Replikacja, naprawa i

rekombinacja DNA u

eukariontów

Zasada replikacji DNA

Replikacja DNA jest elementem cyklu komórkowego

U eukariontów DNA występuje w kompleksie

zwanym chromatyną

Replikacja u eukariontów

• Inicjacja, elongacja, terminacja
• Problem końców chromosomów
• Jądro - organelle

Inicjacja

(replikacja zaczyna się jednocześnie w wielu

miejscach)

ORI (Origins of replication)

• ARS (Autonomously Replicating Sequence) u drożdży
- Specyficzna sekwencja 200 pz jest minimalną sekwencja

wymaganą do inicjacji replikacji chromosomowego DNA.

U ssaków inicjacja (ORI) obejmuje sekwencję 10 000 pz
U roślin sekwencje ORI nie są zidentyfikowane
W chromosomach istnieje wiele potencjalnych ORI, ale nie

wszystkie funkcjonują w każdej komórce

Fragment DNA replikowany z jednego ORI nosi nazwę replikonu (

u roślin długość replikonu to przeciętnie 50-70 kb)

Nie wszystkie ORI startują w tym samym momencie, jednak

porządek ich uruchamiania jest w komórkach ściśle
kontrolowany i zależy od stanu kondensacji chromatyny w
danym miejscu.

Kontrola inicjacji

• Licencjonowanie (kontrola pozytywna) –

zapewnia, że

chromosomy będą się replikować tylko wtedy, gdy w sposób
prawidłowy przejdą przez mitozę i znajda się w komórce
potomnej

• Aby nastąpiła inicjacja, do ORI musi się przyłączyć

Kompleks Rozpoznający Origin (ORC – Origin Recognition
Complex) i dodatkowe białka (czynniki licencjonujące Cdc-6
i Cdt-1) umożliwiające ścisłe pokrycie sąsiadującego DNA
białkami MCM (Minichromosome Maintenance). Tylko DNA
pokryty białkami MCM może być replikowany. Białka MCM
są usuwane przez przesuwające się widełki replikacyjne.

Licencjonowanie w ORI

Negatywna kontrola inicjacji - Geminina

• Geminina – białko występujące w komórkach w

fazie G2

• Przeciwdziała przyłączaniu się białek MCM do

świeżo zreplikowanego DNA (zablokowanie
czynnika Cdt-1)

• Jest degradowana po zakończeniu mitozy
• Gemininy nie wykryto w drożdżach i roślinach!

Kontrola inicjacji w cyklu komórkowym

Elongacja

• Kompleks wielo enzymatyczny zawierający polimerazę DNA

katalizuje przyłączanie deoksyrybonukleotydów do 3’ końca
DNA lub RNA przyłączonego do nici matrycowej DNA.

• Synteza DNA idzie w kierunku

5’ – 3

’, a matryca jest

odczytywana w kierunku

3’-5’.

• Polimeraza DNA może dodawać nukleotydy tylko do już

istniejącego fragmentu kwasu nukleinowego (primera).

• Polimeraza DNA jest nie aktywna w nieobecności primera z

wolną grupą 3’ OH, związanego poprzez wiązania wodorowe
z matrycą.

• Primery są syntetyzowane przez specyficzną polimerazę

rybonukleotydową zwaną DNA primazą. Inicjuje ona syntezę
primera rozpoczynając od rybonukleotydu purynowego.

Przyłączanie deoksyrybonukleotydów przez polimerazę DNA

Elongacja - cd

• Ze względu na asymetrię widełek replikacyjnych

*(kierunki!) synteza DNA jest w połowie nieciągła. Na nici
wiodącej (jeden primer) dodawanie nukleotydów odbywa
się w sposób ciągły. Na nici opóźnionej synteza odbywa się
w formie krótkich fragmentów Okazaki, z których każdy
wymaga swojego primera.

• Wytworzenie ciągłej cząsteczki na matrycy nici opóźnionej

wymaga systemu naprawy DNA zawierającego specyficzną
rybonukleazę – RNazę H, który usuwa primery RNA i
zastępuje je fragmentami DNA. Inny enzym – ligaza DNA
łączy koniec 3’ nowego fragmentu DNA z 5’ końcem
fragmentu DNA poniżej.

Elongacja - widełki replikacyjne

Elongacja - cd

• W jądrze eukariontów występują trzy główne polimerazy

DNA – α, δ i ε.

• α – głównie funkcja primazy
• δ i ε – synteza DNA na nici prowadzącej i opóźnionej.
• Helikaza DNA (występuje w kompleksie z pol δ i ε ) rozplata

dwuniciowy DNA u nasady widełek.

• Topoizomerazy DNA usuwają napięcia torsyjne powstające

w wyniku rozplatania (są przyłączone przed widełkami).

Elongacja - cd

Wierność replikacji

• Wysoka wierność replikacji (śr. 1 błąd na 10

zreplikowanych pz).

• Polimerazy DNA są enzymami z funkcją autokorety

(proofreading), które usuwają własne błędy podczas
replikacji.

• Kluczowe dla autokorekty są ich aktywności 3’-5’

egzonukleazy, dzięki którym usuwają źle sparowane
nukleotydy od 3’ końca nowo zsyntetyzowanego fragmentu
DNA. Specjalny system naprawy uzupełnia następnie
brakujące fragmenty nici.

Niektórych błędów nie da się skorygować

Terminacja replikacji

• Terminacja następuje w miejscach, w których

spotykają się nowo syntetyzowane nici DNA
powstałe z dwóch sąsiadujących miejsc ORI.

Aktywność telomerazowa -replikacja końców

chromosomów (telomerów)

Punkty kontrolne (checkpoints) w cyklu komórkowym

Chromosomy politeniczne (Drosophila – 10 rund replikacji bez

rozdzielania cząsteczek = 2048 cząsteczek ułożonych obok siebie)

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)

Produkty PCR (polimeraza Taq)

Przyczyny uszkodzeń DNA i ich efekty

• Tlen, wolne rodniki
• UV
• Związki alkilujące
• Spontaniczna deaminacja (C

do U)

• Przerwanie łańcucha
• Modyfikacje chemiczne zasad
• włączanie niesparowanych

zasad w trakcie replikacji

Uszkodzenia DNA - przykłady

Systemy naprawy DNA

• Wycięcie nukleotydów
• (dimery pirymidyn, aberracje

struktury)

• Naprawa błędnie sparowanych

nukleotydów (mylnie sparowane
zasady)

• Naprawa przez wycięcie zasad

(nietypowe – hipoksantyna,
uracyl-, zalkilowane zasady)

• Naprawa bezpośrednia

(metyloguanina, dimery
pirymidyn)

• System helikazy XPA

(Xerdoerma pigmentosum)

• Homologi bakteryjnych białek

typu Mut

• Glikozylaza DNA, polimeraza δ

• Guanino-6-metylotransferaza

Rekombinacja DNA

• Gra ważną rolę w podziale mejotycznym komórek

(zapewnia zróżnicowanie genetyczne gamet) i, na dłuższą
metę - w ewolucji (rearanżacje sekwencji DNA umożliwiają
nowe kombinacje sekwencji, które mogą generować nowe
rodzaje RNA i białek, wpływając na fenotyp).

• Mechanizmy rekombinacji są powiązane ściśle z

mechanizmami replikacji i naprawy