Inicjacja replikacji może zatem być
sterowana

przez

takie

procesy

metaboliczne, jak synteza białka czy RNA
lub synteza błon lub ścian komórkowych,
np. u prokariontów — małe naturalne
transkrypty,

komplementarne

do

sensownej nici DNA, tzw. antysensowny
RNA (ang. antisense RNA) regulują
replikację DNA, niezgodności plazmidów,
reprodukcję fagów.

Udział błon komórkowych w
regulacji replikacji

Bezpośrednie

oddziaływanie

kwaśnych

fosfolipidów z białkiem inicjatorowym
DnaA

może

być

mechanizmem

syn-

chronizującym zmiany w strukturze błon
zachodzące w czasie podziału komórki z
inicjacją

replikacji

chromosomu

bakteryjnego.
Innym czynnikem wiążącym replikację z
metabolizmem błony komórkowej jest
metylacja sekwencji oriC, katalizowana
przez

metylotransferazę

Dam.

Bezpośrednio

po

zakończeniu

cyklu

replikacji adenina w sekwencjach GATC
jest zmetylowana, jedynie na jednej
(rodzicielskiej) nici DNA.

Hemimetylowana

sekwencja

oriC,

w

porównaniu z sekwencją oriC w pełni
zmetylowaną, ma większe powinowactwo do
błony ko mórkowej.

W

wyniku

wiązania

hemimetylowanej

sekwencji oriC z błoną, inicjacja kolejnej
rundy replikacji jest zablokowana, aż do
czasu metylacji sekwencji GATC nici
potomnej.
Wtedy powinowactwo rejonu oriC do błony
maleje i po uwolnieniu cząsteczki DNA
może ponow nie dochodzić do utworzenia
kompleksu

inicjacyjnego

(Campbell

i

Kleckner 1990).

Aktywatory i inhibitory replikacji

Od wielu lat panowała opinia, że replikacja
DNA jest regulowana na poziomie inicjacji
jedynie przez pozytywny czynnik aktywujący.

Białko DnaA ma takie cechy, jednak wymaga
współudziału innych czynników białkowych.

Powstanie aktywnego kompleksu inicjującego
replikację zależną od sekwencji oriC polega
na przyłączeniu białka inicjatorowego DnaA i
lokalnym rozwinięciu heliksu DNA

Wyizolowano i oczyszczono białko, które
specyficznie hamuje replikację.
Białko to nazwano IciA (ang. inhibitor of
chro-mosome initiation).
Jest to dimer o masie podjednostki 33 kDa
i wiąże się specyficznie z bogatymi w pary
AT sekwencjami: L, M i R), blokując
rozwinięcie tego regionu, katalizowane
przez białko DnaA.
Bakterie, w których nadprodukowano
białko

IciA

charakteryzowały

się

wolniejszym wzrostem.

Białko IciA może zatem być ważnym
czynnikiem

regulującym

częstotliwość

inicjacji replikacji.

Istotny sposób regulacji inicjacji znany jest
pod nazwą modelu rozcieńczenia inhibitora.

Według niego inicjacja replikacji następuje
w momencie, kiedy stężenie hipotetycznego
represora spada poniżej ściśle określonego
poziomu.

Gen struktury tego represora, zlokalizowany
w

pobliżu

miejsca

inicjacji,

byłby

uaktywniony zaraz po rozpoczęciu rundy
replikacyjnej,

co

prowadziłoby

do

hamowania inicjacji następnej rundy.

Szybkość syntezy białek komórkowych
decydowałaby,

kiedy

rozcieńczenie

represora przez inne białka sprowadzi jego
stężenie do poziomu umożliwiającego nową
inicjację.

Regulacja replikacji w warunkach
głodu

Zahamowanie syntezy białka i RNA przez
głodzenie

aminokwasowe

nie

hamuje

replikacji natychmiast.

Jest ona kontynuowana aż do zakończenia
pełnych rund, natomiast nie zachodzi już
inicjacja nowych rund replikacji.

Z

kolei

dostarczenie

wygłodzonym

komórkom

brakujących

składników

pożywienia

powoduje

natychmiastowe

rozpoczęcie syntezy białka i RNA, lecz nie
syntezy DNA, która rozpoczyna się dopiero
po upływie pewnego czasu i zawsze poprzez
rozpoczęcie nowej rundy replikacji, nawet
jeśli chromosomy nie zostały ukończone w
poprzedniej rundzie.

Indukowana stabilna replikacja

Odpowiedzią na zahamowanie replikacji z
powodu uszkodzenia DNA lub działania
inhibitorów jest włączenie się systemu
naprawy DNA SOS.
Uogólniając, można stwierdzić, że system
ten

polega

na

derepresji

około

20

nieliniowo położonych genów, będących pod
kontrolą represora Lex A, w wyniku czego
dochodzi do naprawy DNA, mutagenezy,
zahamowania podziałów, restrykcji, indukcji
niektórych kolicyn, indukcji profagów oraz
stabilnej replikacji.
Indukowana stabilna replikacja (SDR ang.
inducible stable DNA replicatiori) jest to
replikacja, która w odróżnieniu od replikacji
zależnej od miejsc oriC i białka DnaA,
przeważającej w komórce, nie wymaga
syntezy białka.