Wykład 4

Ogólnie rzecz biorąc nie ma odstępstw od replikacji semikonserwatywnej. Jednak zdarzają się wyjątki:

Wariant 1 – replikacja przemieszczającej się pętli – biegnie przy replikacji genomów mitochondrialnych, genom mitochondrialny ma postać kolistą, wszystko zaczyna się od pierścienia (pętli D). jego powstanie wiąże się z synteza startera do replikacji, w tym rejonie podwójna helisa się rozwija i jest dobudowywana cząsteczka RNA, która jest starterem , który rozpoczyna syntezę jednej nici. Podczas syntezy nowej nici DNA dochodzi do wyparcia drugiej nici. I to postępuje. Na końcu syntezy mamy zakończoną syntezę jednej nici i mamy wypartą 2 nić, która podlega teraz dobudowaniu drugiej nici. Na końcu procesu mamy 2 zreplikowane, semikonserwatywne nici.

Wariant 2 – dotyczy kolistych cząsteczek, nie mitochondrialnych, ale replikacji DNA fagowego (np.: fag λ). Fag ten ulega replikacji na drodze replikacji obracającego się koła. Jedna z nici od końca 3’ jest syntezowana. To co jest syntezowane wydłuża nić przez co koło się obraca. Na początku zachodzi przecięcie jednej nici, a dalej są dobudowywane nukleotydy. Na odwijanym fragmencie od miejsca syntezy otrzymujemy wiele kopii jednej informacji. W jakimś momencie syntezowana jest komplementarna cząsteczka do danej nici. Na końcu otrzymujemy liniową cząsteczkę zawierającą wiele powielonych genomów faga.

proces replikacji

proces replikacji można podzielić na 3 etapy:

- inicjacja replikacji – rozpoznawane są miejsca w cząsteczce DNA, gdzie replikacja się zaczyna

- elongacja – biegnie właściwy proces replikacji, widełki replikacyjne się przesuwają, kopiuje się DNA

- germinacja – zamknięcie procesu replikacji

1. Inicjacja

Nie jest to proces przypadkowy. Zaczyna się w tym samym, ściśle określonym miejscu w cząsteczce DNA - miejsce startu replikacji – ori. Po zainicjowaniu replikacji, powstałe widełki replikacyjne przemieszczają się w przeciwnym kierunkach po cząsteczce DNA. Dla większości genomów replikacja jest procesem 2-kierunkowym. Kolisty genom bakteryjny zawiera 1 ori, co oznacza, że wiele tysięcy par zasad jest kopiowanych przez poruszające się widełki replikacyjne.

Replikacja u organizmów wyższych (drożdże i człowiek)

W chromosomach eukariotycznych występuje wiele ori, bo chromosom bakteryjny jest bezwzględnie mały – synteza jest prowadzona w oparciu o tylko jedno miejsce. Oznacza to, że odcinki DNA, które przypadają na parę widełek replikacyjnych są u człowieka krótkie. W genomie człowiek jest ok. 20000 ori. Jednoczesne rozpoczęcie replikacji w wielu miejscach umożliwia syntezę wielu kopii.

Bakterie i rozpoczęcie replikacji

oriC – miejsce startu replikacji u E. coli – jest to sekwencja o długości 245 par zasad. Jego zadaniem jest zapewnienie plazmidowi niezależnej replikacji.

- ciągi 9-nukleotydowe – jest ich 5, mają różną orientację. Są istotne dla pełnienia funkcji dla oriC. Są to miejsca wiązania białka inicjatorowego DnaA. Tych białek jest ok. 30. Po związaniu tego białka cząsteczka DNA ulega stopieniu (rozdzieleniu). Białko DnaA nie ma aktywności, aby rozrywać wiązania wodorowe.

- fragmenty 13-nukleotydowe – 3 powtórzenia, udział A-T jest duży.

Interakcja białek z sekwencją ori (powoduje powstanie widełek replikacyjnych) – powstaje kompleks (plenitacyjny?) – wchodzą tam białka:

- DnaC – które ma funkcję przekaźnika

- DnaB – jest helikazą – rozrywa wiązania wodorowe

Po działaniu białka DnaA powstaje liniowy obszar, który ulega przemieszczeniu. Na tym inicjacja się kończy, powstają widełki replikacyjne.

Widełki replikacyjne w komórce drożdżowej

Sekwencja ori drożdżowego posiada różne moduły. Miejsc do replikacji jest więcej (332).

Sekwencje drożdżowe – sekwencje autonomicznie replikujące (ARS) – są krótsze od sekwencji bakteryjnej – nie przekraczają długości 200 par zasad.

Występują 4 segmenty – A, B₁, B_2, B₃.

Subdomeny A i B₁ są rozpoznawane przez kompleks rozpoznający – kompleks ORC (wchodzi w jego skład 6 białek). Poprzez ten kompleks proces replikacji jest zsynchronizowany z cyklem komórkowym.

W subdomenach B₂ i B₃ zachodzą właściwe procesy inicjacyjne.

Subdomena B₂ ulega stopieniu, topnienie jest inicjowane przez napięcie torsyjne spowodowane przyłączeniem czynnika ABF1 z domeną B₃.

Dołączenie helikazy i innych białek kończy proces inicjacji replikacji.

1. Elongacja

Różnice między replikacją a transkrypcją.

- enzymy odpowiadające za replikację syntezują nową nić w jednym kierunku od 5’ do 3’. Na jednej nici synteza idzie zgodnie z widełkami, na 2 nici synteza idzie przeciwnie z widełkami.

- polimeraza DNA nie jest zdolna do inicjacji transkrypcji bez obecności startera.

Polimerazy DNA

Mogą oprócz syntezy DNA degradować aktywności.

I aktywność – aktywność 3’⟶5’

Jest to aktywność korekcyjna – służy do usuwania nukleotydów błędnie zsyntezowanych.

II aktywność – aktywność 5’⟶3’

Występuje tylko w polimerazie DNA I. atakuje koniec 5’, ważna w usuwaniu startera.

U bakterii występują 3 rodzaje polimeraz. Polimeraza II jest zaangażowana w procesy naprawcze.

Rozwiązanie 1 problemu.

Jedna nić jest syntezowana w sposób ciągły (nić wiodąca), 2 nić musi być syntezowana we fragmentach (nić opóźniona), które są potem łączone ze sobą.

Fragmenty Okazaki – długość ok. 1000-2000 nukleotydów u E. coli, u Eukaryota – ok. 200 nukleotydów.

Rozwiązanie 2 problemu

U Procaryota

Starterem jest krótki fragment RNA, jest on syntezowany przez polimerazę RNA – prymazę, która syntezuje krótkie startery RNA, zawsze zaczynające się od pary A-G. syntezę kontynuuje polimeraza DNA 3

U Eucaryota

Syntezowany jest krótki starter DNA poprzez aktywność prymaty, która jest integralną częścią polimerazy DNA α. Dalej cząsteczka DNA jest syntezowana przez polimerazę 𝛛.

Na nici opóźnionej powtarza się synteza.

Zjawiska w widełkach replikacyjnych

Do matrycy dołączana jest helikaza. Po dołączeniu doczepia się prymasa.

Prymosom – kompleks helikazy z prymazą.

Helikazy rozwijają cząsteczkę DNA – pękają wiązania wodorowe, gdyż helikaza porusza się wzdłuż jednej nici.

W przypadku helikazy DnaB – 5’⟶3’.

Działanie tego wszystkiego wymaga energii, która pochodzi z hydrolizy ATP.