REPLIKACJA, NAPRAWA I REKOMBINACJA DNA

Składająca się z dwóch nici helisa DNA może się powielać, ponieważ po jej rozdziale na dwie pojedyncze nici każda z nich może służyć jako matryca, wg której jest syntetyzowany nowy komplementarny łańcuch DNA. Jednym z najgroźniejszych uszkodzeń DNA jest lokalne pęknięcie obu nici helisy, wtedy żadna nie zawiera pełnej informacji genetycznej i nie może być prawidłową matrycą do syntezy DNA. Mechanizm naprawy takich uszkodzeń opiera się na rekombinacji DNA, wtedy dochodzi do przetasowania sekwencji leżących na dwóch różnych cząsteczkach. Rekombinacja jest również niezbędna w tworzeniu genetycznej różnorodności w czasie podziałów mejotycznych. Jest też odpowiedzialna za generowanie zróżnicowanego zestawu genów kodujących najważniejsze cząsteczki systemu immunologicznego.

28.1 DNA może przyjmować różnorodne formy strukturalne

Najważniejsze cechy modelu Watsona i Cricka:

1. Dwa łańcuchy polinukleotydowe biegnące w przeciwnych kierunkach są owinięte wokół jednej osi i tworzą prawoskrętną helisę.

2. Zasady purynowe i pirymidynowe są wewnątrz helisy, deoksyrybozy i fosforany na zewnątrz cząsteczki DNA.

3. Adenina - Tymina, Guanina - Cytozyna, Para A-T jest połączona dwoma wiązaniami wodorowymi, G-C - trzema.

Helisa typu A jest szersza i krótsza niż helisa typu B

Mamy helisę typu B-DNA, to ta którą odkryli Watson i Crick,a potem odkryli jeszcze helisę A-DNA, która powstaje gdy jej względne uwodnienie wynosi 75%, jest też dwuniciowa i prawoskrętna, jak B-DNA, ale jest szersza i krótsza, a pary zasad są odchylone od położenia prostopadłego względem osi cząsteczki. Zobaczcie sobie str. 789 widok z boku, widok z góry rys. 28.3, skąd to się bierze? Między helisami typu A i B jest różna konformacja reszt deoksyrybozowych. Atom węgla C-3 deoksyrybozy w A-DNA jest poza płaszczyzna tworzoną przez cztery pozostałe atomy pierścienia furanozowego (konformacja C-3’-endo). W przypadku deoksyrybozy w B-DNA, poza płaszczyzną jest atom węgla C-2’ (konformacja C-2’-endo). Występowanie deoksyrybozy o konformacji C-3’-endo w helisie typu A prowadzi do odchylenia par zasad od położenia prostopadłego względem osi cząsteczki o 11 stopni. Grupy fosforanowe helisy typu A wiążą o kilka cząsteczek wody mniej niż w B-DNA.

Tutaj mamy pare wizualizacji:

http://bcs.whfreeman.com/biochem6/content/cat_020/viewer.html?id=188&

http://bcs.whfreeman.com/biochem6/content/cat_020/viewer.html?id=187&

http://bcs.whfreeman.com/biochem6/content/cat_020/viewer.html?id=189& forma B-DNA

http://bcs.whfreeman.com/biochem6/content/cat_020/viewer.html?id=190& forma A-DNA

DNA w komórce to najczęściej B-DNA, ale występowanie struktur typu A nie ogranicza się tylko do odwodnionego DNA. Dwuniciowe rejony RNA i niektóre hybrydowe cząsteczki RNA-DNA przyjmują formę, która strukturalnie przypomina helisę typu A.

Mały i duży rowek są pokryte grupami zdolnymi do tworzenia wiązań wodorowych

W helisie typu B są dwa zagłębienia, duży rowek i mały rowek. Powstaja dlatego, ze wiązania glikozydowe komplementarnych nukleotydów nie leżą dokładnie naprzeciwko siebie. W B-DNA duży rowek jest szerszy i głębszy niz w DNA typu A. Każdy z rowków jest pokryty atomami, które moga być donorami lub akceptorami podczas tworzenia wiązań wodorowych, co daje możliwości specyficznych oddziaływań z białkami.

Jak widać na załączonym obrazku, donory to te na niebiesko, a akceptory to te na czerwono. W MAŁYM ROWKU: Akceptorami wodoru mogą być atomy - N-3 adeniny lub guaniny, oraz atomy tlenu związane z atomem C-2 tyminy lub cytozyny, donorem może być grupa aminowa guaniny związana z C-2 (na niebiesko). W DUŻYM ROWKU: akceptory: N-7 guaniny lub adeniny, atomy O przy C-4 tyminy i O przy C-6 guaniny, jako donory: grupy aminowe przyłączone do C-6 adeniny i C-4 cytozyny.

Wyniki badań pojedynczych kryształów DNA ujawniły, że lokalnie cząsteczka DNA może mieć inną strukturę

Ryszard Dickerson sobie zrobił badania na krysztale dodekameru DNA i mu wyszło, że odcinek 12-nukleotydowy róznił się od modelu Watsona i Cricka tym, że nie było konformacyjnie jednolity. Kąty skręcenia pomiędzy sąsiadującymi w łańcuchu zasadami wynosiły od 28 do 42 stopni. Także pierścienie zasad należących do jednej pary nie leżały w jednej płaszczyźnie. Były skręcone względem siebie jak łopaty śmigła. Śmigłowe skręcenie zasad wzmacnia asocjację warstwową między zasadami jednej nici.

Z-DNA jest lewoskrętną dwuniciową helisą, której szkielet cukrowo-fosforanowy tworzy zygzakowaty wzór

Trzeci typ DNA odkrył Aleksander Tich jak badał odcinek o sekwencji dCGCGCG. Helisa ta okazała się lewoskrętna i tworzyła zygzakowaty wzór, więc ją nazwali Z-DNA. Strukturę typu Z przybierają krótkie fragmenty oligonukleotydowe, zbudowane z następujących po sobie na przemian reszt purynowych i pirymidynowych.

