Replikacja DNA
• Składa się z 4 rodzajów zasad przyłączonych do
rdzenia cukrowo fosforanowego
• Jest polimerem zbudowanym z jednostek
monomerycznych - deoksyrybonukleotydów
• nukleotyd składa się z zasady azotowej, cukru
oraz z jednej lub więcej grup fosforanowych
• Cukrem jest deoksyryboza
• Zasadami azotowymi – pochodne puryny i
pirymidyny
puryna
pirymidyna
Puryna i jej pochodne
adenina
guanina
Pirymidyna i jej pochodne
tymina cytozyna uracyl
• Łańcuch DNA składa się z
deoksyrybonukleotydów
(dAMP, dGMP, dTMP, dCMP).
Połączone są one resztami
fosforanowymi. Grupa 3'-
hydroksylowa reszty
cukrowej jednego nukleotydu
połączona jest z grupą 5'-
hydroksylową następnej
reszty cukrowej wiązaniem
fosfodiestrowym.
• Sekwencja nukleotydów w
łańcuchu kwasu
nukleinowego opisywana jest
zazwyczaj za pomocą
skrótów jednoliterowych np.:
A-T-G-C-T-A-C-A-G
• Łańcuch DNA
wykazuje
polarność
• Kolejność zasad
zapisywana w
kierunku 5’->3’
Model Watsona i Cricka:
• W skład cząsteczki DNA wchodzą
dwa łańcuchy, które biegną
antyrównolegle (tzn. koniec
jednego jest dokładnie naprzeciw
początku drugiego). Łańcuchy
owijają się wokół wspólnej osi i
tworzą tzw. prawoskrętną
podwójną helisę.
• Jeden z łańcuchów-kolor
zielony, drugi-
pomarańczowy; zasady
purynowe i pirymidynowe
mniej intensywne barwy
niż rdzeń cukrowo-
fosforanowy.
Rodzaj DNA/Funkcja
B-DNA
A-DNA
Z-DNA
liczba par zasad
przypadająca na skręt
helisy
10,4 (ok. 10,2 dla
tzw. wysp CpG)
11
12
kąt skręcania między
sąsiednimi
parami zasad (w
stopniach)
+ 34,6
+ 32,7
- 30,0
skok helisy (w nm)
3,54
2,53
4,56
kierunek skręcania
prawoskrętna
prawoskrętn
a
lewoskrętn
a
średnica helisy (w nm)
2,37
2,55
1,84
Rodzaje DNA i ich charakterystyka
Model Watsona i Cricka:
• Zasady azotowe znajdują się wewnątrz, a fosforany i
reszty deoksyrybozy-na zewnątrz helisy; płaszczyzny
zasad są prostopadłe do osi helisy, a płaszczyzny
pierścieni cukrów są ułożone prostopadle względem
zasad;
• Średnica helisy wynosi 2,0 nm. Odległość między
zasadami wynosi 0,34nm. Zasady są skręcone względem
siebie pod kątem 36 stopni;
• Dwa łańcuchy łączą się ze sobą wiązaniami wodorowymi
między zasadami tworzącymi komplementarne pary;
• Kolejność zasad nie jest w żaden sposób ograniczona.
Ściśle określona sekwencja zasad niesie informację
genetyczną.
Typ wiązań
- wodorowe – wyst. między
zasadami
- fosfodiestrowe – łączy
nukleotydy
- N-glikozydowe – cząsteczki
cukru z zasadą azotową
Nukleosom
• Kompleks - składający się z DNA jądrowego owiniętego wokół 4 par niewielkich
zasadowych białek-histonów (piąty rodzaj histonu wiąże wolne odcinki DNA pomiędzy
nukleosomami)
• podstawowa jednostka strukturalna fibryli chromatynowej
Fibryle chromatyny zwinięte są w spiralą strukturę zwaną solenoidem.
Chromatyna – między podziałowa postać materiału gen. u organizmów eukariotycznych
w jądrze kom.
U eukariontów DNA występuje w kompleksie
zwanym chromatyną
• Replikacja zapewnia wierne przekazywanie
informacji zawartej w DNA, zarówno z
komórki macierzystej do komórek
potomnych w mitozie, jak i z jednego
pokolenia na kolejne w procesie mejozy;
• Błędy zachodzące podczas replikacji
umożliwiają zachodzenie procesu ewolucji
• Częstotliwość błędów: jeden na około 10
000 000 zasad do jednego na 1 000 000
000 zasad.
