WykREPLNaprBIOCH [tryb zgodności]

REPLIKACJA

REPLIKACJA - Podstawowy proces umoŜliwiający dokładne skopiowanie

całkowitej informacji zawartej w genomie, która następnie zostaje przekazana

komórkom potomnym.

Obie

nici rodzicielskie

- matryca dla

nici potomnych

Mechanizm replikacji jest

SEMIKONSERWATYWNY

KaŜda nić podwójnej helisy DNA niesie tę samą informację, dlatego obie nici

rodzicielskie mogą słuŜyć jako matryca do syntezy nowej komplemetarnej nici

potomnej. Po zakończeniu syntezy powstają dwie identyczne kopie genomu, przy

czym jedna nić pochodzi z komórki rodzicielskiej a druga jest

nowozsyntetyzowaną nicią potomną. Nowopowstałe cząsteczki podczas podziału

komórkowego zostają przekazane do dwóch komórek potomnych.

Miejsce inicjacji replikacji

Ori

(

ang. origine)

widełki replikacyjne

- ruch w przeciwnych kierunkach

REPLIKON

- fragment DNA replikujący jako pojedyncza cząsteczka.

Kolisty chromosom bakteryjny - jeden replikon,

Chromosom eukariotyczny - wiele miejsc inicjacji

Mechanizm inicjacji u

E.coli

sekwencje 13-nukleotydowe

(A) Struktura miejsca inicjacji

oriC

sekwencje 9-nukleotydowe
miejsca wiązania białka DnaA

miejsca wiązania białka DnaA

(B) Topnienie struktury helisy

region podlegający topnieniu

kompleks DnaA w kształcie baryłki

Brown, Genomy, 2001, Rys 12.7

Do powstałego oczka przyłączają się białka

DnaB-DnaC

• DnaC

- przenośnik

• DnaB

– helikaza odpowiedzialna za przerywanie wiązań

wodorowych pomiędzy zasadami dwóch nici łańcucha DNA.

Mechanizm inicjacji u

E.coli

Wykształcenie „oczka replikacyjnego”

i uformowanie aktywnych widełek replikacyjnych kończy

fazę inicjacji.

Miejsce inicjacji replikacji u droŜdŜy ARS (

ang.

Autonnomously

Replicating Sequence) (ok. 200pz);

obejmuje subdomeny

- wiąŜą

kompleks rozpoznający ORC

(

ang.

Origin

Mechanizm inicjacji u droŜdŜy

- wiąŜą

kompleks rozpoznający ORC

(

ang.

Origin

Recognition Complex);

- miejsce rozplatania helisy

- wiązanie czynnika białkowego ABF1

Replikony mogą ulegać replikacji tylko raz w trakcie cyklu

komórkowego!

20 bp

Origin recognition

(A) Struktura droŜdŜowego miejsca inicjacji replikacji

Mechanizm inicjacji u droŜdŜy

Origin recognition

sequences

(B) Proces topnienia helisy

region podlegający topnieniu

ABF1

ORC

Brown, Genomy, 2001, Rys 12.8

ABF1 - ARS binding factor 1

Inicjacja replikacji u wyŜszych eukariotów

• Brak sekwencji ARS

• Strefy inicjacyjne o dł. do 10 000 pz w obszarach

międzygenowych

• Replikacja zaczyna się wewnątrz kaŜdej strefy, w obrębie

jednego odcinka DNA o dł. 200-500 pz

• Podczas róŜnych rund replikacyjnych odcinki te

występować mogą w róŜnych miejscach strefy replikacyjnej

Polimeraza DNA

-Synteza nici DNA - tylko w kierunku

5’ —> 3’

-Obecność tzw.

startera

- Substraty -

5’-trifosforany deoksyrybonukleotydów

(dATP, dCTP,

dGTP, dTTP).

- Substraty -

5’-trifosforany deoksyrybonukleotydów

(dATP, dCTP,

dGTP, dTTP).

- Aktywność 3’ —> 5’

egzonukleazy

, umoŜliwia naprawę błędów przypadkowo

popełnionych podczas syntezy

- Aktywność 5’ —> 3’ egzonuklezy - niektóre.

