Poznawanie genów
Zasoby genetyczne organizmu można precyzyjnie modyfikować w określonym kierunku.
Enzymy restrykcyjnie rozcinają bardzo długie cząsteczki DNA na specyficzne fragmenty, którymi można łatwo manipulować, a ligazy DNA służą do łączenia tych fragmentów. Dostępność enzymów restrykcyjnych oraz ligaz DNA umożliwia traktowanie sekwencji DNA jako modułów, które w dowolny sposób można przemieszczać z jednej cząsteczki DNA do drugiej. Technologia rekombinacji DNA opiera się na enzymologii kwasów nukleinowych. Drugi fundament tej technologii to język tworzenia par przez zasady.
Hybrydyzjacja komplementarnych sond DNA (cDNA) lub RNA stanowi potężny i czuły sposób wykrywania określonych sekwencji.
Wirusy - skutecznie wprowadzają swój DNA do komórek gospodarza, zmuszając je albo do replikacji genomu wirusowego i produkowania wirusowych białek, albo do wbudowania wirusowego DNA do genomu gospodarza.
Plazmidy - są pomocniczymi chromosom występującymi w bakteriach.
Genom człowieka - 3 miliardy par zasad.
______________________________________________________________________________
5.1 Podstawowe narzędzia wykorzystywane w poznawaniu genów
1. Analiza restrykcyjna. Enzymy restrykcyjne to precyzyjne molekularne skalpele, za pomocą którzycg badacz może manipulować odciankami DNA.
2.Techniki hybrydyzacyjne. Typu Southhern’a i northern’a są używane do rozdziału i charekteryzowania, odpowiednio DNA i RNA. Hybrydyzacja typu western - używane są przeciwciała do charakteryzowania białek.
3. Sekwencjonowanie DNA. Możliwe jest precyzyjne określenie sekwencji nukleotydów w cżasteczce DNA. Ujawniło bogactwo informacji dotyczącej architektury genów, kontroli ekspresji genów i struktury białek.
4. Chemiczna synteza kwasów nukleinowych na stałym podłożu. Można syntezować de novo fragmenty kwasów nuklein. o ściśle określonyej sekwencji, które następnie używa się od identyfikacji lum amplifikowania(powielania) innych kwasów nuklein.
5. Reakcja łańcuchowej polimeryzacji (PCR). Dzięki niej można powielić fragment DNA nawet w miliardach kopii. Jedna cząsteczka DNA można zostać amplifikowana do ilości, które umożliwiają jej scharakteryzowanie i manipulować nią. Technika jest wykorzystywana do wykrywania patogenów i chorób genetycznych, odkrywania żródła pochodzenia włosa pozostawionego na miejscu zbrodnii i ‘wskrzeszenia’ genów ze skamieniałości.
KOMPUTER i tak jest niezbędny xDXD
Enzymy restrykcyjne rozcianją DNA na specyficzne fragmenty
Enzymy restrykcyjne (endonukleazy restrykcyjne) rozpoznają specyficzne sekwencje zasad w 2u niciowej DNA i rozcinają obie nici DNA w ściśle określonych miejscach. Są niezastąpione w badaniach struktury chromosomów, sekwencjonowania b.długich cząst. DNA, izolowaniu genów i tworzeniu nowych cząstek DNA, nadających się do klonowania. En.res. odkryli Arber i Smith, a Nathans zapoczątkował ich stosowanie.
En.res. występują u wielu prokariotów. Ich biologiczna rola polega na rozcinaniu obcych cząsteczek DNA. Nie degradują komórkowego DNA gospodarza, poniewż miejsca rozpoznawane przez własne En.res. są zmetylowane. Wiele En.res. rozpoznaje specyficzne sekwencje 4rech do 8miu par zasad i hydrolizuje wiązanie fosfodiestrowe w obu niciach DNA rozpoznawanego regionu. Charakt. cechą rozpoznawyanych miejsc jest ich podwójna symetria obrotowa - palindromowa (od przodu i tyłu tak samo sie czyta, np. radar), czyli odwrotnie powtórzona, a miejsca rozcinania łańcuchów DNA są usytuowane symtetrycznie.
Oczyszczono ponad 100 róznych En.res. Ich nazwy składają się z 3 literowego skrótu nazwy organizmu z jakiego pochodzą, np. Eco od Escherichia, za którym nastepuje oznaczenie szczepu (o ile jest to konieczne) i numer enzymu podany cyframi rzymskimi (jeśli dany szczep produkuje więcje niż 1den En.res.)
En.res. wykorzystuje się do rozcinania długich odcinków DNA na specyficzne fragmenty, jest na nich łatwiej pracować. Uzyskany w wyniku działania jednego En.res.może zostać specyficznie pocięty przez kolejny. Obraz takich fragmentów może stanowić odcisk palca. Stosując wiele En.res. można sporządzić mapy dużych chromosomów, zbudowanych z setek milionów par zasad.
Fragmenty restrykcyjne można rodzielić elektroforetycznie w żelu i uwidaczniać
Nawet małe różnice między spokrewnionymi DNA można wykryć dzięki rozdzieleniu w żelu i uwidocznieniu ich fragmentów restrykcyjnych, jest to elektroforeza żelowa. Ruchliwość elektroforetyczna DNA w różnych żelach jest w pewnych granicach odwrotnie proporcjonalna do logarytmu długości tego fragmentu, wyrażanej liczbą par zasad.
Żele poliakryloamidowe do rozdzielnia fragmentów o długości do 1000 par zasad. Żele agarozowe - długie, nawet do 20 kpz.
Ważną cechą żeli jest ich zdolność rozdzielcza. W odpowiednich żelach mozna rozdzielić fragmenty nawet różniące się tylko jednym nuklotydem, a stosując elektorforezę w pulsującym polu magnetycznym (PFGE) można rozdzielić całe chromosomy, zawierające miliony nukleotydów - rozciąganie i relaksacja DNA, przez włączanie i wyłączanie pola elektrycznego. Prążki lub plamy promieniotwórczego DNA można ukazywać przy pomocy autoradiografii. DNA może być też barwione bromkiem etydyny, który po związaniu się z 2u niciowym DNA i wzbudzeniem przez światło intensywnie fluoryzuje, daje pomarańczowe światło.