28.2 Cząsteczka dwuniciowego DNA może się zwinąć w specjalny sposób, tworząc formy superhelikalne.

Dzięki superhelikalności dwuniciowe helisy DNA mogą tworzyć także struktury trzeciorzędowe. Przeanalizujmy helisę typu B,odcinek 260 pz liczba zasad przypadająca na jeden skręt w cząst. DNA wynosi 10,4, zatem tworzy ona 25 skrętów (260/10,4). Połączmy końce tej helisy i stworzymy zrelaksowany kolisty DNA. Można sobie stworzyć inną helisę, jeśli rozplecie się dwa skręty przed połączeniem końców. DNA może przyjąć dwie konformacje: strukturę tworzącą 23 skręty helisy oraz rozplecioną pętlę nie tworzącą dodatkowych splotów. DNA może także przybrać strukturę superhelikalną, gdzie helisa tworzy 25 regularnych skrętów oraz 2 prawostronne (określane jako ujemne) skręty superhelikalne.

Cząsteczka superhelikalna jest bardziej zwarta niż zrelaksowany (rozluźniony) DNA tej samej długości. W czasie wirowania lub elektroforezy superhelikalny DNA porusza się szybciej niż jego forma zrelaksowana.

Liczba opleceń DNA jest cechą topologiczną określającą stopień skręcenia superhelikalnego

Liczba opleceń - Lk, określa ile razy nić DNA owija się prawoskrętnie wokół osi helisy, sprowadzonej do prostej leżącej na płaszczyźnie. (spójrzta na rycinę 28.9 strona 792)

Cząsteczki różniące się wyłącznie Lk są izomerami topologicznymi (topoizomerami). Zmiana konformacji topoizomerów DNA jest możliwa jedynie przez rozcięcie jednej lub obydwu nici cząsteczki DNA i ponowne ich połączenie.

Tw - liczba skrętów, odzwierciedla helikalne wzajemne skręcenie pojedynczych nici DNA względem siebie. Wr - liczba zwojów, jest miarą zwinięcia osi dwuniciowej helisy. Pojawienie się wartości Wr w cząsteczce powoduje powstanie superhelikalności. Prawoskrętne zwinięcia oznaczają ujemną liczbę (ujemne superskręcenie), a lewoskrętne zwinięcia liczbę dodatnią (dodatnie superskręcenie).

Istnieje zależność między Tk i Wr, w sumie dają nam liczbę opleceń:

Lk = Tw + Wr

Zmniejszenie wartości Lk powoduje zarówno prawostronne (ujemne) superhelikalne skręcenie osi DNA, jak i rozwinięcie helisy DNA. Superhelikalność powoduje kondensację DNA.

Topoizomerazy przygotowują podwójną helisę DNA do rozplecenia

Większość natywnych cząst. DNA występuje w formie superhelikalnej o ujemnych superskrętach. Ujemne superskręty pojawiają się w wyniku częściowego rozplatania helisy DNA. Cząst. w formie superhelikalnej są lepiej przygotowane do procesów transkrypcji i translacji. Dodatnia superhelikalność zwiększa upakowanie DNA, ale utrudnia rozplatanie nici.

Topoizomerazy to enzymy, które usuwają lub wprowadzają superskręty do DNA. Topoizomerazy typu I katalizują relaksację superhelikalnie skręconego DNA - jest to proces termodynamicznie korzystny. Topoizomerazy typu II dodają superskręt w cząsteczce DNA, wykorzystując energię pochodzącą z hydrolizy ATP.

Enzymy te zmieniają w cząsteczce DNA liczbę opleceń - Lk katalizując trzystopniowy proces:

1. przecięcie jednej lub obu nici DNA

2. przeniesienie segmentu DNA przez wytworzoną w ten sposób przerwę,

3. ponowne złączenie rozciętego DNA

Topoizomerazy typu I przecinają w cząst. DNA tylko jedną nić, typu II przecinają obydwie nici DNA.

Topoizomerazy typu I odpowiadają za relaksację struktur superhelikalnych

Mamy tutaj mechanizm działania topoizomerazy I. Topoizomeraza I ma cztery domeny otaczające centralne zagłębienie o średnicy 2 nm, czyli tyle żeby zmieściła się tam helisa dwuniciowa DNA. W zagłębieniu tym znajduje się także reszta tyrozyny (Tyr 723), która działa jako nukleofil w reakcji przecięcia DNA katalizowanej przez topoizomerazę.

Jak zachodzi relaksacja superhelikalnych cząsteczek DNA?

Na początku cząst. DNA wiąże się z wnętrzem zagłębienia topoizomerazy, grupa hydroksylowa Tyr 723 atakuje grupę fosforanową jednej nici DNA i tworzy się wiązanie fosfodiestrowe między enzymem i DNA, rozcinając tym samym DNA i uwalniając wolną grupę hydroksylową 5’. Po rozcięciu nici może się ona obrócić wokół nie przeciętego łańcucha; ruch ten jest możliwy dzięki energii zmagazynowanej w superhelikalnych skrętach. Rotacja DNA usuwa skręty superhelikalne. Enzym kontroluje tempo rotacji i dlatego ich usuwanie nie odbywa się zbyt szybko. Wolna grupa hydroksylowa cząsteczki DNA atakuje następnie resztę fosfotyrozynową, aby połączyć ponownie przerwany uprzednio łańcuch DNA i zregenerować aktywną resztę tyrozynową enzymu. Radzę tam zerknąć w książkę, bo ten mechanizm jest nieco jebnięty :D

Wykorzystując hydrolizę ATP, topoizomerazy typu II potrafią wprowadzać do DNA ujemne skręty superhelikalne

Wprowadzenie skrętów superhelikalnych do DNA wymaga energii, ponieważ forma superhelikalna cechuje się napięciem torsyjnym. Wprowadzenie jednego superhelikalnego skrętu do cząsteczki plazmidu o dł. 3000 pz wymaga 30 kJ/mol.

Za powstawanie skrętów supehelikalnych odpowiadają topoizomerazy typu II. Wiążą i hydrolizują ATP, uwolnioną energię wykorzystują do przeniesienia jednego fragmentu dwuniciowej cząst. DNA nad innym fragmentem, który został czasowo przecięty.

