REPLIKACJA, NAPRAWA i REKOMBINACJA DNA
1) Replikacja DNA
2) Replikacja całych chromosomów
3) Replikacja telomerów
3) Replikacja telomerów
4) Naprawa DNA przy jego syntezie
5) Naprawa DNA poza jego syntez
ą
6) Naprawa DNA – system SOS
7) Rekombinacja homologiczna DNA
1) Replikacja DNA – konieczno
ść
odsłoni
ę
cia jednoniciowego DNA
Rozdzielenie podwójnej nici powoduje odsłoni
ę
cie ‘lepkich’
pojedynczych nici, które maja tendencj
ę
do ponownego ł
ą
czenia si
ę
.
Zapobiegaj
ą
temu białka SSBs (single strand binding).
1) Replikacja DNA – inna przeszkod
ą
jest skr
ę
cenie helisy
Ni
ć
helisy jest skr
ę
cona i to skr
ę
cenie si
ę
nasila w miar
ę
przesuwania si
ę
kompleksu replikacyjnego. Rozwi
ą
zaniem jest działanie topoizomerazy,
która nacina jedn
ą
z nici, przepuszcza drug
ą
przez powstał
ą
przerw
ę
i
doprowadza do powtórnego zł
ą
czenia.
1) Replikacja – jeszcze inny problem, przeciwbie
ż
no
ść
nici DNA
Kopiowanie musi przebiega
ć
w jednym kierunku podwójnej nici DNA
(od 5’ do 3’ nowej nici), ale nici stare s
ą
przeciwbie
ż
ne
1) Replikacja DNA
– rozwi
ą
zaniem jest
„normalna” replikacja w
przypadku nici “wiod
ą
cej” i
odcinkowa replikacja
(fragmenty Okazaki)
“spó
ź
niaj
ą
cej si
ę
” nici DNA
“spó
ź
niaj
ą
cej si
ę
” nici DNA
(polimeraza RNA mo
ż
e
syntetyzowa
ć
krótkie odcinki
na pojedynczej nici DNA,
polimeraza DNA mo
ż
e wtedy
zacz
ąć
od nici podwójnej)
1) Replikacja DNA
- helikaza – rozdziela star
ą
podwójn
ą
ni
ć
DNA
- polimeraza DNA –dokłada komplementarne zasady do starej nici DNA
- topoizomeraza – likwiduje napr
ęż
enia powstaj
ą
ce
- primaza RNA – tworzy krótkie komplementarne odcinki RNA
- ligaza DNA – ł
ą
czy fragmenty Okazaki w ci
ą
gł
ą
now
ą
ni
ć
2) Replikacja chromosomu bakteryjnego
- chromosomy bakterii (a tak
ż
e plazmidy i koliste genomy wirusów) maj
ą
jeden pocz
ą
tek replikacji
eukarionty
2) Replikacja chromosomu eukariotycznego
U organizmów eukariotycznych wyst
ę
puje wiele pocz
ą
tków replikacji w
ka
ż
dym z chromosomów
3) Replikacja telomerów
Przy replikacji liniowych chromosomów eukariontów na ostatnim fragmencie
nici opó
ź
niaj
ą
cej si
ę
(lagging) nie mo
ż
na utworzy
ć
starteru RNA i dlatego ta
ni
ć
skracałaby si
ę
o ten fragment po replikacji.
3) Replikacja telomerów
Okazuje si
ę
,
ż
e w ko
ń
cowych
odcinkach chromosomu jest po
kilkuset kopii sekwencji 5’-
TTAGGG-3’.
Jest to wynik działania telomerazy,
enzymu maj
ą
cego za zadanie
enzymu maj
ą
cego za zadanie
wydłu
ż
anie skracaj
ą
cego si
ę
ko
ń
ca
chromosmu.
To białko o aktywno
ś
ci odwrotnej
transkryptazy, które ma własn
ą
matryc
ę
RNA.
3) Telomery a starzenie si
ę
komórek
Telomeraza jest aktywna w
komórkach linii generatywnej i
komórkach progenitorowych
(stem cells). W tkankach
normalnie nie działa.
normalnie nie działa.
Dlatego tam telomery si
ę
skracaj
ą
i jest to zegar starzenia
si
ę
. Po odliczonej liczbie
podziałów, zwykle
kilkudziesi
ę
ciu, komórka nie
mo
ż
e si
ę
dalej dzieli
ć
.
