REPLIKACJA, NAPRAWA i REKOMBINACJA DNA

1) Replikacja DNA

2) Replikacja całych chromosomów

3) Replikacja telomerów

3) Replikacja telomerów

4) Naprawa DNA przy jego syntezie

5) Naprawa DNA poza jego syntez

ą

6) Naprawa DNA – system SOS

7) Rekombinacja homologiczna DNA

1) Replikacja DNA – konieczno

ść

odsłoni

ę

cia jednoniciowego DNA

Rozdzielenie podwójnej nici powoduje odsłoni

ę

cie ‘lepkich’

pojedynczych nici, które maja tendencj

ę

do ponownego ł

ą

czenia si

ę

.

Zapobiegaj

ą

temu białka SSBs (single strand binding).

1) Replikacja DNA – inna przeszkod

ą

jest skr

ę

cenie helisy

Ni

ć

helisy jest skr

ę

cona i to skr

ę

cenie si

ę

nasila w miar

ę

przesuwania si

ę

kompleksu replikacyjnego. Rozwi

ą

zaniem jest działanie topoizomerazy,

która nacina jedn

ą

z nici, przepuszcza drug

ą

przez powstał

ą

przerw

ę

i

doprowadza do powtórnego zł

ą

czenia.

1) Replikacja – jeszcze inny problem, przeciwbie

ż

no

ść

nici DNA

Kopiowanie musi przebiega

ć

w jednym kierunku podwójnej nici DNA

(od 5’ do 3’ nowej nici), ale nici stare s

ą

przeciwbie

ż

ne

1) Replikacja DNA

– rozwi

ą

zaniem jest

„normalna” replikacja w
przypadku nici “wiod

ą

cej” i

odcinkowa replikacja
(fragmenty Okazaki)
“spó

ź

niaj

ą

cej si

ę

” nici DNA

“spó

ź

niaj

ą

cej si

ę

” nici DNA

(polimeraza RNA mo

ż

e

syntetyzowa

ć

krótkie odcinki

na pojedynczej nici DNA,
polimeraza DNA mo

ż

e wtedy

zacz

ąć

od nici podwójnej)

1) Replikacja DNA

- helikaza – rozdziela star

ą

podwójn

ą

ni

ć

DNA

- polimeraza DNA –dokłada komplementarne zasady do starej nici DNA
- topoizomeraza – likwiduje napr

ęż

enia powstaj

ą

ce

- primaza RNA – tworzy krótkie komplementarne odcinki RNA
- ligaza DNA – ł

ą

czy fragmenty Okazaki w ci

ą

gł

ą

now

ą

ni

ć

2) Replikacja chromosomu bakteryjnego

- chromosomy bakterii (a tak

ż

e plazmidy i koliste genomy wirusów) maj

ą

jeden pocz

ą

tek replikacji

eukarionty

2) Replikacja chromosomu eukariotycznego

U organizmów eukariotycznych wyst

ę

puje wiele pocz

ą

tków replikacji w

ka

ż

dym z chromosomów

3) Replikacja telomerów

Przy replikacji liniowych chromosomów eukariontów na ostatnim fragmencie
nici opó

ź

niaj

ą

cej si

ę

(lagging) nie mo

ż

na utworzy

ć

starteru RNA i dlatego ta

ni

ć

skracałaby si

ę

o ten fragment po replikacji.

3) Replikacja telomerów

Okazuje si

ę

,

ż

e w ko

ń

cowych

odcinkach chromosomu jest po
kilkuset kopii sekwencji 5’-
TTAGGG-3’.

Jest to wynik działania telomerazy,
enzymu maj

ą

cego za zadanie

enzymu maj

ą

cego za zadanie

wydłu

ż

anie skracaj

ą

cego si

ę

ko

ń

ca

chromosmu.

To białko o aktywno

ś

ci odwrotnej

transkryptazy, które ma własn

ą

matryc

ę

RNA.

3) Telomery a starzenie si

ę

komórek

Telomeraza jest aktywna w
komórkach linii generatywnej i
komórkach progenitorowych
(stem cells). W tkankach
normalnie nie działa.

normalnie nie działa.

Dlatego tam telomery si

ę

skracaj

ą

i jest to zegar starzenia

si

ę

. Po odliczonej liczbie

podziałów, zwykle
kilkudziesi

ę

ciu, komórka nie

mo

ż

e si

ę

dalej dzieli

ć

.