Drożdżowa topoizomeraza typu II jest dimerem z dwoma wewnętrznymi zagłębieniami. Większe z nich ma dwa wejścia (bramki) na górze i na dole. Reakcja katalizowana przez topoizomerazę II rozpoczyna się od związania dwuniciowej helisy (segment G). Nici są położone w pobliżu reszty tyrozynowej należącej do topoizomerazy II. Reszty tyrozynowe są odpowiedzialne za powstanie wiązań kowalencyjnych między enzymem a DNA. Kompleks topoizomeraza/segment G wiąże się słabo z innym fragmentem DNA (segment T). Każdy z monomerów enzymu na domenę wiążącą ATP -> związanie ATP indukuje zmiany konformacyjne w enzymie -> zbliżenie obu domen wiążących ATP, które zamykają segment T w pułapce :p , rozcinają się wtedy również obie nici segmentu G oraz następuje przestrzenne rozsunięcie przeciętych końców helisy DNA. Każda z nici jest “przytrzymywana” przez enzym przez wiązania fosfodiestrowe z dwiema resztami tyrozynowymi. Topoizomerazy typu II w przeciwieństwie do I przytrzymują tak DNA, że żadna z nici nie może się swobodnie obracać. Segment T jest przewlekany przez rozcięty segment G i przechodzi do szczeliny. Połączenie końców segmentu G (ligacja) uwalnia segment T przez bramkę w dolnej części enzymu. Hydroliza ATP i uwolnienie ADP oraz ortofosforanu powoduje oddalenie się domen wiążących ATP -> enzym jest gotowy do związania następnego segmentu T. Opisany wyżej proces powoduje zmniejszenie wartości liczby opleceń (Lk) o dwa.

Aktywność bakteryjnego topoizomerazy II (często nazywanej gyrazą) jest hamowana przez wiele antybiotyków. Hamują działanie enzymu prokariotycznego efektywniej niż eukariotycznego.

Nowobiocyna - zapogiega wiązaniu ATP do gyrazy;

Kwas nalidyksowy i cyproflaksacyna - zaburzają proces rozcinania i łączenia łańcuchów DNA, często używane w leczeniu bakteryjnych zakażeń dróg moczowych;

Kamptotecyna - związek o właściwościach przeciwnowotworowych, hamuje ludzką topoizomerazę I poprzez stabilizowanie tego enzymu w postacie, w której jest on kowalencyjnie związany z DNA.

Tu mamy ładny schemacik działania topoizomerazy typu II, czyli gyrazy, aczkolwiek radzę spojrzeć na stronę 796, bo tam jest inny xD

28.3 Replikacja polega na syntezie nowej nici DNA z trifosforanów deoksynukleozydów zgodnie z informacją zapisaną w nici stanowiącej matrycę.

Nowo zsyntetyzowana nic musi być komplementarna do rodzicielskiej, zatem każda z nici cząsteczki rodzicielskiej służy jako matryca do syntezy nowej nici. Substratami syntezy nowych nici są trifosforany deoksynukleotydów. Są dodawane do końca 3’ nowo syntetyzowanego łańcucha DNA.

Jak to ugryźć? Obie nici helisy biegną w przeciwnych kierunkach, synteza zawsze odbywa się od końca 5’ do końca 3’, obie nici oddziaływują ze sobą - zasady nie są dostępne dla enzymu, nici muszą zostać rozdzielone, rozdzielenie wymaga rozplecenia helisy, tworzą się superhelikalne skręty które też trzeba usunąć, żeby replikacja zachodziła dalej, ogólnie armagedon i STRYER KURWA!

Polimerazy DNA wymagają matrycy oraz startera

Polimerazy DNA katalizują syntezę łańcucha polinukleotydowego poprzez dodawnie do niego kolejnych nukleotydów. (niebywałe xD) Włączany nukleotyd oddziałuje najpierw z komplementarnym do niego nukleotydem matrycy, tylko wtedy polimeraza DNA go przyłączy, dlatego też polimerazy DNA są enzymami zależnymi od matrycy.

Polimeraza dodaje nukleotyd do końca 3’, katalizuje atak nukleofilowy grupy hydroksylowej przy węglu C-3’ deoksyrybozy znajdującej się na końcu łańcucha polinukleotydowego na grupę fosforanową alfa trifosforanu nukleozydu, który zostanie włączony do syntetyzowanej nici. Polimerazy DNA potrzebują startera, który ma wolną grupę hydroksylową 3’ i jest sparowany z matrycą. Nie mogą rozpocząc syntezy de novo , nawet jeżeli mają dostęp do jednoniciowej matrycy DNA. Polimerazy RNA są w stanie rozpocząć syntezę RNA bez startera.

Wszystkie polimerazy DNA mają podobną strukturę

Pierwszym enzymem, którego strukturę odkryto był fragment Klenowa polimerazy DNA I z E.Coli., zawiera domenę o aktywności polimerazowej, która ma kształt prawej dłoni, ale też domenę odpowiedzialną za aktywność egzonukleazową 3’->5’, dzięki której enzym kontroluje poprawność syntezy DNA i koryguje powstałe błędy.

Dwa jony metali związane z polimerazą DNA uczestniczą w reakcji polimeryzacji

Polimerazy DNA do swojej aktywności potrzebują jonów metali, a dokładnie dwóch jonów xD Jeden wiąże się z trifosforanem deoksynukleozydu (dNTP) i grupą hydroksylową 3’ startera, a drugi oddziałuje tylko z grupą 3’-OH dNTP. Oba jony są ‘spinane’ przez reszty asparaginaniowe położone w wewnętrznej części dłoni, dzięki temu jony są w odpowiednim miejscu i orientacji. Jon metalu związany ze starterem aktywuje 3’-OH startera, umożliwiając atak tego hydroksylu na grupę fosforanową alfa w dNTP. Oba jony metalu współuczestniczą w neutralizacji ujemnego ładunku gromadzącego się w czasie pentakoordynacyjnego stanu przejściowego ? XD Jon metalu związany z dNTP neutralizuje ujemny ładunek pirofosforanu, pirofosforan jest uwalniany po włączeniu do łańcucha każdego kolejnego nukleotydu.

Przestrzenne dopasowanie komplementarnych zasad gwarantuje precyzję replikacji DNA

Dobra, o chuj tu chodzi w skrócie. Najważniejszy jest kształt wiązanej zasady, żeby to było komplementarne. W centrum aktywnym polimerazy DNA pewne reszty aminokwasowe tworzą wiązania wodorowe z parą zasad od jej strony zwróconej ku małemu rowkowi. Są tam jakieś atomy akceptorowe wiązań wodorowych dla zasad typu Watson-Crick, oni to nazywają jakąś swoistą linijką. dzięki której wiadomix czy para zasad w centrum aktywnym ma właściwe rozmiary. Po drugie polimerazy DNA zamykają się wokół włączanego nukleotydu. Związanie dNTP powoduje zmianę konformacyjną w enzymie, domena palca obraca się, formuje kieszeń, do której pasują zasady tylko o określonym kształcie.

