REPLIKACJA

REPLIKACJA - Podstawowy proces umożliwiający dokładne skopiowanie

całkowitej informacji zawartej w genomie, która następnie zostaje przekazana

komórkom potomnym.

Obie

nici rodzicielskie

- matryca dla

nici potomnych

Mechanizm replikacji jest

SEMIKONSERWATYWNY

.

Każda nić podwójnej helisy DNA niesie tę samą informację, dlatego obie nici

rodzicielskie mogą służyć jako matryca do syntezy nowej komplemetarnej nici

potomnej. Po zakończeniu syntezy powstają dwie identyczne kopie genomu, przy

czym jedna nić pochodzi z komórki rodzicielskiej a druga jest

nowozsyntetyzowaną nicią potomną. Nowopowstałe cząsteczki podczas podziału

komórkowego zostają przekazane do dwóch komórek potomnych.

Widełki

replikacyjne

Podwójna helisa rodzicielska

replikacyjne

Dwie helisy potomne

Brown, Genomy, 2001, Rys 12.1

Proces replikacji DNA można podzielić na trzy etapy:

1. Incjacja

2. Elongacja

3. Terminacja.

Miejsce inicjacji replikacji

Ori

(

ang. origine)

widełki replikacyjne

- ruch w przeciwnych kierunkach

REPLIKON

- fragment DNA replikujący jako pojedyncza cząsteczka.

Kolisty chromosom bakteryjny - jeden replikon,

Kolisty chromosom bakteryjny - jeden replikon,

Chromosom eukariotyczny - wiele miejsc inicjacji

Inicjacja replikacji

w obrębie

oriC

występują:

-

9-cio nukleotydowe fragmenty

(pięciokrotnie powtórzone)

-

13-sto nukleotydowe fragmenty

– bogate w pary A-T

Inicjacja replikacji u

Prokaryota

Mechanizm inicjacji u

E.coli

sekwencje 13-nukleotydowe

(A) Struktura miejsca inicjacji

oriC

sekwencje 9-nukleotydowe
miejsca wiązania białka DnaA

miejsca wiązania białka DnaA

(B) Topnienie struktury helisy

region podlegający topnieniu

kompleks DnaA w kształcie baryłki

Brown, Genomy, 2001, Rys 12.7

Do powstałego oczka przyłączają się białka

DnaB-DnaC

.

• DnaC

- przenośnik

• DnaB

– helikaza odpowiedzialna za przerywanie wiązań

wodorowych pomiędzy zasadami dwóch nici łańcucha DNA.

Mechanizm inicjacji u

E.coli

Wykształcenie „oczka replikacyjnego”

i uformowanie aktywnych widełek replikacyjnych kończy

fazę inicjacji.

Replikacja kolistego chromosomu bakteryjnego

Replikacja chromosomu eukariotycznego

u drożdży: ok. 300 miejsc inicjacji; długość replikonu ~ 40 kpz

u człowieka: ok. 20 000 miejsc inicjacji, długość replikonu 40 - 200 kpz

Miejsce inicjacji replikacji u drożdży ARS (

ang.

Autonnomously

Replicating Sequence) (ok. 200pz);

obejmuje subdomeny

A

,

B1

,

B2

,

B3

.

-

A

i

B1

- wiążą

kompleks rozpoznający ORC

(

ang.

Origin

Mechanizm inicjacji u drożdży

-

A

i

B1

- wiążą

kompleks rozpoznający ORC

(

ang.

Origin

Recognition Complex);

-

B2

- miejsce rozplatania helisy

-

B3

- wiązanie czynnika białkowego ABF1

Replikony mogą ulegać replikacji tylko raz w trakcie cyklu

komórkowego!