4) Naprawa DNA przy jego
syntezie
Polimeraza DNA działa tak by
nie popełnia
ć
bł
ę
dów. Selekcja
nukleotydów jest imponuj
ą
co
dokładna, pomyłki wyst
ę
puj
ą
dokładna, pomyłki wyst
ę
puj
ą
raz na 10,000 sparowa
ń
.
4) Naprawa DNA przy jego
syntezie
Je
ś
li polimeraza DNA si
ę
pomyli, to potrafi sama
naprawi
ć
swój bł
ą
d poniewa
ż
jest te
ż
egzonukleaz
ą
Ta forma naprawy nazywana
jest napraw
ą
korekcyjn
ą
(proofreading). Pomyłki
nast
ę
puj
ą
tu około 1/1000.
4) Naprawa DNA tu
ż
po
jego syntezie –
mismatch repair
Tu
ż
po syntezie mo
ż
na
jeszcze rozró
ż
ni
ć
ni
ć
star
ą
od nowe.
U bakterii tylko stara ni
ć
jest zmetylowana (rycina).
U eukariontów
U eukariontów
rozróznianie jest inne i
gorzej poznane.
Mo
ż
na wtedy usuwa
ć
niedopasowania
(mismatches) tylko z
nowej nici.
4) Naprawa DNA tu
ż
po jego
syntezie – mismatch repair –
naprawa niedopasowa
ń
U bakterii dwa białka, MutH i MutS,
skanuj
ą
DNA.
Po natrafieniu na
ź
le sparowane
nukleotydy przywołuj
ą
egzonukleaz
ę
wycinaj
ą
c
ą
fragment nowej nici i
wycinaj
ą
c
ą
fragment nowej nici i
polimeraz
ę
, która zapełnia ubytek.
Białka homologiczne do MutS i MutH
wykrywaj
ą
ce złe sparowania s
ą
tak
ż
e
u eukariontów.
Pozostaje około 1/1000 niesparowa
ń
.
4) Naprawa DNA przy jego syntezie – efekt ł
ą
czny
Badania kultur bakteryjnych w laboratorium wykazały,
ż
e:
- przy dobieraniu nukleotydów tempo bł
ę
du wynosi 1 x 10
-4
- z tego po naprawie korekcyjnej pozostaje 1 x 10
-3
- z tego po naprawie korekcyjnej pozostaje 1 x 10
- z tego po naprawie niedopasowa
ń
pozostaje 1 x 10
-3
Ł
ą
cznie daje to tempo bł
ę
dów zaledwie 1 x 10
-10
na nukleotyd
Tempo mutacji u człowieka na nukleotyd na jeden podział
komórki jest chyba jeszcze troch
ę
ni
ż
sze, około 5 x10
-11
5) Naprawa DNA poza jego syntez
ą
DNA w komórce nie dziel
ą
cej si
ę
mo
ż
e zosta
ć
uszkodzone w pojedynczym
nukleotydzie w taki sposób, który nie wymaga (A) lub wymaga (B) wyci
ę
cia
w starej nici. Niedopasowanie (C) z definicji wymaga wyci
ę
cia. P
ę
kni
ę
cie
obu nici (D) wymaga zł
ą
czenia, co mo
ż
e odbywa
ć
si
ę
bez wzgl
ę
du na
sekwencj
ę
p
ę
kni
ę
tych ko
ń
ców (nonhomologous).
5) Naprawa DNA poza jego syntez
ą
– naprawa bezpo
ś
rednia
Naprawa bezpo
ś
rednia to np. naprawa p
ę
kni
ę
cia (nick) jednej nici DNA
przez ligaz
ę
.
5) Naprawa DNA poza jego syntez
ą
– wyci
ę
cie jednego nukleotydu
Uszkodzona zasada jest odnajdywana przez glikozylaz
ę
DNA i odcinana od cukru.
Nast
ę
pnie cały nukleotyd, ale tylko ten jeden, jest usuwany a potem zapełniany
prawidłowym.