Odcinek RNA syntetyzowany przez prymazę jest starterem umożliwiającym rozpoczęcie syntezy DNA

DNA nie może być syntetyzowany dopóki nie ma startera xD Polimerazie DNA trza odcinka starterowego z wolną grupą 3’-OH. Jak powstaje ON? Cząsteczka RNA jest starterem w syntezie DNA, polimeraza RNA o wdzięcznej nazwie prymaza, syntetyzuje krótki fragment RNA (ok. 5 nukleotydów), który jest komplementarny do jednej z nici matrycy. Prymaza może rozpocząc syntezę bez żadnego startera. Po zainicjowaniu syntezy DNA, krótki starter RNA jest usuwany i zastępowany przez DNA.

Jedna z nici DNA powstaje we fragmentach, natomiast druga nić syntetyzowana jest w sposób ciągły.

Miejsce syntezy DNA to widełki replikacyjne. Polimerazy DNA syntetyzują tylko w kierunku 5’->3’, dlaczego wydaje się że druga nić jest syntetyzowana w kierunku 3’->5’? To rozwiązał synek Okazaki, który skminił, ze znacząca część syntetyzowanego DNA występuje w postaci krótkich fragmentów (tzw. fragmenty Okazaki, ok. 1000 nukleotydów). W miarę oddalania się od widełek zostają połączone kowalencyjnie i tworzą jedną z nici potomnych. Nić z fragmentów Okazaki to nić opóźniona, nić syntetyzowana w sposób ciągły to nić wiodąca. Nieciągła synteza nici opóźnionej umożliwia polimeryzację w kierunku 5’>3’ na poziomie nukleotydowym , zachowując przy tym ogólny kierunek wydłużania nici 3’->5’ (że kurwa czo? to w końcu w którą strone to ma iść xD)

Ligaza DNA łączy końce DNA w rejonach dwuniciowych

Ligaza DNA katalizuje tworzenie się wiązania fosfodiestrowego między grupą 3’-OH jednego końca nici DNA i grupą 5’-fosforanową na końcu drugiej nici. Do przeprowadzenia tej endoergicznej reakcje potrzebne jest źródło energii, u eukariotów i archeonów - ATP, u bakterii - NAD+.

Ligaza DNA nie może łączyć i zamykać w formę kolistą jednoniciowych cząsteczek DNA. Ligaza “skleja” pęknięcia tylko w dwuniciowych cząsteczkach.

Ligaza DNA u E.Coli tworzy wiązania fosfodiestrowe tylko wtedy, gdy pęknięcie jest otoczone krótkimi odcinkami dwuniciowego DNA. Ligaza DNA kodowana przez bakteriofaga T4 moze łączyć dwie dwuniciowe cząsteczki DNA zakończone tępymi końcami.

Rozdzielenie nici DNA wymaga specjalnych enzymów - helikaz oraz hydrolizy ATP

W czasie replikacji DNA dwie nici helisy muszą być rozplecione, przynajmniej miejscowo. Helikazy dzięki energii z hydrolizy ATP rozplatają nici DNA. Mechanizmy helikaz są dalej niezbadane, ale rozkminili struktury przestrzenne kilku helikaz. Mianowicie helikazy PcrA, która różni się od tych co biorą udział w replikacji DNA, bo jest białkiem monomerycnym (to po chuj ją omawiać xD), ale składa się z czterech domen A1,A2,B1,B2. Domena A1 zawiera pętlę P charakterystyczną dla NTPaz typu P. Domena ta uczestniczy w wiązaniu i hydrolizie ATP. Domena B1 jest domeną homologiczną w stosunku do A1, ale nie zawiera pętli P. Domeny A2 i B2 mają swoiste struktury.

Zaproponowali se mechanizm działania helikaz. Domeny A1 i B1 mogą wiązać jednoniciowy DNA. W nieobecności ATP obie te domeny są związane z DNA. Przyłączenie ATP odpowiada za zmiany konformacyjne w obrębie pętli P i sąsiadujących z nią rejonów; zmiany te prowadzą do zamknęcia szczeliny występującej między domenami A1 i B1. Aby tak się stało, domena A1 uwalnia DNA i przesuwa się wzdłuż nici DNA w kierunku domeny B1. Następnie enzym katalizuje hydrolizę ATP do ADP i ortofosforanu. Uwolnienie produktów tej hydrolizy powoduje nagłe otwarcie szczeliny między domenami A1 i B1. Na tym etapie wiązanie DNA przez domenę A1 jest znacznie silniejsze niż oddziaływania DNA z domeną B1 w kierunku domeny A1. W wyniku tego enzym przemieszcza się wzdłuż nici DNA ruchem gąsienicy. W przypadku białka PcrA enzym porusza się w kierunku 3’->5’. Kiedy helikaza napotka w DNA region dwuniciowy, kontynuuje poruszanie się wzdłuż jednej nici, odsuwajac w czasie tej wędrówki drugą, komplementarną nić. Oddziaływania DNA ze specyficznymi kieszeniami, położonymi w obrębie helikazy pomagają destabilizować dupleks DNA na drodze zmian konformacyjnych.

28.4 Replikacja DNA jest procesem wymagającym ścisłej synchronizacji.

Replikacja musi zachodzić szybko XD XDXDXD szybicje niz don Stanislawek xdtak jak szybko ty piszesz notatki xD? don Staszko Żydzisławek z Żydzicy xD

Omawianie synchronizacji DNA u E.Coli sesese

Replikacja DNA wymaga polimeraz charakteryzujących się dużą procesywnością.

Polimerazy biorące udział w replikacji DNA charakteryzują się szybkością działania, precyzją i procesywnością. Procesywność - zdolność enzymu do katalizowania wielu następujących po sobie reakcji, bez odłączania się od matrycy.

______________________________________________________________________________________

Nić wiodąca i nić opóźniona są syntetyzowane w skoordynowany sposób

Dwuniciowa helisa przed polimerazą rozplatana jest przez DnaB (helikazę o strukturze heksameru). Białka wiążące jednoniciowy DNA utrzymują helisę w formie rozplecionej idzieki temu obie nici mogą służyć jako matryce. Polimerazy replikujące DNA (holoenzym polimerazy DNA III E. coli) syntetyzują w widełkach replikacyjnych jednocześnie nić wiodącą i opóźnioną. Ta polimeraza DNA III rozpoczyna właśnie syntezę nici wiodącej, wykorzystując jako starter krótką cząsteczkę RNA (zsyntetyzowaną uprzednio przez prymazę). Nić wiodąca jest syntetyzowana w sposób ciągły (polimeraza DNA II). Topoizomeraza II wprowadza równocześnie prawostronne (ujemne) superskręty, aby przciwdziałać problemom topologicznym.

nić wiodąca->polimeraza DNA->helikaza<-starter RNA<-nić opóźniona

Nić opóźniona jest syntetyzowana we fragmentach. Umożliwia to wydłużenie syntetyzowanego łańcucha w ‘ogólnym kierunku’ czyli 3’ → 5’ (na marginesie polimeraza przebiega 5’→3’). Synteza tej nici musi być zsynchronizowana z syntezą nici wiodącej.