Fragment restrykcyjny, zawierający specyficzną sekwencję zasad, można wyryć przez hybrydyzowanie go z komplementarnym 1no niciowym DNA wyznakowanym promieniotwórczo. Metoda/Hybrydyzacja Southern (hybrydyzacja DNA-DNA). Mieszaninę fragmentów restrykcyjnych rozdziela się elektroforetycznie w żelu agarozowym, denaturuje do formy 1no niciowej i przenosi na filtr nitrocelulozy. DNa związany z nitrocelulozą zostanie poddany hybrydyzacji z sondą, którą jest 1no niciowy DNA wyznakowany 32P. Sonda hybrydyzuje, audioradiografia ujawnia położenie dupleksów (nić należąca do fragmentu restrykcyjnego i sondy DNA).
Metoda/Hybrydyzacja Northern (hyb.DNA-RNA). To samo co z DNA, ale tutaj jest RNA.
Metoda Wester (immunodetekcja białek na filtrach). Technika wykrywania określonych białek z wykorzystaniem swoistych przeciwciał.
Najczęściej sekwencjonuje się DNA przez kontrolowaną terminację replikacji
Kluczem do poznania kolejności zasad w DNA jest uzyskanie fragmentów, których długość zależy od ostatniej zasady w sekwencji. Można to uzyskać stosując kontrolowane przerywanie replikacji enzymatycznej (metoda dideoksy Sangera). Jest to prosta metoda. Ta sama procedura jest stosowana w 4rech mieszaninach reakcyjnych. We wszystkich wykorzystuje się polimerazę DNA, by utworzyć nić komplementarną do określonej sekwencji w 1no niciowej DNA. Syntezę inicjuje fragment DNA, syntezowany chemicznie, który jest komplementarny do części sekwencji poznanej w wyniku badań. Oprócz 4rech rodzajów trifosforanów deoksyrybonukleozydów (znakowanych promieniotwórczo), każda mieszanina zawiera małą ilość 2’,3’-dideoksyanalogu jednoego z 4rech nukleotydów (każdy jest inny).
Analog jest wbudowywany, bo uniemozliwia wydlużanie rosnącego łańcucha, bo nie ma grupy 3’-hydroksylowej, która jest niezbędna do wiązania fosfodiestrowego. Czasami polimeraza włącza własciwy nukleotyd, a czasmi jego analog, co prowadzi do zastopowania rekacji. I tu jest kupa, bo oni opisują włączanie do dATP, i wtedy tylko dideoksyanalog będzie włączany tam gdzie są tyminy, ale nie wiem czy to się odnosi do każdego czy tylko do dATP.
Cztery zbiory fragmentów o zakończonym łańcuchu poddaje się elektroforezie i odczytuje sekwencję zasad DNA z 4rech ścieżek na audioradiogramie.
Alternatywa, wydajniejsza niż audioradiografii to detekcja - znakowanie DNA znacznikami fluorescencyjnymmi. Każdy z 4rech typów dideoksyanalogów ma przyłączony marker fluorescencyjny -inna barwa dla każdego nukleotydu. Uzywanie takiej mieszaniny - umożliwia sekwencjonowanie w jednej reakcji, której produkty idą na elektroforezę. Określone fragmenty są wykrywane w żelu, na podstawie fluorescencji. Można tak określić na raz 500 zasad.
Metody syntezy na stałym podłożu pozwalają automatycznie syntetyzować sondy DNA i geny
1no niciowy DNA można syntezować przez kolejne dodanie aktywowanych monomerów do rosnącego łańcucha, związanego z nierozpuszczalnym podłożem. Aktywowane monomery to: protonowane 3’-fosfoamidyniany deoksyrybonukleozydu.
1szy etap: atom 3’-fosforu wchodzącej jednostki monomerycznej zostaje przyłączony do tlenu 5’ rosnącego łańcucha -> tworzy triester fosforynowy. Grupa 5’-hydroksylowa aktywowanego monomeru nie ulega reakcji, bo jest zablokowana dimetoksytritylową grupą ochronną (DMT), podobnie też 3’-fosforanowa, blokowana jest ϐ-cyjanoetylem (ϐCE). W podobny sposób są blokowane grupy aminowe puryn i pirymidyn.
2gi etap: Reakcja sprzęgania: W warunkach bezwodnych (woda reaguje z fosfoamidynianami). Triester fosforynowy (P jest 3rój wartościowe) jest utleniany za pomocą jodu -> daje triester fosfornowy, w którym P jest 5cio wartościowe.
3ci etap: Usunięcie ochronnej grupy DMT z końca 5’ rosnącego łańcucha za pomocą kwasu dichlorooctowego, który nie usuwa innych grup blokujących.
Wydłużony łańcuch DNa o 1ną jednostkę monomeryczną łańcucha DNA jest gotowy do następnej rundy xD Każdy cykl przyłączenia 1go monomeru trwa 10 minut, a elongacji ulega ponad 99% łańcuchów.
Chemiczna synteza, wykorzystująca stałe podłoża jest świetna do syntezy DNA i polipeptydów, ponieważ wymagany produkt pozostaje związany z nierozpuszczalnym podłożem aż do końcowego uwolnienia. Wszystkie reakcje zachodzą w jednym naczyniu, a przebieg reakcji w kierunku syntezy można wymusić nadmiarem dodawanych rozpuszczalnych odczynników. Nadmiar odczynników i uboczne produkty są usuwane przez przemycie podłoża czyli szklanych kuleczek xDXD.
W końcowym etapie: usunięcie wszystkich blokujących grup poprzez NH3, a oligonukleotyd zostaje odłączony od podłoża. Elongacja przebiega z różną wydajnością - więc DNA są różnej długości - najdłuższy projektowy.
Oczyszczanie: poprzez wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej lub elektroforezę w żelu poliakryloamidowym. Metoda zautomatyzowana - nawet DNA o dł. 100 nukleotydów.