Podwójna nić ulega
skopiowaniu;
Replikacja jest
semikonserwatywna
(półzachowawcza) - w
każdej z dwóch uzyskanych
podwójnych nici DNA będzie
jedna nić nowa i jedna
macierzysta
Zasada replikacji DNA
Replikacja DNA jest elementem cyklu komórkowego
Replikacja DNA
enzymy uczestniczące w procesie
topoizomerazy
– rozplatają podwójną helisę DNA, udostępniając w
ten sposób matrycę dla enzymów replikacyjnych lub
transkrypcyjnych. topoizomeraza I - hydroliza jednego wiązania -
nacięcie jednej nici,
topoizomerazy II - hydroliza dwóch wiązań - nacięcie obu nici
,
,
helikazy
- rozrywają wiązania wodorowe między nićmi
matrycowego DNA, rozkręcając helisę i umożliwiając rozpoczęcie
procesu;
prymaza – polimeraza RNA zależna od DNA, syntetyzuje startery
rybonukleotydowe;
polimeraza
DNA
DNA
- polimeryzuje zgodnie z zasadą
komplementarności fosforany deoksyrybonukleotydów;
egzonukleaza - usuwa startery RNA z nici;
ligaza DNA – łączy fragmenty Okazaki;
białko SSB
(ang. single strand binding protein) stabilizuje
jednoniciowe (rozplecione) odcinki DNA
białko "ruchomej obręczy"
wiąże polimerazę DNA z nicią DNA.
Na nici opóźnionej, każdorazowo po zakończeniu syntezy fragmentu
Okazaki uwalnia polimerazę DNA.
• najważniejszy enzym replikacji DNA.
• Ma aktywność syntetazy w kierunku 5' -- >3' nowej nici tzn.
dobudowuje nukleotydy DNA w tym kierunku.
• Jednocześnie posiada aktywność nukleazy w kierunku 3' --
>5', dzięki czemu może cofać się i wycinać źle wstawiony
przez siebie nukleotyd i zastąpić go prawidłowym. Dzięki tej
aktywności polimeraza DNA koryguje swoje błędy co
nazywa się redagowaniem.
• Dobudowuje brakujące fragmenty DNA, na nici opóźnionej,
po wycięciu starterów RNA
Polimeraza DNA
Replikacja DNA
• Zaczyna się zawsze w konkretnych miejscach, zwanych
miejscami inicjacji replikacji (ang. origin)
• Od tego miejsca replikacja zazwyczaj przebiega
równocześnie w dwóch kierunkach-widełki replikacyjne
przesuwają się w prawo i lewo, aż połączą się wszystkie
oczka replikacyjne.
ORI (Origins of replication)
Specyficzna sekwencja 200 pz jest minimalną sekwencja wymaganą
do inicjacji replikacji chromosomowego DNA.
U ssaków inicjacja (ORI) obejmuje sekwencję 10 000 pz
U roślin sekwencje ORI nie są zidentyfikowane
W chromosomach istnieje wiele potencjalnych ORI, ale nie
wszystkie funkcjonują w każdej komórce
Fragment DNA replikowany z jednego ORI nosi nazwę replikonu ( u
roślin długość replikonu to przeciętnie 50-70 kb)
Nie wszystkie ORI startują w tym samym momencie, jednak
porządek ich uruchamiania jest w komórkach ściśle kontrolowany i
zależy od stanu kondensacji chromatyny w danym miejscu.
Inicjacja
(replikacja zaczyna się jednocześnie w wielu
miejscach)
Bańki replikacyjne
Miejsca startu replikacji
I etap - Inicjacja
I etap - Inicjacja
• replikacja rozpoczyna się w ściśle określonym miejscu, które
nazywa się origin (ori) lub (O) – specjalny odcinek o
specyficznej sekwencji nukleotydów (200-300par) (u
prokariotów 1 takie miejsce, u eukariontów wiele nawet kilka
tysięcy)
• w miejscach ori nici DNA pod wpływem białka
enzymatycznego
helikazy
rozdzielają się (rozrywanie wiązań
wodorowych) i tworzą tak zwane oczko replikacyjne. Replikacja
przebiega w 2 kierunkach, widełki replikacyjne przesuwaja się
w lewo i w prawo tak długo aż połączą się wszystkie oczka
replikacyjne.