Jak to się dzieje? -.-

Holoenzym polimerazy DNA III zbudowany jest z dwóch kopii rdzenia enzymu o aktywności polimerazowej a dokładnie z: podjednostki wykazującej aktywność polimerazową (podjednostka α), podjednostki o aktywności korygującej, czyli 3’→ 5’ egzonukleazowej (podjednostka ε), podjednostki zwanej θ oraz dwóch kopii podjednostki β (które tworzą dimer β2 będący klamrą obejmującą DNA). Oba rdzenie związane są z centralną częścią holoenzymu zbudowaną z podjednostek γτ2σσ’χφ. Kompleks γτ2σσ’ steruje podjednostkami β i umożliwia im pochwycenie DNA; podjednostki χ i φ oddziałują z białkami SSB wiążącymi się z jednoniciowym DNA. Polimerazy DNA (replikacja DNA) u Eukariotów mają podobną strukturę i budowę podjednostkową, ale są bardziej skomplikowane niż Prokariotyczne odpowiedniki.

MODEL PUZONU (sposób replikacji)

Łaj puzon? Bo wielkość pętli wydłuża się i skraca - jak suwak puzonu)

(1) Matryca do syntezy nici opóźnionej tworzy pętle, przez co może się przesuwać w miejscu

polimerazowym jednej podjednostki dimeru polimerazy DNA III w tym samym kierunku, co matryca nici

wiodącej w drugiej części enzymu.

(2) Po syntezie około 1000 nukleotydów enzym uwalnia matrycę nici opóźnionej. Tworzy się nowa pętla,

prymaza syntetyzuje kolejny krótki łańcuch RNA, który służ jako starter kolejnej syntezy fragmentu

Okazaki.
(3) Luki między fragmentami powstającej nici opóźnionej są wypełnione przez polimerazę DNA I.

Wykorzystuje ona swoją aktywność egzonukleazową 5’→3’ do usunięcia startera RNA, który znajduje

się przed enzymem, na początku każdego fragmentu Okazaki.

STARTER NIE MOŻE BYĆ USUNIĘTY PRZEZ POLIMERAZĘ DNA III, GDYŻ NIE POTRAFI ONA

DEGRADOWAĆ RNA OD KOŃCA 5’

(4) Ligaza łączy poszczególne fragmenty DNA

Replikacja DNA u E. coli rozpoczyna się w ściśle określonym miejscu genomu

U E. coli replikacja DNA rozpoczyna się w jednym, ściśle określonym miejscu genomu (oriC locus)

OriC zawiera 5 powtórzeń sekwencji, do których preferencyjnie wiążą się białka DnaA - polipeptydy rozpoznające miejsce inicjacji replikacji DNA u bakterii. Zawiera również tandemowo ułożone sekwencje bogate w pary A-T.

Rozpoczęcie replikacji ma wiele etapów:

(1) Przyłączenie się do DNA białek DnaA

DnaA należy do rodziny NTPaz zawierających pętle P, a dokładnie należy do ATPaz AAA. Każdy

monomer DnaA składa się z domeny ATPazowej i domeny odpowiedzialnej za wiązanie DNA,

położonej na końcu karboksylowym cząsteczki. Białka DnaA przez te domeny ATPazowe mogą ze

sobą oddziaływać. Po związaniu cząsteczki ATP i jej hydrolizie, kompleks ulega rozbiciu. Wiązanie

się białek DnaA ze sobą sygnalizuje rozpoczęcie okresu przygotowawczego do replikacji, a rozbicie

kompleksu na monomery świadczy o zakończeniu tego etapu. Cząsteczki DnaA wiążą się

początkowo w obrębie OriC do pięciu miejsc, które wykazują duże powinowactwo do tego białka.

Związane cz. DnaA oddziałują następnie z cz. DnaA wiążącymi się do miejsc o mniejszym

powinowactwie, tworząc oligomer. DNA jest owinięty wokół heksameru białek DnaA.

(2) Przed syntezą startera pojedyncze nici DNA muszą być dostępne dla maszynierii replikacyjnej

-do akcji wkraczają dodatkowe białka

-za pomocą białka DnaC helikaza DnaB dostarczana jest do miejsca rozpoczynającego replikację

-pewne odcinki OriC (w tym również regiony bogate w pary A-T) ulegają rozplecieniu

-do rozplecionych, jednoniciowych fragmentów DNA przyłączają się białka SSB

-tworzy się kompleks przedstarterowy (nici helisy są w nim dostępne dla innych enzymów)

-prymaza, DnaG, może rozpocząć syntezę RNA, który następnie będzie starterem w procesie

replikacji DNA

(3) Organizuje się holoenzym polimerazy

Holoenzym polimerazy DNA III organizuje się tam gdzie kompleks przedstarterowy.

Na początku oddziaływania białka DnaB i części polimerazy DNA III, która jest odpowiedzialna za

interakcje z DNA (czyli dimerem β₂). Oddziaływania te stymulują hydrolizę ATP przez DnaA, co jest

sygnałem inicjacji replikacji. Rozbicie kompleksu białek DnaA zabezpiecza przed dodatkowymi

rundami replikacyjnymi.

Synteza DNA u eukariotów rozpoczyna się w wielu miejscach

ofc proces bardziej skomplikowany bo:

⇒ wielkość genomu

⇒ muszą ulec powieleniu 23 pary chromosomów (a nie info w 1 jak u E. coli)

⇒ ludzkie chromosomy są liniowe (u E. coli koliste) więc muszą być mechanizmy, żeby się za każdym

razem nie skracały

Pierwsze dwa problemy rozwiązane są przez wykorzystanie wielu miejsc początku replikacji, po kilkaset w każdym chromosomie (ok. 30 000 ori). Każde miejsce startu replikacji jest początkiem samodzielnej jednostki replikacyjnej zwanej REPLIKONEM. Miejsca te nie mają tak jednolitej sekwencji w porównaniu do E. coli. Rejony bogate w pary AT są miejscami, w których powstają kompleksy początku replikacji (KOMPLEKSY ORC)

(1) Porównanie kompleksu ORC jest pierwszym etapem przygotowawczym do replikacji DNA.