4) Naprawa DNA przy jego
syntezie

Polimeraza DNA działa tak by
nie popełnia

ć

bł

ę

dów. Selekcja

nukleotydów jest imponuj

ą

co

dokładna, pomyłki wyst

ę

puj

ą

dokładna, pomyłki wyst

ę

puj

ą

raz na 10,000 sparowa

ń

.

4) Naprawa DNA przy jego

syntezie

Je

ś

li polimeraza DNA si

ę

pomyli, to potrafi sama
naprawi

ć

swój bł

ą

d poniewa

ż

jest te

ż

egzonukleaz

ą

Ta forma naprawy nazywana
jest napraw

ą

korekcyjn

ą

(proofreading). Pomyłki
nast

ę

puj

ą

tu około 1/1000.

4) Naprawa DNA tu

ż

po

jego syntezie –
mismatch repair

Tu

ż

po syntezie mo

ż

na

jeszcze rozró

ż

ni

ć

ni

ć

star

ą

od nowe.

U bakterii tylko stara ni

ć

jest zmetylowana (rycina).
U eukariontów

U eukariontów
rozróznianie jest inne i
gorzej poznane.

Mo

ż

na wtedy usuwa

ć

niedopasowania
(mismatches) tylko z
nowej nici.

4) Naprawa DNA tu

ż

po jego

syntezie – mismatch repair –
naprawa niedopasowa

ń

U bakterii dwa białka, MutH i MutS,
skanuj

ą

DNA.

Po natrafieniu na

ź

le sparowane

nukleotydy przywołuj

ą

egzonukleaz

ę

wycinaj

ą

c

ą

fragment nowej nici i

wycinaj

ą

c

ą

fragment nowej nici i

polimeraz

ę

, która zapełnia ubytek.

Białka homologiczne do MutS i MutH
wykrywaj

ą

ce złe sparowania s

ą

tak

ż

e

u eukariontów.

Pozostaje około 1/1000 niesparowa

ń

.

4) Naprawa DNA przy jego syntezie – efekt ł

ą

czny

Badania kultur bakteryjnych w laboratorium wykazały,

ż

e:

- przy dobieraniu nukleotydów tempo bł

ę

du wynosi 1 x 10

-4

- z tego po naprawie korekcyjnej pozostaje 1 x 10

-3

- z tego po naprawie korekcyjnej pozostaje 1 x 10

- z tego po naprawie niedopasowa

ń

pozostaje 1 x 10

-3

Ł

ą

cznie daje to tempo bł

ę

dów zaledwie 1 x 10

-10

na nukleotyd

Tempo mutacji u człowieka na nukleotyd na jeden podział
komórki jest chyba jeszcze troch

ę

ni

ż

sze, około 5 x10

-11

5) Naprawa DNA poza jego syntez

ą

DNA w komórce nie dziel

ą

cej si

ę

mo

ż

e zosta

ć

uszkodzone w pojedynczym

nukleotydzie w taki sposób, który nie wymaga (A) lub wymaga (B) wyci

ę

cia

w starej nici. Niedopasowanie (C) z definicji wymaga wyci

ę

cia. P

ę

kni

ę

cie

obu nici (D) wymaga zł

ą

czenia, co mo

ż

e odbywa

ć

si

ę

bez wzgl

ę

du na

sekwencj

ę

p

ę

kni

ę

tych ko

ń

ców (nonhomologous).

5) Naprawa DNA poza jego syntez

ą

– naprawa bezpo

ś

rednia

Naprawa bezpo

ś

rednia to np. naprawa p

ę

kni

ę

cia (nick) jednej nici DNA

przez ligaz

ę

.

5) Naprawa DNA poza jego syntez

ą

– wyci

ę

cie jednego nukleotydu

Uszkodzona zasada jest odnajdywana przez glikozylaz

ę

DNA i odcinana od cukru.

Nast

ę

pnie cały nukleotyd, ale tylko ten jeden, jest usuwany a potem zapełniany

prawidłowym.