Oligonuklotyd znakowany 32P lub znacznikiem fluorescencyjnym na jednym końcu można wykorzystać do wyszukania komplementarnej sekwencji w bardzo długim DNA, a nawet w całym genomie. Użycie oligonukleotydów jako sond DNA ma wielkie zastosowanie. Np. Sonda która tworzy sparowany odcinek ze znaną komplementarną sekwencją na chromosomie, może stanowić punkt wyjścia do poznania nieznanych sąsiednich. Taką sondę można wykorzystać jako starter do zainicjowania replikacji DNA przez polimerazę DNA.
Wybrane sekwencje DNA można wielkrotnie powielać stosując reakcję łańcuchową polimeryzaji PCR.
Mullis wynalzł to, w sensie PCR - metoda powielania określonych sekwencji DNA - rekacja łańcuchowa polimeryzacji. Chcemy jakąś tam sekwencję 2u niciowego DNA, która jest otoczona przez takie, które nas nie interesią. Możemy se uzyskać tą, którą chcemy w milionach, wtedy gdy znamy te, które nas nie interesią, a przylegają do tej pożądanej. Żeby przeprowadzić PCR musi dać do r-ru zawierającego docelową sekwencję DNA: 1)parę starterów - hybrydyzują z sekwencjami przylegającymi do tej NASZEJ 2)trifosforany wszystkich 4rech deoksyrybonukleozydów (dNTP) 3) termostabilną polimerazę DNA.
Cykl PCR składa się z 3 etapów.
1.Oddzielenie nici DNA - denaturacja. Dwie nicie wyjściowej DNA oddzielają się przez ogrzewanie r-ru w temp=95 stopni C, przez 15 sekund.
2.Hybrydyzacja starterów. Gwałtowne ochłodzenie do 54C. Jeden starter hybryd. z sekwencją przylegającą do końca 3’ sek.docelowej, a drugi też do 3’, ale nie do nici komplementarnej.
3. Synteza DNA (elongacja). Roztwór ogrzewa się do 72C - temp. optymalna dla polimerazy DNA Taq. Ta termostabilna polimeraza pochodzi od termofila - Thermus aquaticus, który żyje w żródłach termalnych. Polimeraza wydłuża sekwencję od starterów w kierunku sek.docelowej. Synteza DNA zachodzi na obu niciach i rozciąga się poza sek.docelową.
Można se to robić tak cyklicznie :) Po pierwszym -> dupleksy się podgrzewa i powstają 4 cząsteczki dwuniciowe. I znowu leci kolejny cykl. Na końcu 3go cyklu pojawiają się 2 krótkie nici, które składają się tylko z sek.docelowej i odcinków starterowych. Następne cykle -> powielanie sek.docelowej wykładniczo, podczas gdy dłuższe cząsteczki DNA są powielane liniowo i służą jako matryce do syntezy większej liczby krótkich fragmentów. Teoretycznie po n cyklach sek. jest powielna 2 do n razy, po 20 cyklach - milion, po 30 miliard. i to w czasie krótszym niż 1h.
Cechy tej metody:
1) sek.powielanego fragmentu DNA nie musi być znana, musimy znać przylegające
2) powielana sek. może być znacznie dłuższa niż startery
3) amplifikacja może zajść też wtedy kiedy startery nie są idealnie komplementarne do sek.otaczających
4) PCR jest wysoce specyficzną metodą, ponieważ hybrydyzacja starterów zachodzi w stostunkowo wysokiej temp. na dopasowanie startera ma wpływ temperatura i stężenie soli
5) jest to metoda niezwykle czuła, wykrywa nawet pojedyńczą cząsteczkę DNA
PCR jest potężnym narzędziem w diagnostyce medycznej, sądownictwie i w badaniu ewolucji molekularnej
W medycynie - stosując specyficzne startery można wykryć wirusy i bakterie, np. HIV 1, jeszcze jak normalnie wirus nie jest do wykrycia, bo nie doszło do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej, można wykryć też prątki gruźlicy, normalnie jest to strasznie trudne.Obiecująca metoda wykrywania nowotworów, mozna wykryć mutacje w genach Ras, można monitorować chemioterapię. Można stwierdzić wyeliminowanie komórek rakowych i zaprzestać podawania leków, bo ich już nie ma i również wznowić podawanie lekó, bo się pojawią. PCR też dobra do wykrywania białaczki spowodowanej rearanżacją chromosomów.
Kryminalistyka i sądownictwo - profil DNA poszczególnych osób jest wysoce swoisty - jest dużo zmiennych loci genetycznych. Np. zmienność locus zgodności tkankowej - HLA - decyduje o odrzuceniu przeszczepów. Amplifikacja ważna przy ustalaniu ojcostwa, krew i nasienie też rozpoznaje -> gwałty i inne brzydkie sprawy! IlośćDNA we włosie jest wystarczająca żeby zidentyfikować człeka.
DNA - niezwykle stabilna, zwłaszcza jak zabezpieczona przed powietrzem, światłem i wodą. Takie fragmenty mogą przetrwać tysiące lat. PCR jest idealną metodą powielania muzealnego DNA.
5.2 Technologia rekombinacji DNA zrewolucjonizowała wszystkie dziedziny biologii
Geny wprowadzone do komórek mogą ulegać transkrypcji i translacji.
Enzymy restrykcyjne i ligaza DNA są podstawowymi narzędziami w tworzeniu zrekombinowanych cząsteczek DNA
Jak się tworzy DNA w laboratorium? Fragment DNA, który nas interesuje łączymy z wektorem (też DNA). Każdy wektor może się autonomicznie replikować w odpowiednim gospodarzu.