ORC składa się z 6 białek, każde wykazuje homologię do DnaA. Prawdopodobnie białka te wspólnie

tworzą heksamer, podobny do tego, który formował cząsteczki białka DnaA u E. coli.

(2) Tak zwane czynniki upoważniające rekrutują helikazę, która rozplata nici helisy DNA.

po utworzeniu ORC dodatkowe białka przyłączają siędo miejsca początku replikacji (w tym Cdc6 -

jakiś tam homolog podjednostek kompleksu ORC oraz Cdt1). Białka te rekrutują helikazę Mcm2-7,

zbudowaną z 6 podjednostek tworzących heksamer. Białka te + helikazę nazywa się czynnikami

upoważniającymi, bo umożliwiają formowanie kompleksu inicjacyjnego. Po utworzeniu tego kompleksu

Mcm2-7 rozplata nici, do których przyłączają się białka replikacyjne A (stabilizując odcinki i

uniemożliwiając im ponowne parowanie)

(3) Dwie różne polimerazy biorą udział w kopiowaniu eukariotycznego replikonu.

Replikację rozpoczyna polimeraza α, która zostanie później zamieniona na enzym o dużo większej

procesywnośc (polimeraza DNA σ), jest to tzw. zamiana polimeraz.

Replikacja rozpoczyna się od przyłączenia polimerazy DNA α
⇒w skład jej wchodzi podjednostka wykazująca aktywnośc prymazy, która syntetyzuje starter RNA

⇒syntetyzuje DNA

⇒po dodaniu do startera ok. 20 deoksynukleotydów zostaje zastąpiona przez replikacyjny czynnik C(RFC)

RFC oddziałuje z PCNA (jądrowy antygen dzielących się komórek, odpowiednik dimeru β₂). Czyli PCNA utrzymuje polimerazę DNA w stanie zasocjowanym z podwójną helisą DNA). Oddziaływania PCNA i polimerazy σ umożliwia szybką replikację długich fragmentów DNA. Replikacja przebiega w obu kierunkach od ori, aż do spotkania się (połączenia) replikonów. Startery RNA zostają usnięte, a fragmenty DNA połączone ze sobą dzięki ligazie DNA.

Replikacja DNA jest ściśle powiązana z cyklem komórkowym. Istnieje kilka punktów kontrolnych. W czasie cyklu są syntetyzowane i degradowane przez proteosom małe białka (cykliny). Cykliny wiążą się do zależnych kinaz białkowych i w ten sposób je aktywują. Np. cdk2 oddziałuje z kompleksami białek obecnych w ori i reguluje replikację.

PORÓWNANKO!!

NAZWA	FUNKCJA
Polimerazy prokariotyczne
Polimeraza DNA I	usuwa starter i wypełnia powstałe po jego usunięciu luki w nici opóźnionej
Polimeraza DNA II	naprawa DNA
Polimeraza DNA III	główny enzym syntetyzujący DNA
Polimerazy eukariotyczne
Polimeraza DNA α Podjednostka o aktywności prymazy Podjednostka syntetyzująca DNA	polimeraza inicjatorowa syntetyzuje starter RNA dodaje ok. 20 nukleotydów do startera
Polimeraza DNA β	naprawa DNA
Polimeraza DNA σ	głowny enzym syntetyzujący DNA

Telomery to specjalne struktury na końcach liniowych chromosomów

Ach te liniowe chromosomy. PROBLEM!

Trudne jest całkowite powielenie DNA na końcach chromosomów, ponieważ polimerazy syntetyzują 5’→3’. Nić opóźniona po usunięciu startera RNA ma niekomoletny koniec 5’.

Jak sobie z tym radzą?

Jedna z nici DNA, na końcu 3’, zawiera dużo nukleotydów guaninowych i jest nieco dłuższa niż druga nić (AGGGTT). Na końca chromosomów mogą tworzyć się duże dwuniciowe pętle. Jednoniciowy region zawija się i tworzy wiązania wodorowe z innym rejonem powtarzającej się sekwencji. Pętle są stabilizowane przez swoiste białka rozpoznające telomery. Kompleksy te dobrze osłaniają i chronią końce chromosomów.

Telomery są syntetyzowane przez telomerazę, która jest specjalną polimerazą zawierającą własną matrycę

Jak powstają te powtórzone sekwencje na końcach chromosomów?

Do wyizolowanego z komórki enzymu TELOMERAZY dodaje się starter kończący się sekwencją GGTT oraz trifosforany deoksynukleozydów. Powstaną fragmenty o sekwencji GGTTAGGGGTT, GGTTAGGGTTAGGGTT i dłuższe.

Jakieś tam kobietki odkryły, że w skład telomerazy wchodzi cząsteczka RNA, która służy jako matryca w procesie elongacji nici bogatej w G. Tak więc ten świetny enzym zawiera pełną informację potrzebną do syntezy sekwencji telomerowych, dokładna liczba powtórzeń tych sekwencji nie jest ostotna. Telomeraza jest wyspecjalizowaną odwrotną transkryptazą, w której skład wchodzi matryca (potrzebna do jej aktywności) Może odgrywać ważną role w w rozwoju nowotworów i starzeniu się komórek.

28.5 Wiele typów uszkodzeń DNA podlega naprawie

Błędy mogą się pojawić podczas replikacji
⇒ nieprawidłowy nukleotyd, możliwość jego wprowadzenia do nici DNA. (brak oddziaływań z odpowiadającym nukleotydem na matrycy). Zmienia to lokalnie strukturę cząsteczki DNA. Pary nukleotydów są mutagenne. Po replikacji - dwie helisy potomne różniące się sekwencją, bo każda zasada niestandardowej pary będzie matrycą dla włączenia nukleotydu tworzącego z nim parę.

⇒insercja

⇒delecja

⇒peknięcie nici DNA

⇒polimerazy odpowiedzialne za replikację mogą się zatrzymać bądź odłączyć od matrycy (zatrzymana replikacja

NA RATUNEK CIĄGŁOŚCI REPLIKACJI DNA!!

Są tam jakieś mechanizmy do przeciwdziałania temu. Wyspecjalizowane polimerazy, replikują uszkodzony DNA. Ale popełniają sporo błędów. Potem może częsciowo naprowione zostaną przez enzymy systemów naprawy DNA.