20 bp

B3

B2

B1

A

Origin recognition

(A) Struktura drożdżowego miejsca inicjacji replikacji

Mechanizm inicjacji u drożdży

Origin recognition

sequences

(B) Proces topnienia helisy

region podlegający topnieniu

ABF1

ORC

Brown, Genomy, 2001, Rys 12.8

ABF1 - ARS binding factor 1

Inicjacja replikacji u wyższych eukariotów

• Brak sekwencji ARS

• Strefy inicjacyjne o dł. do 10 000 pz w obszarach

międzygenowych

• Replikacja zaczyna się wewnątrz każdej strefy, w obrębie

• Replikacja zaczyna się wewnątrz każdej strefy, w obrębie

jednego odcinka DNA o dł. 200-500 pz

• Podczas różnych rund replikacyjnych odcinki te

występować mogą w różnych miejscach strefy replikacyjnej

Schemat aktywacji miejsc inicjacji replikacji

u wyższych eukariotów

Elongacja

Polimeraza DNA

:

-Synteza nici DNA - tylko w kierunku

5’ —> 3’

,

-Obecność tzw.

startera

,

- Substraty -

5’-trifosforany deoksyrybonukleotydów

(dATP, dCTP,

dGTP, dTTP).

- Substraty -

5’-trifosforany deoksyrybonukleotydów

(dATP, dCTP,

dGTP, dTTP).

- Aktywność 3’ —> 5’

egzonukleazy

, umożliwia naprawę błędów przypadkowo

popełnionych podczas syntezy

- Aktywność 5’ —> 3’ egzonuklezy - niektóre.

Faza Elongacji:

- Jedna nić syntetyzowana w sposób ciągły - tzw.

nić wiodąca

.

- Druga nić – synteza nieciągła:

fragmenty Okazaki

– tzw.

nić opóźniona

.

U bakterii długość fragmentów Okazaki: 1000 - 2000 pz.

U bakterii długość fragmentów Okazaki: 1000 - 2000 pz.

W komórkach eukariotycznych: 100 - 200 pz.

Białka zaangażowane w proces replikacji u bakterii:

-helikaza -rozplata podwójn

ą

helis

ę

DNA

- białka wi

ążą

ce jednoniciowy DNA SSB - stabilizuj

ą

jednoniciowe obszary DNA,

-prymaza - enzym syntetyzuj

ą

cy startery RNA

-polimeraza DNA III - prowadzi syntez

ę

obu nici DNA wiod

ą

cej i opó

ź

nionej

Polimeraza DNA III nie posiada aktywno

ś

ci egzonukleolitycznej 5’—>3’, nie mo

ż

e

usuwa

ć

starterów RNA, dlatego po odł

ą

czeniu enzymu od nici opó

ź

nionej, przył

ą

cza

si

ę

polimeraza DNA I, która usuwa sekwencje starterowe i uzupełnia brakuj

ą

cy

fragment ła

ń

cucha wydłu

ż

aj

ą

c koniec 3’ poprzedniego fragmentu Okazaki.

- polimeraza DNA I - usuwa startery (aktywno

ść

egzonukleazy 5’ —> 3’) i

dobudowuje brakuj

ą

cy fragment

-ligaza DNA - ł

ą

czy rozdzielone fragmenty powstałe na matrycy opó

ź

nionej

Brakuj

ą

ce wi

ą

zanie fosfodiestrowe uzupełnia ligaza DNA.

-topoizomeraza (gyraza) – wprowadza ujemne superskr

ę

ty

Synteza DNA

Dwie nici helisy DNA mają przeciwną polarność, a wszystkie polimerazy DNA katalizują
dodawanie nukleotydów do grupy hydroksylowej końca 3` rosnącego łańcucha DNA, tak
więc nici DNA mogą powstawać wyłącznie w kierunku 5`→3`.

Replikacja u

Procaryota

Prymosom

- kompleks złożony z DnaB i Prymazy DNA

Replisom

- kompleks polimerazy III i prymosomu

- DNA ulega replikacji tylko podczas fazy S!

•

euchromatyna

– wczesna faza S,

•

heterochromatyna

- późna fazie S,

• na końcu – centromery i telomery.

- DNA musi zostać odwinięte z nukleosomów,

Replikacja u Eukariota

- DNA musi zostać odwinięte z nukleosomów,

-

białko replikacyjne A

(

RPA

ang

.