U E.Coli jako wektory stosuje się plazmidy (koliste cząst. DNA pełniące funkcję chromosomów pomocniczych) lub wirusy (np. fag lambda). Wektor do połączenia nas z interesującym fragmentem DNA trzeba najpierw przygotować do akcji, czyli wziąć go rozciąć enzymem restrykcyjnym w specyficznym miejscu. Tu na przykład plazmid pSC101 jest rozcianany przez enzym EcoRI w jednym miejscu. Enzym ten rozcina DNA tak, że tworzą się jednoniciowe komplementarne końce, końce kohezyjne (tzw. Lepkie końce). Do tak rozciętego plazmidu można wprowadzić dowolny fragment DNA, jeśli ma takie same kohezyjne końce. Wprowadzany odcinek DNA można uzyskać przez rozcięcie większego fragmentu DNA używając tego samego enzymu restrykcyjnego co dla plazmidu.
Potem plazmid i wprowadzony fragment DNA łączony jest za pomocą ligazy DNA, która katalizuje powstanie wiązań fosfodiestrowych. Ligaza DNA potrzebuje wolnej grupy 3’-hydroksylowej oraz ufosforylowanej grupy 5’-OH. Wymaga też tego, żeby łączone odcinki DNA znajdowały się w obrębie dwuniciowej helisy. Energia potrzebna do ligacji pochodzi z ATP lub NAD+.
Metoda łączenia DNA przez kohezyjne końce ma zastosowanie dzięki chemicznie syntetyzowanym krótkim łącznikom DNA, tzw. linkerom, które mogą być rozcinane przez enzymy restrykcyjne. Najpierw łącznik, czyli ten linker jest przyłączany kowalencyjnie do końców fragmentu DNA lub wektora. Do dowolnej cząsteczki DNA można dołączyć kohezyjne końce, odpowiadające określonym enzymom restrykcyjnym. (przykład na rys. 5.11 strona 143)
Plazmidy i fag lambda są dogodnymi wektorami do klonowania DNA w bakteriach.
Plazmidy to dwuniciowe koliste cząsteczki DNA występujace naturalnie w niektórych bakteriach. Zawierają geny inaktywacji antybiotyków, wytwarzania toksyn i rozkładu naturalnych produktów. Te pomocnicze chromosomy mogą się replikować niezależnie od genomu gospodarza, ale w pewnych warunkach są zbędne. Komórka bakteryjna może w ogóle nie zawierać plazmidów, ale może też mieścić nawet 20 kopii jakiegoś plazmidu.
Plazmid pBR322
Najbardziej użyteczny do klonowania, zawiera geny oporności na tetracyklinę i ampicylinę (podobny do penicyliny). Plazmid można rozciąć w jednym miejscu przez endonukleazy i można tam wbudować fragment DNA. Insercja w miejsce rozpoznawane przez enzym EcoRI nie wpływa na geny oporności na antybiotyki, ale insercja w miejsca HindIII, SalI i BamHI inaktywuje gen oporności na tetracyklinę - taki efekt nazywamy INAKTYWACJĄ INSERCYJNĄ. Komórki zawierające pBR322 z insertem (wstawką DNA) są oporne na ampicylinę, ale wrażliwe na tetracyklinę i na tej podstawie można przeprowadzać ich selekcję. Komórki, które nie przyjęły wektora są wrażliwe na oba antybiotyki, natomiast te, które przyjęły wektor bez insertu są oporne na obydwa antybiotyki.
Plazmid pUC18
Zawiera miejsce inicjacji replikacji i marker selekcyjny nadający oporność na ampicylinę. Zawiera dodatkowo gen kodujący β-galaktozydazę. W obecności specyficznego analogu substratu enzym ten produkuje niebieski barwnik. Gen kodujący ten enzym ma rejon polilinkera, czyli sekwencję z wieloma unikatowymi miejscami restrykcyjnymi. Polilinker może być rozcinany jednym z wielu enzymów restrykcyjnych albo zestawem dwóch enzymów, co pozwala na wszechstronny dobór fragmentów DNA, które mogą być wklonowane do plazmidu. Insercja fragmentu DNA do polilinkera unieczynnia gen β-galaktozydazy. Komórki ze zrekombinowanym DNA można łatwo zidentyfikować, bo nie będą produkować niebieskiego barwnika.
Fag labmda
Może zniszczyć swojego gospodarza albo stać się jego częścią.
W trybie litycznym wszystkie funkcje wirusowe ulegają ekspresji: wirusowy DNA i białka są szybko produkowane i pakowane w cząstki wirusowe, co prowadzi do lizy komórki gospodarza i uwolnienia 100 potomnych cząstek wirusowych - wirionów.
W trybie lizogenicznym fagowy DNA ulega integracji z genomem komórki gospodarza i może razem z nim replikować przez wiele pokoleń, pozostając nieaktywnym. Zmiany w środowisku mogą wywołać ekspresję uśpionego wirusowego DNA i może on przejść w tryb lityczny.
Stworzono zmutowane fagi λ przeznaczone specjalnie do klonowania. Jednym z bardziej przydatnych jest fag λgt- λβ, zawiera dwa miejsca EcoRI zamiast standardowych pięciu. Po trawieniu EcoRI środkowy segment tak zmutowanego faga λ można usunąć. Dwa pozostałe fragmenty DNA (ramiona) stanowią 72% długości normalnego genomu. Taka ilość DNA to za mało do upakowania go w fag λ, bo upakowaniu ulegają cząsteczki DNA o długości 75-105% długości normalnego genomu. Troche tego nie rozumiem.. xD 105 %? XD Insert (wstawka) DNA o odpowiedniej długości wprowadzony między dwa ramiona fagowego DNA pozwala zrekombinowaną cząsteczkę DNA (93% normalnego długości) upakować w cząstkę fagową. Prawie wszystkie cząstki infekcyjne utworzone w ten sposób zawierają insert w postaci odcinka obcego DNA.
Zmodyfikowane wirusy jako wektory wnikają do bakterii znacznie łatwiej niż wektory plazmidowe. Zrobiono różne mutanty faga lambda, jeden z nich - kosmid może służyć jako wektor dla długich insertów DNA.
Sztuczne chromosomy bakteryjne i drożdżowe
Bardzo długie fragmenty DNA można namnażać w sztucznych chromosomach bakteryjnych (BAC) lub sztucznych chromosomach drożdżowych (YAC).
Wektory BAC są wysoce zmodyfikowaną wersją plazmidów koniugacyjnych F, które są zdolne do włączania insertów o długości nawet 300 kpz.