Faza Elongacji:

- Jedna nić syntetyzowana w sposób ciągły - tzw.

nić wiodąca

- Druga nić – synteza nieciągła:

fragmenty Okazaki

– tzw.

nić opóźniona

U bakterii długość fragmentów Okazaki: 1000 - 2000 pz.

W komórkach eukariotycznych: 100 - 200 pz.

Białka zaangaŜowane w proces replikacji u bakterii:

-helikaza -rozplata podwójn

helis

DNA

- białka wi

ąŜą

ce jednoniciowy DNA SSB - stabilizuj

jednoniciowe obszary DNA,

-prymaza - enzym syntetyzuj

cy startery RNA

-polimeraza DNA III - prowadzi syntez

obu nici DNA wiod

cej i opó

nionej

Polimeraza DNA III nie posiada aktywno

ci egzonukleolitycznej 5’—>3’, nie mo

usuwa

starterów RNA, dlatego po odł

czeniu enzymu od nici opó

nionej, przył

cza

polimeraza DNA I, która usuwa sekwencje starterowe i uzupełnia brakuj

fragment ła

cucha wydłu

c koniec 3’ poprzedniego fragmentu Okazaki.

- polimeraza DNA I - usuwa startery (aktywno

ść

egzonukleazy 5’ —> 3’) i

dobudowuje brakuj

cy fragment

-ligaza DNA - ł

czy rozdzielone fragmenty powstałe na matrycy opó

nionej

Brakuj

ce wi

zanie fosfodiestrowe uzupełnia ligaza DNA.

-topoizomeraza (gyraza) – wprowadza ujemne superskr

- DNA ulega replikacji tylko podczas fazy S!

•

euchromatyna

– wczesna faza S,

•

heterochromatyna

- późna fazie S,

• na końcu – centromery i telomery.

- DNA musi zostać odwinięte z nukleosomów,

Replikacja u Eukariota

- DNA musi zostać odwinięte z nukleosomów,

białko replikacyjne A

(

RPA

ang

Replication Protein A

) – stabilizuje

jednoniciowe DNA

- Polimeraza DNA

– posiada aktywność prymazy, synteza starterów.

Polimeraza DNA

oddziaływuje z

białkiem PCNA

(

ang. Proliferating

Cell Nuclear Antigen

Ligazy DNA

Ligazy DNA – enzymy syntetyzujące wiązanie fosfodiestrowe

między sąsiadującymi grupami 3`-OH i 5`-P nukleotydów
połączonych wiązaniami wodorowymi z matrycową nicią DNA
jako część procesów replikacji, naprawy i rekombinacji DNA

ZaleŜność od kofaktorów:

enzymy NAD-zaleŜne

: ligazy bakteryjne

enzymy ATP-zaleŜne

: ligazy eukariontów i wirusów

(np. bakteriofagów)

Terminacja replikacji DNA

sekwencje terminatorowe

- wiązanie

białka Tus

- potomne cząsteczki DNA rozłączone przez

topoizomerazę IV

W komórkach eukariotycznych nie znaleziono sekwencji odpowiada-

jących s. terminatorowym, ani białek podobnych do białka Tus.
Prawdopodobnie terminacja ma miejsce po połączeniu się sąsiednich
widełek replikacyjnych.

Mutacje i naprawa DNA

Mutacje punktowe

- zmiana jednej zasady

Substytucje

- (podstawienia)

TRANZYCJE

- zamiana puryny w purunę, lub pirymidyny w

TRANZYCJE

- zamiana puryny w purunę, lub pirymidyny w

pirymidynę: A G, G A, C T lub T C.

TRANSWERSJE

- zmiany puryny w pirymidynę lub pirymidyny w

purynę: A C, A T, G C, G T, C A, C G,
T A, T G.