Replication Protein A

) – stabilizuje

jednoniciowe DNA

- Polimeraza DNA

α

– posiada aktywność prymazy, synteza starterów.

-

Polimeraza DNA

δ

oddziaływuje z

białkiem PCNA

(

ang. Proliferating

Cell Nuclear Antigen

).

Ligazy DNA

Ligazy DNA – enzymy syntetyzujące wiązanie fosfodiestrowe

między sąsiadującymi grupami 3`-OH i 5`-P nukleotydów
połączonych wiązaniami wodorowymi z matrycową nicią DNA
jako część procesów replikacji, naprawy i rekombinacji DNA

Zależność od kofaktorów:

-

enzymy NAD-zależne

: ligazy bakteryjne

-

enzymy ATP-zależne

: ligazy eukariontów i wirusów

(np. bakteriofagów)

Terminacja

Terminacja replikacji DNA

-

sekwencje terminatorowe

- wiązanie

białka Tus

- potomne cząsteczki DNA rozłączone przez

topoizomerazę IV

,

-

W komórkach eukariotycznych nie znaleziono sekwencji odpowiada-

-

W komórkach eukariotycznych nie znaleziono sekwencji odpowiada-

jących s. terminatorowym, ani białek podobnych do białka Tus.
Prawdopodobnie terminacja ma miejsce po połączeniu się sąsiednich
widełek replikacyjnych.

Terminacja replikacji DNA u

E. coli

Brown, Genoms, 2006, Ryc 13.22

Polimerazy DNA

Polimerazy DNA

E. coli

Polimeraza III DNA

E. coli

Hipotetyczny obraz struktury dimeru holoenzymu

polimerazy III DNA

Eukariotyczne polimerazy DNA

Funkcje eukariotycznych polimeraz

Mutacje i naprawa DNA

I.

Mutacje punktowe

- zmiana jednej zasady

1)

Substytucje

- (podstawienia)

a)

TRANZYCJE

- zamiana puryny w purunę, lub pirymidyny w

a)

TRANZYCJE

- zamiana puryny w purunę, lub pirymidyny w

pirymidynę: A G, G A, C T lub T C.

b)

TRANSWERSJE

- zmiany puryny w pirymidynę lub pirymidyny w

purynę: A C, A T, G C, G T, C A, C G,
T A, T G.

Substytucje mogą prowadzić do:

- zmiany funkcji białka

- utraty funkcji białka

Mutacje ciche

- gdy nie powodują zauważalnych efektów

Mutacje minisensowne

- gdy dochodzi do zmiany kodowanego

aminokwasu

Mutacje minisensowne

- gdy dochodzi do zmiany kodowanego

aminokwasu

zamiana synonimiczna

- nowy kodon odpowiada

temu samemu aminokwasowi

zamiana niesynonimiczna

– dochodzi do zamiany

aminokwasu

Mutacje nonsensowne

- gdy dochodzi do wprowadzenia kodonu stop

niesynonimiczna

synonimiczna

nonsens

pominięcie stop

2)

Delecje

- usunięcie jednej lub większej liczby par zasad

3)

Insercje

- wstawienie jednej lub większej liczby par zasad

Delecje i insercje często nazywane są mutacjami

zmiany fazy

.

Mutacje zachodzące w komórce mogą spowodować znaczące skutki od

Mutacje zachodzące w komórce mogą spowodować znaczące skutki od
zaburzenia prawidłowego działania po śmierć komórki.

Mutacje są również przyczyną chorób genetycznych i powstawania
nowotworów.

Mutacje mogą powstawać na dwa sposoby:

1)

spontanicznie

- jako błędy podczas replikacji

2)

pod wpływem mutagenu

Aby zwiększyć dokładność replikacji polimeraza DNA posiada:

-

mechanizm selekcji nukleotydów

- aktywność

egzonukleazy 3’—>5’

Szybkość zachodzienia mutacji spontanicznych u

Escherichia coli

wynosi ok. jednego błedu na 10

10

dodawanych nukleotydów.