Wektory YAC mają centromer, sekwencję autonomicznej replikacji (ARS, gdzie rozpoczyna się replikacja), parę telomerów (typowych zakończeń chromosomów eukariotycznych), geny markerowe umożliwiające selekcję oraz miejsce klonowania. W wektorach YAC można klonować inserty nawet o długości 1000 kpz.
Poszczególne geny można klonować po enzymatycznym trawieniu genomowego DNA
Rozkmińmy, jak można klonować gen, występujący w genomie człowieka tylko w jednej kopii. Przygotowuje się dużą kolekcję (lub bibliotekę) fragmentów DNA, a następnie identyfikuje te, które zawierają poszukiwany gen.
Preparat zawierający wiele cząst. genomowego DNA poddaje się mechanicznej fragmentacji lub częściowemu trawieniu enzymami restrykcyjnymi i otrzymujemy duże fragmenty DNA. Rozdziela się to elektroforetycznie i izoluje fragmenty o długosci około 15 kpz. Do końca tych fragmentów przyłącza się linkery, tworzy lepkie(kohezyjne) końce i wprowadza do wektora, takiego jak fag λ, w którym przygotowano identyczne lepkie końce. Zrekombinowanymi fagami infekuj się komórkie E. Coli. Uzyskany w wyniku tego lizat zawiera fragmenty DNA człowieka, znajdujące się w na tyle dużej populacji zrekombinowanych fagów, żeby fragmenty te w sumie stanowiły prawie kompletny genom. Taką kolekcję fagów nazywamy biblioteką genomową.
Bibliotekę genomową przeszukuje się, by odnaleźć interesujący nas gen. Obliczenia pokazały, ze znalezienie poszukiwanej sekwencji w genomie człowieka z 99% prawdopodobieństwem wymaga przeszukania 500 000 klonów. Do szybkich metod przeszukiwania bibliotek nalezy hybrydyzacja DNA.
Rozcieńczona zawiesina zrekombinowanych fagów zostaje najpierw rozprowadzona na murawie bakteryjnej, tam gdzie fagi zainfekowały bakterie powstają łysinki - tam znajdują się klony identycznych fagów. Po nałożeniu filtra nitrocelulozowego na płytkę tworzy się replikę łysinek. Bakterie przyklejone do nitrocelulozy poddaje się lizie za pomocą NaOH, co powoduje denaturację DNA, dzięki czemu jest on podatny na hybrydyzację z sondą znakowaną 32P. Wykorzystując jako sondy znakowane cząsteczki DNA lub RNA komplementarne do poszukiwanych sekwencji, można wykryć na tak przygotowanej replice płytki obecność pojedynczej plamki zawierającej specyficzny DNA. Z wyjściowej próbki pobiera sie i namnaża fagi z odpowiedniej łysinki.
Taka metoda pozwala na wyizolowanie dowolnego genu, pod warunkiem że jest dostepna sonda do jego wykrycia. Skąd skołowac sondę? Mozna wyizolować mRNA z komórek mających go dużo. Np. prekursory czerwonych krwinek zawierając dużo mRNA hemoglobiny, a komórki plazmatyczne są bogate w mRNA przeciwciał. Informacyjny RNA izolowany z tych komórek można poddać frakcjonowaniu na podstawie długości, aby wzbogacić preparat w mRNA stanowiący obiekt zainteresowania. W warunkach in vitro można syntetyzować DNA komplementarny do tych mRNA i po sklonowaniu uzyskać wysoce specyficzną sondę.
Można przygotować tez sondę, jeśli znana jest część sekwencji aminokwasów białka kodowanego przez ten gen. Problemem jest to, ze sekwencję danego peptydu moze kodować wiele oligonukleotydów. Do konstrukcji sondy wybiera się takie peptydy, które zawierają tryptofan i metioninę, ponieważ te aminokwasy są kodowane przez pojedyncze kodony, podczas gdy pozostałe aminokwasy mają od dwóch do sześciu kodonów.
Wszystkie oligonukleotydy potencjalnie kodujące wybrany peptyd są syntetyzowane chemicznie na stałym podłożu, a następnie znakowane przez fosforylację końców 5’ izotopem fosforu 32P. Replikę płytki wystawia się na działanie mieszaniny tak przygotowanych sond i za pomocą audiografii identyfikuje klony, które zawierają sekwencje DNA komplementarne do użytych sond. Klony pozytywne (tj.tworzące hybrydy z sondą) są sekwencjonowane, by określić który z nich zawiera sekwencję odpowiadająca badanemu przez nas białku.
Przez bezpośrednie zmiany w DNA można tworzyć białka o nowych funkcjach
Technologia rekombinacji DNA umożliwia wprowadzanie specyficznych mutacji w warunkach in vitro. Można konstruować nowe geny wywołując zmiany w DNA: delecję, insercję lub substytucję.
Delecje
Specyficzną delecję można wywołać, rozcinając plazmid enzymem restrykcyjnym w dwóch miejscach, a następnie ponownie łącząc go w mniejszą cząsteczkę kolistą, ale to powoduje usunięcie dużego fragmentu DNA. Mniejszą delecję można uzyskać, rozcinając plazmid tylko w jednym miejscu, po czym końce liniowego DNA trawi się egzonukleazą usuwającą nukloeotydy w obu nici plazmidu. Skrócony DNA jest łączony z ligazą do formy kolistej, która nie zawiera krótkich odcinków DNA.
Substytucje: mutageneza sterowana przez oligonukleotydy
Załóżmy, że chcemy zastąpić resztę seryny cysteiną. Taką mutację można wprowadzić, jeśli:
1) dysponujemy plazmidem zawierającym gen lub cDNA kodujący białko, które chcemy zmienić;
2) znamy sekwencję nukleotydów rejonu DNA, który zamierzamy zmienić. Jesli interesująca nas seryna jest kodowana przez kodon TCT, to trzeba zmienic C na G by otrzymac kodon cysteinowy CGT. Taki typ mutacji to MUTACJA PUNKTOWA, bo się zmienia jeden nukleotyd.