Substytucje mogą prowadzić do:

- zmiany funkcji białka

- utraty funkcji białka

Mutacje ciche

- gdy nie powodują zauwaŜalnych efektów

Mutacje minisensowne

- gdy dochodzi do zmiany kodowanego

aminokwasu

Mutacje minisensowne

- gdy dochodzi do zmiany kodowanego

aminokwasu

zamiana synonimiczna

- nowy kodon odpowiada

temu samemu aminokwasowi

zamiana niesynonimiczna

– dochodzi do zamiany

aminokwasu

Mutacje nonsensowne

- gdy dochodzi do wprowadzenia kodonu stop

Delecje

- usunięcie jednej lub większej liczby par zasad

Insercje

- wstawienie jednej lub większej liczby par zasad

Delecje i insercje często nazywane są mutacjami

zmiany fazy

Mutacje zachodzące w komórce mogą spowodować znaczące skutki od

Mutacje zachodzące w komórce mogą spowodować znaczące skutki od
zaburzenia prawidłowego działania po śmierć komórki.

Mutacje są równieŜ przyczyną chorób genetycznych i powstawania
nowotworów.

Mutacje mogą powstawać na dwa sposoby:

spontanicznie

- jako błędy podczas replikacji

pod wpływem mutagenu

Aby zwiększyć dokładność replikacji polimeraza DNA posiada:

mechanizm selekcji nukleotydów

- aktywność

egzonukleazy 3’—>5’

Szybkość zachodzienia mutacji spontanicznych u

Escherichia coli

wynosi ok. jednego błedu na 10

dodawanych nukleotydów.

Mutacje spontaniczne mogą pojawiać się równieŜ na skutek

występowania izomerów strukturalnych zasad azotowych tzw.

TAUTOMERÓW

Tworzenia błędnych par
przez tautomery.

keto-tymina

enol-tymina

tworzy parę
z G zamiast A

amino-adenina

Przemiana tautomeryczna

imino-adenina

Przemiana tautomeryczna

tworzy parę
z C zamiast T

keto-guanina

enol-guanina

Przemiana tautomeryczna

tworzy parę
z T zamiast C

Rodzaje czynników środowiskowych uszkadzających Ŝywe komórki:

KARCYNOGEN

- wywołuje nowotworzenie- transformację neoplastyczną

komórek eukariotycznych

KLASTROGEN

- powoduje fragmentowanie chromosomów

MUTAGEN

- powoduje mutacje

MUTAGEN

- powoduje mutacje

PROMOTOR NOWOTWORU

- powoduje rozwój nowotworu

TERATOGEN

- powoduje zaburzenia w rozwoju

Według: Twyman (1998)

Mutageny

to czynniki fizyczne lub chemiczne, które powodują mutacje.

Mutageny chemiczne:

Analogi zasad

- np. 5-bromouracyl (analog tyminy, przewaŜa forma

enolowa tworząca parę z G zamiast A) lub
2-aminopuryna (analog adeniny, przewaŜa forma
iminowa tworząca parę z C zamiast T)

Czynniki deaminujące

- tj. kwas azotowy deaminujący adeninę,

cytozynę i guaninę, lub dwusiarczan sodowy
działający na cytozynę.

działający na cytozynę.

Czynniki alkilujące

- np. metanosulfonian etylowy (EMS), dodają grupy

alkilowe do nukleotydów w cząsteczkach DNA.
Efekt zaleŜy od pozycji w jakiej zostanie
zmodyfikowany nukleotyd jak i od rodzaju
dodanej grupy alkilowej.

Czynniki interkalujące

- np. bromek etydyny, mogą wsuwać się

pomiędzy pary zasad w podwójnej helisie,
zwiększając odległość między nimi (mutacje
typu insercji).

5-Bromouracyl

Tworzenie par komplementarnych przez 5-bromouracyl

5-bromouracyl

tautomer ketonowy

Adenina

5-bromouracyl

tautomer enolowy

Guanina

Właściwości mutagenne 5-bromouracylu

insercja
5-bromouracylu

przemiana

tautomeryczna

zmutowana cząsteczka

powrót do tautomeru ketonowego

Mutageny fizyczne:

Promieniowanie nadfioletowe (UV)

- indukuje dimeryzację

sąsiadujących ze sobą zasad pirymidynowych,
zwłaszcza tymin.