Mutacje spontaniczne mogą pojawiać się również na skutek

występowania izomerów strukturalnych zasad azotowych tzw.

TAUTOMERÓW

.

Tworzenia błędnych par
przez tautomery.

keto-tymina

enol-tymina

tworzy parę
z G zamiast A

amino-adenina

Przemiana tautomeryczna

imino-adenina

Przemiana tautomeryczna

tworzy parę
z C zamiast T

keto-guanina

enol-guanina

Przemiana tautomeryczna

tworzy parę
z T zamiast C

Rodzaje czynników środowiskowych uszkadzających żywe komórki:

KARCYNOGEN

- wywołuje nowotworzenie- transformację neoplastyczną

komórek eukariotycznych

KLASTROGEN

- powoduje fragmentowanie chromosomów

MUTAGEN

- powoduje mutacje

MUTAGEN

- powoduje mutacje

PROMOTOR NOWOTWORU

- powoduje rozwój nowotworu

TERATOGEN

- powoduje zaburzenia w rozwoju

Według: Twyman (1998)

Mutageny

to czynniki fizyczne lub chemiczne, które powodują mutacje.

Mutageny chemiczne:

-

Analogi zasad

- np. 5-bromouracyl (analog tyminy, przeważa forma

enolowa tworząca parę z G zamiast A) lub
2-aminopuryna (analog adeniny, przeważa forma
iminowa tworząca parę z C zamiast T)

-

Czynniki deaminujące

- tj. kwas azotowy deaminujący adeninę,

cytozynę i guaninę, lub dwusiarczan sodowy
działający na cytozynę.

działający na cytozynę.

-

Czynniki alkilujące

- np. metanosulfonian etylowy (EMS), dodają grupy

alkilowe do nukleotydów w cząsteczkach DNA.
Efekt zależy od pozycji w jakiej zostanie
zmodyfikowany nukleotyd jak i od rodzaju
dodanej grupy alkilowej.

-

Czynniki interkalujące

- np. bromek etydyny, mogą wsuwać się

pomiędzy pary zasad w podwójnej helisie,
zwiększając odległość między nimi (mutacje
typu insercji).

5-Bromouracyl

Tworzenie par komplementarnych przez 5-bromouracyl

5-bromouracyl

tautomer ketonowy

Adenina

5-bromouracyl

tautomer enolowy

Guanina

Właściwości mutagenne 5-bromouracylu

insercja
5-bromouracylu

przemiana

tautomeryczna

zmutowana cząsteczka

powrót do tautomeru ketonowego

Czynniki deaminujące i błędne parowanie.

Deaminacja

Adenina

Hipoksantyna

Hipoksantyna tworzy parę z C zamiast T.

Bromek etydyny i działanie.

Bromek etydyny

Efekt mutagenny

EtBr

Mutageny fizyczne:

-

Promieniowanie nadfioletowe (UV)

- indukuje dimeryzację

sąsiadujących ze sobą zasad pirymidynowych,
zwłaszcza tymin.

-

Promieniowanie jonizujące

- (np. promieniowanie X czy

γ

) w zależności

od rodzaju i natężenia wywierać może
mutacje punktowe, delecje lub insercje.
Może działać bezpośrednio na DNA lub
pośrednio uczestnicząc w tworzeniu

pośrednio uczestnicząc w tworzeniu
aktywnych cząsteczek jak nadtlenki.

-

Ciepło

- w obecności wody stymuluje odłączenie zasady (zazwyczaj

purynowej) od grupy cukrowej, co prowadzi do powstania luki,
która rzadko ale może być wypełniona błędnym nukleotydem.

Naprawa DNA

Kategorie systemów naprawy:

1)

Systemy naprawy bezpośredniej

- działają na uszkodzone nukleotydy

przywracając oryginalną strukturę.

2)

Naprawa z wycinaniem zasad

- usunięcie uszkodzonej zasady

azotowej, wycięcie krótkiego fragmentu wokół i ponowna synteza przez
polimerazę DNA.

polimerazę DNA.