Do tego trzeba przygotować oligonukleotydowy starter, komplementarny do zmienianego rejonu DNA, z wyjątkiem jednego zmienianego nukleotydu. Oddziela się obie nici od plazmidu i hybrydyzuje starter do nici komplementarnej.W odpowiedniej temperaturze niedopasowana jedna zasada jest tolerowana. Starter jest wydłużany przez polimerazę DNA i zamykany za pomocą ligazy DNA do dwuniciowej formy kolistej. Po replikacji powstaja dwa rodzaje potomnych plazmidów - jedna połowa z oryginalną sekwencją TCT, a druga ze zmutowaną sekwencja TGT. W wyniku ekspresji plazmidu zawierającego TGT powstanie białko mające cysteinę w miejscu jednej określonej seryny. MR. OBVIOUS
Insercje: mutageneza kasetowa
Plazmidowy DNA jest rozcinany dwoma enzymami restrykcyjnymi w celu usunięcia krótkiego fragmentu. W miejsce tego fragmentu wstawia się syntetyczny dwuniciowy oligonukleotyd (kasetę), który ma kohezyjne końce komplementarne do rozciętego plazmidu. Wszystkie cząsteczki potomne tego plazmidu bedą zawierały wprowadzoną mutację.
Projektowanie genów
Można łączyć segmenty genów kodujących domeny białkowe w nowych kombinacjach. Np. gen przeciwciała połączyć z genem toksyny i można uzyskać chimerowe białko zabijające komórki rozpoznawane przez przeciwciało. (są to immunotoksyny) Syntetyzując de novo DNA na stałym podłożu, mozna tworzyć zupełnie nowe geny. Można se stworzyć na przykład syntetyczną szczepionkę w postaci zrekombinowanego DNA tworzącego duże ilości nieinfekcyjnych białek otoczek wirusów.
5.3 Poznano i przeanalizowano sekwencje całych genomów
Genom mitochondrialny człowieka zbudowany jest z kolistej cząsteczki dwuniciowego DNA zawierającegj 16 569 par zasad, kodującej 2 rybosomowe RNA, 22 transportujące RNA i 13 białek.
Poznano kompletne sekwencje genomowe wielu organizmów - od bakterii do wielokomórkowych eukariotów
bakteria Haemophilus influenzae - 1995 rok, metoda typu ‘shotgun’ cokolwiek to jest, 1 830 137 par zasad, koduje 1740 białek
Saccharomyces cerevisiae - 1996r, 12 milionów par zasad, 16 chromosomów, koduje 6000 białek
Caenorhabditis elegans - 1998 r. 97 mln par zasad, koduje 19 000 genów
Ukończono sekwencjonowanie genomu człowieka
Szacowana liczba genów kodujących białka człowieka to 25 tysięcy. Najpierw zakładali, że jest ich więcej, ale większość z nich to tzw. pseudogeny, które kiedyś były genami funkcjonalnymi, ale w wyniku nagromadzenia mutacji nie ulegają już ekspresji. Dzięki takim mechanizmom, jak alternatywny splicing i potranslacyjne modyfikacje białek, wiele genów koduje więcej niz jedno białko. Genom człowieka zawiera dużo DNA, który nie koduje białek i jest TO WIELKA TAJEMNICA NASZYCH CZASÓW. Często obecność takich sekwencji wynika z istnienia ruchomych elementów genetycznych. W genomie człowieka występuje ponad milion kopii sekwencji Alu, każda o długości ok. 300 par zasad. Sekwencje Alu to krótkie rozproszone sekwencje powtórzone (SINE). Genom człowieka zawiera również blisko milion długich rozproszonych sekwencji powtórzonych (LINE), które mogą mieć długość 10 tysięcy par zasad.
Genomika porównawcza stała się potężnym narzędziem badawczym
Genom człowieka można badać, przez porównanie z genomami innych organizmów. Nasz genom w małym stopniu różni się od genomu myszy czy innych gryzoni (99%) xD
Genomika jest potężnym narzędziem badawczym zarówno do zrozumienia budowy genomu człowieka, jak i poznania głównych zjawisk związanych z powstawaniem rodzajów i gatunków.
Poziom ekspresji genów można badać w szerokim zakresie
Większość genów występuje w każdej komórce w tych samych ilościach ( w jednej kopii w kom. haploidalnej i dwóch kopiach w kom. diploidalnej) Za to poziom ekspresji (przez syntezowane mRNA) może się bardzo różnić - od braku, po setki kopii mRNA. Wzór ekspresji genów jest inny dla różnych typów komórek. Nawet w tej samej komórce poziom ekspresji ulega zmianom, w odpowiedzi na zmieniające się warunki fizjologiczne. Poziom mRNA CZASAMI koreluje z poziomem białek ulegających ekspresji.
METODA OPARTA NA HYBRYDYZACJI
-gdy znamy kompletną sekwencję genomu, możemy analizować wzór i poziom ekspresji wszystkich genów w określonej kom. lub tkance
-stosuje się zbiory gęsto ułożonych oligonukleotydów (mikromacierze/chipy DNA)
Jak uzyskać te mikromacierze:
(1) można je konstruować przez sterowaną światłem chemiczną syntezę oligonukleotydów z
wykorzystaniem fotolitograficznych technik mikroprzemysłowych, stosowanych w pordukcji
półprzewodników.
(2) naniesienie oligonukleotydów lub cDNA w postaci bardzo małych plamek na stałe podłoże
(np. szkiełko mikroskopowe). Następnie oligonukletydy hybrydyzuje się z fluorescencyjnie znakowanym cDNA, ujawniając poziom ekspresji każdego genu, identyfikowanego dzieki jego znanemu położeniu na chipie.