5) Naprawa DNA poza jego syntez

ą

– wyci

ę

cie wielu nukleotydów

Gdy uszkodzenie lub brak sparowania powoduje lokalne zaburzenie struktury
helisy, najpierw nast

ę

puje rozdzielenie nici (melting) przez helikaz

ę

. Potem ni

ć

zawieraj

ą

ca uszkodzenie jest wycinana, polimeraza dobudowuje drug

ą

ni

ć

, a

ligaza ł

ą

czy j

ą

kowalencyjnie.

5) Naprawa DNA poza jego syntez

ą

– ł

ą

czenie ko

ń

ców

Gdy podwójna ni

ć

p

ę

knie

istniej

ą

systemy

szybkiego ł

ą

czenia

wolnych ko

ń

ców.

U eukariontów

U eukariontów
po

ś

redniczy w tym białko

Ku i szereg innych
białek.

W ten sposób zł

ą

czeniu

ulec mog

ą

ko

ń

ce, które

niedawno si

ę

przełamały

lub nie odpowiadaj

ą

ce

sobie (nonhomologous).

6) Naprawa DNA – bakteryjny system SOS

Gdy w czasie replikacji
‘normalna’ polimeraza III
natrafi na zbyt uszkodzone
DNA nie mo

ż

e posuwa

ć

si

ę

dalej.

Wtedy przywoływane s

ą

białka RecA, które pozwalaj

ą

na odł

ą

czenie polimerazy III i

umo

ż

liwiaj

ą

prac

ę

mniej

wymagaj

ą

cej polimerazie V.

Synteza post

ę

puje, ale z

bł

ę

dami.

U eukariontów tak

ż

e istniej

ą

takie ‘ratunkowe’ polimerazy
pomostowe, zdolne do
przej

ś

cia przez uszkodzone

DNA.

Rekombinacja
mi

ę

dzy dwiema

chromatydami z
chromosomów
homologicznych jest

7) Rekombinacja homologiczna

molekularn

ą

podstaw

ą

procesów

- crossing over,

- konwersji genów

- naprawy
dwuniciowych
uszkodze

ń

DNA

Pocz

ą

tkiem

rekombinacji jest
(niekiedy celowe)
przeci

ę

cie obu nici

7) Rekombinacja homologiczna

(A)

przeci

ę

cie obu nici

(A).

Potem ka

ż

da z nici

jest skracana tak by
wystawał koniec 3’ (B)

(B)

Nast

ę

pnie jeden z

ko

ń

ców 3’ dokonuje

inwazji powoduj

ą

c

miejscowe rozej

ś

cie si

ę

w drugiej nici poł

ą

czone

z odszukaniem
sekwencji

7) Rekombinacja homologiczna

(B)

(C)

sekwencji
homologicznej (C). Ten
koniec 3’ ma ju

ż

matryc

ę

.

Rozej

ś

cie przesuwa si

ę

i drugi koniec 3’ zyskuje
matryc

ę

. Oba ko

ń

ce 3’

mog

ą

si

ę

wydłu

ż

a

ć

(D).

(C)

(D)

Po zapełnieniu odcinków
jednoniciowych drug

ą

nici

ą

tworzy si

ę

struktura z

dwóch ró

ż

nych chromatyd

(heterodupleks)

(D)

7) Rekombinacja homologiczna

(heterodupleks)

Poł

ą

czone s

ą

dwoma

przej

ś

cia nici mi

ę

dzy

chromatydami
homologicznymi - Holliday
junctions (E)

(E)

Heterodukpleks musi
by

ć

przeci

ę

ty.

Mo

ż

liwe s

ą

ró

ż

ne

kombinacje ci

ęć

(F)

(E)

7) Rekombinacja homologiczna

Prowadz

ą

one albo

tylko do lokalnej
wymiany materiału
genetycznego
(konwersja genu) lub
do wymiany ramion
chromatyd (cross-
over)

konwersja

cross-over

(F)

Powtórzenie całego szlaku.

Ten proces jest inicjowany
celowo na pocz

ą

tku mejozy

by chromosomy
homologiczne na pewno si

ę

odnalazły.

7) Rekombinacja homologiczna

Jest tak

ż

e u

ż

ywany do

reperacji dwuniciowych
uszkodze

ń

DNA (p

ę

kni

ę

cia,

poł

ą

czenia kowalencyjne)

by zreperowa

ć

poprawnie,

korzystaj

ą

c z sekwencji

innej chromatydy.