3)

Naprawa z wycinaniem nukleotydów

- podobnie jak w poprzednim

przypadku z tym, że rozpoczęte wycięciem całego nukleotydu.

4)

Naprawa niedopasowanych nukleotydów

- wycięcie fragmentu

jednoniciowego DNA z niewłaściwym nukleotydem i wypełnienie luki.

5)

Naprawa rekombinacyjna

- wykorzystana do naprawy dwuniciowych

przerw DNA.

1) Systemy naprawy bezpośredniej

- pęknięcia (spowodowane np. przez promieniowanie jonizujące) mogą być
naprawiane przez ligazę DNA;

ligaza może działać gdy przerwane jest

wiązanie fosfodiestrowe bez uszkodzenia grupy 3’-hydroksylowej i 5’-
fosforanowe

- niektóre formy uszkodzenia przez alkilację są odwracalne dzięki
aktywności enzymów tj. alkilotransferaza usuwająca grupy alkilowe z
O

6

-alkiloguaniny;

-

fotoreaktywacja

- to proces naprawy dimerów cyklobutylowych,

zależny od światła, prowadzony przez enzym

fotoliazę DNA

;

2) Wycinanie zasad

-

glikozydaza DNA

przecina wiązanie

β

-N-glikozydowe

- zasada jest usuwana i powstaje tzw.

miejsce AP

- zasada jest usuwana i powstaje tzw.

miejsce AP

-

endonukleaza AP

przecina DNA w tych miejscach, a dzięki aktywności

egzonukleazowej może poszerzyć przerwę do luki

- wypełnienie brakującego fragmentu przez polimerazę DNA

- przywrócenie ciągłości poprzez działanie ligazy DNA,

Usuwanie uszkodzonej zasady przez glikozydazę DNA

DNA
glikozydaza

Uszkodzona
zasada jest
odcinana

Schemat szlaku

Uszkodzony nukleotyd

miejsce AP

DNA glikozydaza

endonukleaza AP, prawdo-
podobnie z fosfodiesterazą

jednonukleotydowa luka

polimeraza DNA +
ligaza DNA

3) Naprawa z wycinaniem nukleotydów

Endonukleaza przecina precyzyjnie nić DNA po obu stronach
uszkodzenia w miejscach oddalonych o określoną liczbę nukleotydów.
Uszkodzony fragment jest usuwany i odtwarzany jak w poprzednim
przypadku na matrycy drugiej nici.

Przykładem kompleksu zaangażowanego w ten proces naprawy jest

Przykładem kompleksu zaangażowanego w ten proces naprawy jest

endonukleaza UvrABC.

U

Eucaryota

naprawa przez wycinanie sprzężona jest z transkrypcją

dzięki czemu nici genów służące jako matryca do syntezy RNA są
naprawiane szybciej niż rejony nie ulegające transkrypcji.

Miejsce
cięcia

Obszar stopiony

Uszkodzony nukleotyd
zniekształca helisę

Wycięcie uszkodzonego obszaru

Polimeraza DNA + ligaza DNA

4) Naprawa niedopasowanych nukleotydów

- rozpoznanie braku komplementarności pomiędzy nicią

matrycową a potomną.

- fragment nici potomnej musi być wycięty i zsyntetyzowany na nowo

System naprawczy musi rozróżnić te nici. U

E.coli

umożliwia to fakt iż

nić potomna jest słabiej zmetylowana w stosunku do nici matrycowej.
Proces metylacji na nici potomnej jest opóźniony w stosunku do
replikacji, co daje czas systemowi naprawczemu na wyszukiwanie
niedopasowanych nukleotydów i wprowadzenie poprawek.

niedopasowanie w cząsteczce potomnej

przyłączenie MutH i MutS

grupa metylowa

MutH nacina DNA

odłączenie i usunięcie nici

odłączenie i usunięcie nici

egzonukleaza

helikaza DNA II

polimeraza DNA + ligaza DNA