____________________________________________________________________________
5.4 TECHNIKI INŻYNIERII GENETYCZNEJ POZWALAJĄC PRECYZYJNIE MANIPULOWAĆ GENAMI EUKARIOTYCZNYMI
Geny eukariotyczne w uproszczonej formie można wprowadzać do bakterii, które mogą być wykorzystane jako fabryki wytwarzające potrzebny produkt białkowy. Możliwe jest również wprowadzenie DNA do organizmów wyższych. W przypadku zwierzą wprowadzenie obcego DNA stanowi narzędzie w badaniu działania genu i może być podstawą terapii genowej. W przypadku roślin wprowadzone geny mogą uodparniać rośliny na szkodniki, surowe warunki środowiska lub umożliwiać produkcję większej ilości składników odżywczych. Manipulacja genami niesie ze sobą wiele korzyści w medycynie, czy w rolnictwie, ale jest również źródłem wielu konrtowersji.
DNA syntetyzowany na matrycy mRNA (cDNA) może ulegać ekspresji w komórkach gospodarza
Większość genów ssaków jest mozaiką intronów i egzonów. Nieciągłe geny nie mogą ulegać ekspresji w bakteriach (bakterie nie mają aparatu katalizującego splicing pierwotnych transkryptów). Ale można to ominąć, wprowadzając do bakterii DNA komplementarny do dojrzałego mRNA. Przykładzik: Proinsulina jest syntetyzowana przez bakterie transformowane plazmidem, zawierającym DNA komplementarny do mRNA proinsuliny. Znaczną część insuliny produkują właśnie bakterie.
Kluczem do uzyskania DNA komplementarnego (cDNA) do mRNA jest enzym odwrotna transkryptaza. Retrowirusy wykorzystują ten enzym do tworzenia hybrydy DNA-RNA w trakcie replikacji swojego genemowego RNA. Odwortna transkryptaza syntetyzuje pod warunkiem, że w mieszaninie znajduje się starter DNA z wolną grupą 3’-hydroksylową. Jako starter można zastosować oligonukleotyd zbudowany z reszt tymidyny [oligo(T)]
Tworzenie dwunicowego cDNA (rys. 5.29 str. 153)
Odwortna transkryptaza ( w obecnoście trifosforanów czterech deoksyrybonukleozydów) syntetyzuje nić cDNA na matrycy mRNA, a po hydrolizie nici mRNA polimeraza DNA dobudowuje drugą nić do matrycy cDNA.
Kolekcja klonów ( biblioteka cDNA)
Nić RNA w hybrydzie RNA-DNA, można zhybrydyzować, podwyższając pH. (DNA jest odporny na hydrolizę alkaliczną). Jednoniciowy DNA przekształcany jest w formę dwuniciową przez utworzenie nowego miejsca starterowego [oligo(dC)]. Enzym transferaza terminalna dodaje nukleotydy ( np. kilkanaście reszt dG do końca 3’). Zastosowanie startera [oligo(dC)] wiążę się do reszt dG i pozwala rozpocząc syntezę drugiej nici DNA. Do dwuniciowego DNA dołącza się chemicznie syntetyzowane linkery, aby umożliwić ligację z odpowiednim wektorem. W ten sposób przygotowuje się cząsteczki DNA komplementarne do wszystkich mRNA, a następnie włącza się do wektorów i wprowadza do bakterii.
Wektory ekspresyjne => wektory, fagi, plazmidy umożliwiające efektywną ekspresję cząsteczek cDNA w komórkach
By uzyskać maksymalna transkrypcję, cDNA wprowadza się do wektora blisko silnego promotora bakteryjnego z zachowaniem poprawnej ramki odczytu. Wektory tego typu zapewniają efektywną translację (ponieważ w pobliżu kodonu inicjatorowego znajduje się miejsce wiązania mRNA do rybosomu). Klony cDNA mają zdolności do kierowania syntezą białka obcego dla bakterii będącej gospodarzem - wiec na tej podstawie można wykryć ich obecność.
By zidentyfikować kolonie bakterii zawierających wektor cDNA ( kodujący jakieś białko) używa się promieniotwórczych przeciwciał, swoistych wzgledem tego białka.
-kolonie bakterii poddaje się lizie w celu uwolnienia białek wiązących się z filtrem nitrocelulozowym
-dodawane są przeciwciała znakowane I 125 (rozpoznają interesujace nas białko)
-za pomocą autoradiografii odnajduje się umiejscowienie kolonii
-stosuje się tylko w przypadkach gdy białko ulega ekspresj i dostępne jest odpowiednie przeciwciało
Nowe geny wprowadzone do komórek eukariotycznych mogą ulegać wydajnej ekspresji
Sposoby na wprowadzenie zrekombinowanych cząsteczek DNA:
(1) komórki zwierzęce pobierają cząsteczki DNA strąconego fosforanem wapnia. Wydajność jest stosunkowo mała, ale łatwa :)
(2) mikroiniekcja DNA do komórek. DNA wprowadza się bezpośrednio do jądra kom. za pomocą szklanej mikropipety. 2% kom. mysich przeżywa i zawiera nowy gen
(3)stosowanie wirusów, najefektywniejszymi wektorami są retrowirusy. Informacja genetyczna jest przekazywana w kierunku odwrotnym. Genom retrowirusów (dwunicowy helikalny DNA) zostaje wbudowany w przypadkowe miejsca chromosomowego DNA. Wirusowy genom (prowirusowy DNA) w kom. gospodarza może ulegać ekspresji i replikacji razem z normalnym. Retrowirusy nie zabijają swoich gospodarzy.
(3’) wirus krowianki - hamuje syntezę białek gospodarza
(3’’) Bakulowirusy - infekują kom. owadów. Larwy służa jako fabryki białka. Wydajna ekspresja
Geny wprowadzone do komórek zarodkowych ulegają ekspresji w transgenicznych zwierzętach
Gigantyczna mysz powstała w wyniku wprowadzenia do zapłodnionej komórki jajowej szczurzego hormonu wzrostu (somatotropiny) niedobór hormanu -> karłowatość, nadmiar ->gigantyzm. Gen szczurzego hormonu umieszczono w plazmidzie pod kontrolą promotora genu mysiej metalotioneiny (duże powinowactow do metali ciężkich). Promotor ten normalnie występuje w chromosomie kontrolując transkrypcję genu metalotioneiny. synteza tego białka ochronnego zachodzi w wątrobie, indukowana jest jonami metali ciężkich. Mysz piła sobie wodę z kadmem. Udowodniono, więc, że obcy gen pod kontrolą nowego promotora w kom. ssaków ulega integracji i wydajnej ekspresji.