Przyczyną niektórych chorób genetycznych jest wzrost liczby powtórzeń trójek nukleotydowych

Na ten przykład pląsawica Huntingtona, choroba neurologiczna, dziedziczenie w sposób dominujący autosomalny. Zmutowany gen (ulega ekspresji z mózgu) koduje białko zwane huntingtyną. Białko to zawiera fragment z nieprzerwanego ciągu reszt glutaminowych. Zdrowe osoby 6-31 powtórzeń CAG. Od 36 - 82 (i więcej) u chorych. U dzieci dzieci xD coraz to więcej powtórzeń. W konsekwencji antycypacja, czyli wcześniejsze niż u rodziców pojawienie się objawów choroby u dzieci.

Dlaczego to sie tak zwiększa? Bo tworzą się alternatywne struktury DNA podczas replikacji (tworzenie pętli)

Czynniki utleniające, alkilujące, a także światło mogą uszkadzać zasady DNA

*reaktywne formy tlenu reaguje z guaniną tworząc 8-oksyguaninę i podczas replikacji tworzy parę z

adeniną

*deaminacja adenina przekształca się w hipoksantynę i ona tworzy chętniej wiązania z

cytozyną. Guanina i cytozyna również ulegają deaminacji

*alkilowanie atak przez nukleofile np. pozycja N-7 w G i A)

*detoksykacja aflatoksyna B₂, związek wytwarzany przez pleśnie na orzeszkach ziemnych;

enzym -cytochrom P450- przekształca ją w reaktywny epoksyd, epoksyd z N-7 G i

powstaje addukt, następuje transwersja G-C→T-A

*UV wiązania kowalencyje łączące sąsiadujące ze sobą zasady pirymidynowe w 1

łańcuchu (wstrzymana replikacja i ekspresja) przykład Dimer tyminowy,

cross-links PSORALEN - łączy dwie nici.

*promieniowanie X wytwarzanie w roztworze DNA dużych stężeń związków reaktywnych.

Uszkodzenia DNA mogą być rozpoznawane i naprawiane przez różnorodne systemy naprawcze

I Rozpoznanie nieprawidłowej zasady/zasad

II Usunięcie nieprawidłowej zasady/zasad

III Wypełnienie powstałej luki przez polimerazę DNA i ligazę DNA

(1) polimerazy DNA - odpowiedzialne za replikację same są w stanie skorygować błędy powstałe w trakcie syntezy np. podjednostka 3 polimerazy DNA III odpowiada za aktywność 3’→5’ egzonukleazową. Dzięki niej usuwane są z końca 3’ syntetyzowanej nici nukleotydy niesparowane z matrycą. W czasie syntezy nowej nici DNA zasdada podlega ciągłej korekcie. Jeśli zostanie włączony zły nukleotyd synteza DNA zwalania. Dodatkowa taka niesparowana zasada jest słabo związana z matrycą. (może łatwo zmienić swoją pozycję - przesuwając się)

Jeżeli podczas replikacji para niesparowanych nukleotydów umknie autokorekcie prowadzonej przez polimerazę DNA do akcji wkracza drugi system naprawczy.

(2) systemy naprawy niesparowanych nukleotydów - składają się z co najmniej dwóch białek, jedno rozpoznaje niesparowane, drugie pozyskuje endonukleazę, która rozcina nowo zsyntetyzowaną nić w pobliżu uszkodzenia. U E.coli te białka nazywają się MutS i MutL, a nukleaza MutH.

(3) bezpośrednia naprawa - zależna od światła reakcja rozcięcia dimerów pirymidynowych. Niektóre komórki zawierają fotoliazę DNA (enzym aktywowany światłem rozcina dimer na dwie wyjściowe zasady pirymidynowe).

(4) naprawa, która rozpoczyna się wycięciem zasady - związanie enzymu z uszkodzonym DNA powoduje wyciągnięcie zasady z wnętrza helisy DNA i skierowanie jej do centrum aktywnego AlkA (enzym E. coli). Natępnie enzym działa jak glikozydaza, rozcina w. glikozydowe uwalniając uszkodzoną zasadę. Ta dziura zwana jest miejscem AP, bo to miejsce apurynowe (bez A lub G). Endonukleaza AP rozcina szkielet fosfocukrowy tuż przy miejscu AP. Fosfodiesteraza deoksyrybozowa wycina pozostałą część naprawionego nukleotydu, a polimeraza DNA I wprowadza na to miejsce odpowiedni nukleotyd (na podstawie informacji zawartej w nieuszkodzonej, komplementarnej nici) i naprawiana nić jest łączona dzięki ligazie DNA.

PRZYKŁADZIK: proces usuwania z DNA dimerów pirymidynowych

a) rozpoznanie przez kompleks (zbudowany z białek, które są produktami genów uvrABC) zmian

strukturalnych

b) uvrABC rozcina DNA w dwóch miejscach (8 nukleotydów przed dimerem od 5’ i 4 nukleotydy za

dimerem od 3’)

c) fragment ten zostaje wycięty przez ekscynukleazę i oddyfundowuje od helisy DNA

d) polimeraza DNA I syntetyzuje brakujący fragment białka

e) 3’ uszkodzonej nici jest starterem, a nietknięta nić stanowi matrycę

f) 3’ nowo zsyntetyzowanego łańcucha zostaje połączony z istniejącym fragmentem tej samej nici DNA,

dzięki ligazie DNA

Ligaza DNA łączy tylko pęknięcia nici w jednym łańcuchu. A jak naprawiane są pęknięcia obu nici?

1) NHEJ (niehomologiczne łączenie końców) nie wymga obecności innych cząsteczek DNA w komórce.

NHEJ przyłącza do wolnych końców dwuniciowych cząsteczek DNA przyłącza heterodimer zbudowany

z dwóch białek Ku70 i Ku80. Rola tych cudnych białeczek: stabilizacja końców i wyznacza do kolejnych

manipulacji oraz punkty przyczepu dla innych białek, które zbliżają zerwane końce do siebie, co

umozliwia enzymom ich połączenie.

2) systemy naprawcze wykorzystujące rekombinację homologiczną (sekcja 28.6)

Obecność tyminy zamiast uracylu w DNA umożliwia identyfikację i naprawę deaminowanej cytozyny

Różnica między T a U: podstawnik występujący przy węglu C-5. T ma grupę metylową, a U wodór.