Promieniowanie jonizujące

- (np. promieniowanie X czy

) w zaleŜności

od rodzaju i natęŜenia wywierać moŜe
mutacje punktowe, delecje lub insercje.
MoŜe działać bezpośrednio na DNA lub
pośrednio uczestnicząc w tworzeniu

pośrednio uczestnicząc w tworzeniu
aktywnych cząsteczek jak nadtlenki.

Ciepło

- w obecności wody stymuluje odłączenie zasady (zazwyczaj

purynowej) od grupy cukrowej, co prowadzi do powstania luki,
która rzadko ale moŜe być wypełniona błędnym nukleotydem.

Naprawa DNA

Kategorie systemów naprawy:

Systemy naprawy bezpośredniej

- działają na uszkodzone nukleotydy

przywracając oryginalną strukturę.

Naprawa z wycinaniem zasad

- usunięcie uszkodzonej zasady

azotowej, wycięcie krótkiego fragmentu wokół i ponowna synteza przez
polimerazę DNA.

polimerazę DNA.

Naprawa z wycinaniem nukleotydów

- podobnie jak w poprzednim

przypadku z tym, Ŝe rozpoczęte wycięciem całego nukleotydu.

Naprawa niedopasowanych nukleotydów

- wycięcie fragmentu

jednoniciowego DNA z niewłaściwym nukleotydem i wypełnienie luki.

Naprawa rekombinacyjna

- wykorzystana do naprawy dwuniciowych

przerw DNA.

1) Systemy naprawy bezpośredniej

- pęknięcia (spowodowane np. przez promieniowanie jonizujące) mogą być
naprawiane przez ligazę DNA;

ligaza moŜe działać gdy przerwane jest

wiązanie fosfodiestrowe bez uszkodzenia grupy 3’-hydroksylowej i 5’-
fosforanowe

- niektóre formy uszkodzenia przez alkilację są odwracalne dzięki
aktywności enzymów tj. alkilotransferaza usuwająca grupy alkilowe z
O

-alkiloguaniny;

fotoreaktywacja

- to proces naprawy dimerów cyklobutylowych,

zaleŜny od światła, prowadzony przez enzym

fotoliazę DNA

;

2) Wycinanie zasad

glikozydaza DNA

przecina wiązanie

-N-glikozydowe

- zasada jest usuwana i powstaje tzw.

miejsce AP

- zasada jest usuwana i powstaje tzw.

miejsce AP

endonukleaza AP

przecina DNA w tych miejscach, a dzięki aktywności

egzonukleazowej moŜe poszerzyć przerwę do luki

- wypełnienie brakującego fragmentu przez polimerazę DNA

- przywrócenie ciągłości poprzez działanie ligazy DNA,

3) Naprawa z wycinaniem nukleotydów

Endonukleaza przecina precyzyjnie nić DNA po obu stronach
uszkodzenia w miejscach oddalonych o określoną liczbę nukleotydów.
Uszkodzony fragment jest usuwany i odtwarzany jak w poprzednim
przypadku na matrycy drugiej nici.

Przykładem kompleksu zaangaŜowanego w ten proces naprawy jest

endonukleaza UvrABC.

Eucaryota

naprawa przez wycinanie sprzęŜona jest z transkrypcją

dzięki czemu nici genów słuŜące jako matryca do syntezy RNA są
naprawiane szybciej niŜ rejony nie ulegające transkrypcji.

4) Naprawa niedopasowanych nukleotydów

- rozpoznanie braku komplementarności pomiędzy nicią

matrycową a potomną.

- fragment nici potomnej musi być wycięty i zsyntetyzowany na nowo

System naprawczy musi rozróŜnić te nici. U

E.coli

umoŜliwia to fakt iŜ

nić potomna jest słabiej zmetylowana w stosunku do nici matrycowej.
Proces metylacji na nici potomnej jest opóźniony w stosunku do
replikacji, co daje czas systemowi naprawczemu na wyszukiwanie
niedopasowanych nukleotydów i wprowadzenie poprawek.