Uszkodzenie genu prowadzi do poznania jego funkcji
bo obserwuje się powstałe w rezultacie zaburzenia. Metody uszkadzania genów opierają się na procesie rekombinacji homologicznej. W trakcie tego procesu rejony DNA wykazujące duże podobieństwo sekwencji wymieniają swoje segmenty. Obcy DNA wprowadzony do kom. może więc uszkodzić każdy gen, który choć częściowo jest do niego podobny. Wykorzystaną ją w badaniu funkcji genów kodujących białka regulatorowe genów (czynniki transkrypcyjne) kontroluja one różnicowanie się komórek mięśniowych. Jeżeli uszkodzone były obie kopie genu kodującego białko miogeninę, zwierzę umierało przy narodzinach (brak mięśni szkieletowych).
Ciekawostka: Myszy heterozygotyczne, mające 1 poprawną kopię genu,a drugą uszkodzoną wydawały się normalne. ( czyli poziom ekspresji genu nie ma zasadniczego wpływu na jego funkcjonowanie)
Interferencja RNA jest nowym narzędziem wyciszania ekspresji genów
Wprowadzenie do komórki swoistej cząsteczki dwuniciowego RNA hamuje (zaburza) ekspresję genów, zawierających sekwencję obecne w tym RNA.
(1) wprowadzenie dwuniciowego RNA
(2)rozcinanie na fragmenty wprowadzonego RNA (ok 21 nukleotydów) enzym Dicer
Każdy framgent ma 19 pz dwuniciowego RNA + 2 niesparowane nukleotydy na kązdym z
końców 3’. Określa się je jako małe interferencyjne RNA (siRNA)
(3)siRNA są włączane do kompleksu enzymatycznego określanego jako kompleks wyciszający
indukowany przez RNA (RISC)
(4) dochodzi do usunięcia jednej nici RNA, druga pozostaję w kompleksi
(5)Kompleks z jednoniciowymi fragmentami RNA naprowadza cząsteczkę RISC, umozliwiając
rozpoznanie i rozcięcie docelowych cząsteczek mRNA, które zawierają sekwencje
komplementarne so siRNA. Gwałtowne zmniejszenie liczby cząsteczek docelowego mRNA
u C.elegans interferencja RNA jest bardzo wydajna. Można ją wywołać karmiąc nicienia zmodyfikowanymi szczepami E. coli, produkującymi dwuniciowe cząsteczki RNA.
Bakterie glebowe Agrobacterium tumefaciens zakażają rośliny i wprowadzają do nich obce geny. W miejscu infekcji pojawia się guzowata narośl zmienionej tkanki. W naroślach dochodzi do syntezy opin, które sa pochodnymi aminokwasów. Metabolizm rośliny jest przestawiony tak, żeby odżywiać intruza. Polecenie tworzenia guza i syntezy opin jest przekazywane za pośrednictwem plazmidów Ti występujących w Agrobacterium. Niewielka część plazmidu Ti zostaje zintegrowana z genomem kom. roślinnej i część ta o dł. 20 kz to T-DNA.
Można sobie trzaskać wektory do wprowadzania obcych genów do komórek roślinnych przy pomocy pochodnych tych plazmidów Ti. Odcinek obcego DNA wbudowuje się za pomocą enzymów restrykcyjnych i ligazy do rejonu T-DNA małego plazmidu. Następnie syntetyczny plazmid zostaje wprowadzony do kom. Agrobacterium z naturalnymi plazmidami Ti, przez rekombinację w bakteriach tworzy się plazmid Ti zawierający obcy gen. Wektory takie działają wydajnie w przypadku roślin dwuliściennych (winorośl) i niektórych jednoliściennych, ale ważne gospodarczo jednoliścienne nie dają się transformować przy pomocy plazmidów Ti.
Elektroporacja to metoda wprowadzania obcego DNA do jednoliściennych zbóż, oparta na stosowaniu silnego pola elektrycznego. Za pomocą celulazy usuwa się celulozowe ściany komórkowe, otrzymujemy protoplasty, czyli komórki otoczone tylko błoną komórkową. Następnie zawiesinę protoplastów zawierającą plazmidowy DNA poddaje się działaniu impulsów elektrycznych. Pod wpływem pola elektrycznego błony kom. stają się częściowo przepuszczalne dla dużych cząsteczek i plazmidowe DNA mogą wniknąć do wnętrza. Odtwarza się ścianę komórkową.
Mikrowstrzeliwanie DNA / Transformacja przez bombardowanie ( XDX XDXD) najbardziej efektywna metoda transformowania komórek roślinnych, kuleczki wolframowe opłaszczone DNA są wstrzeliwane do docelowych komórek z prędkością większą niż 400 m/s. Technika ta stworzyła możliwość uzyskania GMO.
Pierwszą rośliną GMO na rynku buły pomidory o opóźnionym dojrzewaniu. Wprowadzono im DNA uszkadzające gen poligalaktouronazy, który odpowiadał za rozkład polisacharydów czyniących pomidorasa dłużej twardym.
Terapia genowa jest obiecującym narzędziem medycyny
Celem tej terapii jest uzyskanie korzystnych zmian w organizmie w wyniku ekspresji swoistych genów. Polega na modyfikowaniu genów chorego, zawierających wariant sekwencji wywołujący szkodliwe konsekwencję.
Progres!!
(1) uszkodzenie genu deaminazy adenozynowej - ciężki złożony niedobór odporności (SCID), szczególne narażenie na infekcje. Funkcjonalne genu deaminazy wprowadzono do organizmów pacjentów, w wyniku terapii z zastosowaniem wektorów - retrowirusów. Zmodyfikowane kom. produkowały funkcjonalny enzym, redukując objawy. Ale nadal potrzebne są badania, by przedłuzyć efekty terapeutyczne i eliminowanie niepożądanych skutków ubocznyc.