W DNA cytozyna często ulega spontanicznej deaminacji do uracylu (to może być przyczyną mutacji, bo U=A zamiast A=C). Systemik naprawczy, uracyl jako zasada nieprawidłowa.

Glikozydaza uracylowa - hydrolizuje w. glikozydowe U a reszta deoksyrybozy, ale nie atakuje nukleotydów zawierających T. Jest homologiem AlkA. Grupa metylowa jest znacznikiem, który pozwala odróżnić tyminę od deaminowanej cytozyny. W DNA więc zamiast U występuje T, bo pozwala to na wprowadzenie dodatkowego systemu kontrolującego wierność zapisu genetycznego.

Przyczyną licznych rodzajów nowotworów złośliwych są niesprawnie działające systemy naprawy DNA
Geny supresorowe (geny kodujące białka uczestniczące w naprawie DNA, przeciwdziałają transformacji nowotworowej) Wystarczy jedna kopia bez mutacji, by było ok.

Xeroderma pigmentosum - choroba skóry, autosomalna cecha recesywna, wrażliwa na światło słoneczne lub UV. Postępuje zanik skóry właściwej, rogowacenie skóry, powieki pokryte bliznami, wrzodzieje rogówka. Rak w kilku miejsach, czyli przeżuty, umiera do 30 roku życia. Uszkodzenie systemu naprawy przez wycięcie nukleotydów w tym również homologów podjednostek kompleksu UvrABC u E.coli.

Niepolipowy rak okrężnicy i odbytnicy (zespół Lyncha) - uszkodzenie systemu rozpoznającego i korygującego niewłaściwe parowanie nukleotydów. Mutacje w dwóch genach (hMSH2 i hMLH1 - ludzkie odpowiedniki MutS i MutL z E.coli)

Li - Fraumeni - groźna mutacja w jednej kopii genu p53. Gen kodujący białko p53 jest zmutowany w przypadku ponad połowy wszystkich nowotworów. Białko to pozwala kontrolować los uszkodzonych komórek, przede wszystkim wykrywa dwuniciowe pęknięcia. Gdy odkryje uszkodzenie to stymuluje naprawę DNA lub aktywuje szlak apoptyczny.Dotyczy kom. somatycznych.

Wiele potencjalnych karcynogenów można wykryć za pomocą ich oddziaływania na bakterie

Uszkodzenie DNA jest podstawowym powodem karcynogenezy. Test Amesa: 2 szalki, Salmonella, krążek z mutagenem. Szalka A: zawiera bakterie które nie potrafią syntetyzować histydyny. Rewertanty spontaniczne. Mało ich. Szalka B: z krążkiem bibułki. Na szlace pojawiło się wiele rewertantów, które rosną na pożywce bez histydyny. Niektóre związki chem. nabierają właściwości karcynogennych w wątrobie, dlatego do agaru kilka miligramów homogenatu wątroby ssaka.

28.6 Rekombinacja DNA odgrywa ważną rolę w replikacji, naprawie oraz wielu innych procesach

Rekombinacja polega na wymianie fragmentów DNA między dwiema cząsteczkami DNA. Z reguły fragmenty o podobnej sekwencji. Ważna rola w następujących procesach:

(1) Gdy replikacja zostaje wstrzymana, procesy rekombinacyjne wznawiają

(2) Dwuniciowe pęknięcia helisy DNA są naprawiane

(3) Tworzenie molekularnej różnorodności przeciwciał

(4) U niektórych wirusów w procesie integracji swojego materiału genetycznego z DNA kom. gosp.

(5) W czasie mejozy kontrola wymiany materiału między chromosomami homologicznymi

(6) przy manipulacjach genetycznych, przy otrzymywaniu myszy z uszkodzeniami określonych genów

Białko RecA inicjuje rekombinację poprzez inwazję nici

Cząsteczka DNA o wolnych końcach ulega rekombinacji z cząsteczką DNA nie mającą zdolnych do oddziaływań wolnych końców. A skąd się biorą te wolne końce?!

~produkt dwuniciowych pęknięć

~tworzą się podczas replikacji, jeżeli kompleks zostanie zatrzymany.

Białko RecA przywódcza rola w rekombinacji (członek rodziny ATPaz AAA)
a)pojedyncza nić odsuwa jedną z nici drugiej podwójnej helisy

b)utworzenie trójniciowej struktury (pętla D) jest to inwazja nici; wolny koniec 3’ jednej cząsteczki jest teraz związany z ciągła nicią drugiej, może służyć jako starter. Dzięki tej inwazji: naprawa dwuniciowych pęknięć, reinicjacja replikacji.

W trakcie rekombinacji tworzą się struktury Hollidaya (produkt pośredni)

Mechanizm rekombinacji:

~zbliżenie dwóch cząsteczek DNA i utworzenie kompleksu rekombinacyjnego

~jedna z nici każdej helisy jest rozcinania przez rekombinazę, a końce 3’ łączy się ze specjalnymi resztami tyrozynowymi (Y) enzymów

~powstają wiązania fosfodiestrowe (w wyniku ataku końców 5’ jednej przeciętej nici na wiązania tyrozyna-DNA drugiej)

~izomeryzacja

~powtarzanie się etapów

~powstaja dwie zrekombinowane cząsteczki DNA

Y =Y ________ Y -Y ________________ Y-Y ___________ Y Y ________ Y Y

| | izomeryzacja | | utworzenie || ||

Y =Y rozcięcię Y -Y utworzenie wiązania Y-Y Y Y wiązania Y Y

kompleks struktura Hollidaya

Niektóre rekombinazy są ewolucyjnie spokrewnione z topoizomerazami

Specjalne reszty tyrozynowe rekombinazy Cre łączą się czasowo z grupami fosforanowymi na końcu 3’łańcucha DNA (przypomina to mechanizm topoizomerazy). Ewolucyjna dywergencja. Widoczne jest to w strukturze przestrzennej rekombinaz itopoizomeraz typu I, bo podobieństwo sekwencji aminokwasowych jest stosunkowo niewielkie. Ważną rolę w obu przypadkach odgrywa wiązanie reszty tyrozyny i DNA. W reakcji katalizowanej przez topoizomerazę połączenie to jest rozrywane w czasie ataku grypy hydroksylowej 5’, odtwarza się wiązanie fosfodiestrowe. Rekombinaza: atakujacy hydroksyl 5’ nie był wcześniej związany z grupą fosforanową, z która utworzy wiązanie fosfodiestrowe.