5) Naprawa DNA poza jego syntez
ą
– wyci
ę
cie wielu nukleotydów
Gdy uszkodzenie lub brak sparowania powoduje lokalne zaburzenie struktury
helisy, najpierw nast
ę
puje rozdzielenie nici (melting) przez helikaz
ę
. Potem ni
ć
zawieraj
ą
ca uszkodzenie jest wycinana, polimeraza dobudowuje drug
ą
ni
ć
, a
ligaza ł
ą
czy j
ą
kowalencyjnie.
5) Naprawa DNA poza jego syntez
ą
– ł
ą
czenie ko
ń
ców
Gdy podwójna ni
ć
p
ę
knie
istniej
ą
systemy
szybkiego ł
ą
czenia
wolnych ko
ń
ców.
U eukariontów
U eukariontów
po
ś
redniczy w tym białko
Ku i szereg innych
białek.
W ten sposób zł
ą
czeniu
ulec mog
ą
ko
ń
ce, które
niedawno si
ę
przełamały
lub nie odpowiadaj
ą
ce
sobie (nonhomologous).
6) Naprawa DNA – bakteryjny system SOS
Gdy w czasie replikacji
‘normalna’ polimeraza III
natrafi na zbyt uszkodzone
DNA nie mo
ż
e posuwa
ć
si
ę
dalej.
Wtedy przywoływane s
ą
białka RecA, które pozwalaj
ą
na odł
ą
czenie polimerazy III i
umo
ż
liwiaj
ą
prac
ę
mniej
wymagaj
ą
cej polimerazie V.
Synteza post
ę
puje, ale z
bł
ę
dami.
U eukariontów tak
ż
e istniej
ą
takie ‘ratunkowe’ polimerazy
pomostowe, zdolne do
przej
ś
cia przez uszkodzone
DNA.
Rekombinacja
mi
ę
dzy dwiema
chromatydami z
chromosomów
homologicznych jest
7) Rekombinacja homologiczna
molekularn
ą
podstaw
ą
procesów
- crossing over,
- konwersji genów
- naprawy
dwuniciowych
uszkodze
ń
DNA
Pocz
ą
tkiem
rekombinacji jest
(niekiedy celowe)
przeci
ę
cie obu nici
7) Rekombinacja homologiczna
(A)
przeci
ę
cie obu nici
(A).
Potem ka
ż
da z nici
jest skracana tak by
wystawał koniec 3’ (B)
(B)
Nast
ę
pnie jeden z
ko
ń
ców 3’ dokonuje
inwazji powoduj
ą
c
miejscowe rozej
ś
cie si
ę
w drugiej nici poł
ą
czone
z odszukaniem
sekwencji
7) Rekombinacja homologiczna
(B)
(C)
sekwencji
homologicznej (C). Ten
koniec 3’ ma ju
ż
matryc
ę
.
Rozej
ś
cie przesuwa si
ę
i drugi koniec 3’ zyskuje
matryc
ę
. Oba ko
ń
ce 3’
mog
ą
si
ę
wydłu
ż
a
ć
(D).
(C)
(D)
Po zapełnieniu odcinków
jednoniciowych drug
ą
nici
ą
tworzy si
ę
struktura z
dwóch ró
ż
nych chromatyd
(heterodupleks)
(D)
7) Rekombinacja homologiczna
(heterodupleks)
Poł
ą
czone s
ą
dwoma
przej
ś
cia nici mi
ę
dzy
chromatydami
homologicznymi - Holliday
junctions (E)
(E)
Heterodukpleks musi
by
ć
przeci
ę
ty.
Mo
ż
liwe s
ą
ró
ż
ne
kombinacje ci
ęć
(F)
(E)
7) Rekombinacja homologiczna
Prowadz
ą
one albo
tylko do lokalnej
wymiany materiału
genetycznego
(konwersja genu) lub
do wymiany ramion
chromatyd (cross-
over)
konwersja
cross-over
(F)
Powtórzenie całego szlaku.
Ten proces jest inicjowany
celowo na pocz
ą
tku mejozy
by chromosomy
homologiczne na pewno si
ę
odnalazły.
7) Rekombinacja homologiczna
Jest tak
ż
e u
ż
ywany do
reperacji dwuniciowych
uszkodze
ń
DNA (p
ę
kni
ę
cia,
poł
ą
czenia kowalencyjne)
by zreperowa
ć
poprawnie,
korzystaj
ą
c z sekwencji
innej chromatydy.