• następnie syntetyzowane są krótkie (do 10 nukleotydów)
odcinki RNA tzw.
startery (primery)
przez enzym prymazę
prymazę
ponieważ enzym
polimeraza DNA
potrafi dobudowywać
trifosforany nukleozydów tylko do już istniejących fragmentów
dwuniciowych.
Kontrola inicjacji
• Licencjonowanie (kontrola pozytywna) –
zapewnia, że
chromosomy będą się replikować tylko wtedy, gdy w sposób
prawidłowy przejdą przez mitozę i znajda się w komórce
potomnej
.
• Aby nastąpiła inicjacja, do ORI musi się przyłączyć
Kompleks Rozpoznający Origin (ORC – Origin Recognition
Complex) i dodatkowe białka (czynniki licencjonujące Cdc-6
i Cdt-1) umożliwiające ścisłe pokrycie sąsiadującego DNA
białkami MCM (Minichromosome Maintenance). Tylko DNA
pokryty białkami MCM może być replikowany. Białka MCM
są usuwane przez przesuwające się widełki replikacyjne.
Licencjonowanie w ORI
Negatywna kontrola inicjacji - Geminina
• Geminina – białko występujące w komórkach w
fazie G2
• Przeciwdziała przyłączaniu się białek MCM do
świeżo zreplikowanego DNA (zablokowanie
czynnika Cdt-1)
• Jest degradowana po zakończeniu mitozy
• Gemininy nie wykryto w drożdżach i roślinach!
Widełki replikacyjne
Przyłączanie deoksyrybonukleotydów przez polimerazę DNA
II – Elongacja
II – Elongacja
• w widełkach replikacyjnych na nici o polarności 3`→5` powstaje
nowa nić o kierunku 5`→3` w sposób ciągły. Powstała nić potomna to
nić wiodąca.
• natomiast na nici 5`→3` syntetyzowane są krótkie (liczące około
kilkuset nukleotydów) odcinki w kierunku 5`→3` odcinki te nazwano
fragmentami Okazaki. Syntetyzowana nić to nić opóźniona.
III – Terminacja
III – Terminacja
• Zachodzi gdy z wszystkich widełek replikacyjnych zostają usunięte
startery (przez odpowiednie nukleazy). Polimeraza
Polimeraza
uzupełnia
brakujące odcinki DNA, a ligaza
ligaza
łączy fragmenty nici DNA.
• Następuje odłączenie kompleksu od nici DNA. Błędy replikacyjne
wyłapuje i naprawia polimeraza DNA
polimeraza DNA
. (replikacja DNA z
uwzględnieniem systemu korekty = 1 błędnie wstawiony nukleotyd
na miliard 1 000 000 000)
Telomery – końcowe odcinki DNA. Przy każdym podziale skracają się,
jak już skrócą się maksymalnie komórka przestaje się dzielić
Telomeraza
Telomeraza
– enzym który wydłuża telomery przez co komórki mogą
się ciągle dzielić.
Aktywność telomerazowa -replikacja końców
chromosomów (telomerów)
Szybkość replikacji
• Bakteria 1000pz/ sek
• Człowiek 100pz/ sek
Czas trwania replikacji całego DNA:
• Bakteria 40 min
• Komórki człowieka 6-12 godz.
Dokładność replikacji
• 1 błąd /miliard pz
• Polimeraza DNA wykazuje aktywność
korektorską
Niektórych błędów nie da się skorygować
Liczba kopii powielanego fragmentu wzrasta wykładniczo 2
n
(n-liczba przeprowadzonych cykli powielania)
Zastosowanie reakcji PCR:
1)
diagnostyka chorób dziedzicznych oraz zakażeń
wirusowych i bakteryjnych
2)
modyfikacja powielanej sekwencji poprzez użycie nie
całkiem komplementarnych primerów (tzw.
ukierunkowana mutageneza)
3)
namnażanie DNA ze szczątków ludzi lub organizmów
wymarłych dawno temu
4)
w kryminalistyce do identyfikacji ze śladów
pozostawionych na miejscu przestępstwa
5)
w sądownictwie przy ustalaniu ojcostwa
6)
do ilościowego oznaczania zawartości sekwencji
namnażanej matrycy w próbce