Wykład 3

Zmiany aktywności genomu mogą być spowodowane modyfikacjami chemicznymi nie tylko cząsteczek białek, ale również samego DNA. Zmiany kowalencyjne w DNA głównie prowadzą do wyciszenia aktywności transkrypcyjnej. Przykładem takiej zmiany jest metylacja.

Metylacja - zachodzi głównie u Eucaryota, metylowana jest cytozyna poprzez wprowadzenie grupy metylowej w pozycję 5’. Enzymy odpowiedzialne za to to metylotransferazy. U kręgowców 10% cytozyn jest metylowanych. Modyfikacja nie dotyczy wszystkich reszt cytozyny, ale reszt występujących w pewnych sekwencjach.

U kręgowców jest to C-G

U roślin – CnG, gdzie n to dowolna reszta aminokwasowa.

Wyróżniamy 2 rodzaje metylacji:

1. Zachowawcza – zachodzi replikacja semikonserwatywna, sprowadza się do tego, że w nowo powstałych cząsteczkach jest odtwarzany wzór metylacji cząsteczki pierwotnej. Po replikacji DNA przyłączane są grupy metylowe do nowo zsyntezowanej nici DNA w miejscach komplementarnych do miejsc metylowanych w nici rodzicielskiej. Dzięki niej wzór metylacji jest zachowywany w cząsteczkach potomnych. Stanowi to o tym, które geny mają być ekspres jonowane lub nie. Zachowanie wzorca powoduje to, że komórki potomne mają ten sam rodzaj wzorca.

2. de novo – dotyczy nowych miejsc, które podlegają modyfikacji przez metyzację.

Metylotransferazy DNA są podobne do siebie. Metylacja zachodzi głównie o Eucaryota, ale pewien rodzaj metylacji zachodzi u Procaryota – materiał genetyczny jest etylowany, aby uchronić go przed degradacją, np.: przez enzymy restrykcyjne.

Gen odpowiedzialny za metyzację zachowawczą – Dnmt1

Dnmt3a i Dnmt3b – geny konieczne do przeprowadzenia metylacji de novo. Metylacja de novo jest krytycznym procesem, istotnym dla komórki i całego organizmu.

Funkcje metylacji

Obie metylacje skutkują represją aktywności genów (zahamowanie transkrypcji). Analizy wzorów metylacji pokazały, że geny, które są aktywne, są położone tam, gdzie fragmenty nie są etylowane.

U ludzi 40-50% genów jest położonych blisko wysp CpG, gdzie p oznacza resztę fosforanową. Wyspy te są to fragmenty DNA, o dł. 200 par zasad, które zawierają względnie dużo reszt C-G. C+G = >50%

Aktywność transkrypcyjna tych genów jest skorelowana z poziomem metylacji wysp CpG. Jeżeli te wyspy są metylowane, to gen położony w pobliżu nich jest nieaktywny transkrypcyjnie.

Przykłady :

- geny metabolizmu podstawowego

- geny, których ekspresja jest specyficzna tkankowo.

Zespół ICF – niestabilność centromerów związana z niedoborem immunologicznym. Wywołuje liczne zmiany fenotypowe + silny niedobór immunologiczny + niestabilność centromerów. Jest on skorelowany z niskim poziomem metylacji, który jest skutkiem metylacji w genie odpowiedzialnym za metylotransferazę – gen Dnmt3b

Jak to się dzieje?

Proces ten jest powiązany z białkami wiążącymi sekwencje CpG. Do zmetylowanych sekwencji niekowalencyjnie (odwracalnie) przyłączają się białka wiążące zmetylowane sekwencje CpG. Zachodzi deacetylacja, ponieważ białka te są składnikami kompleksów zawierających deacetylazy. Po deacetylacji chromatyna zmienia swój stopień upakowania – wycisza się aktywność transkrypcyjna.

Znaczenie metylacji:

1. piętnowanie genomowe (imprinting genomowy) – proces zachodzi głównie u ssaków. W jądrze diploidalnym ulega ekspresji tylko jeden z pary genów na chromosomach homologicznych. Ekspresja 2 genu jest wyciszana na skutek metylacji. Z pary genów homologicznych zawsze ten sam gen podlega inaktywacji. 60 genów u człowieka i myszy podlega piętnowaniu. Są to geny nie tylko kodujące białka, ale również kodujące funkcjonalne RNA. Proces ten jest kontrolowany przez specyficzne sekwencje. Proces ten wiąże się też z problemem zapłodnienia pozaustrojowego (zapłodnienie in vitro). Wzorce metylacji i piętnowanie są wnoszone przez komórki płciowe. Krytycznym dla utrzymania prawidłowego wzorca okresem jest krótki okres po zapłodnieniu – okres najwcześniejszego rozwoju.

2. Inaktywacja chromosomu X – szczególny przypadek piętnowania, prowadzący do prawie całkowitej inaktywacji jednego z chromosomu X u ssaków u samicy.

Chromosom Y to taki chromosom X bez małego kawałka =D

Wyciszony chromosom X jest widoczny w jądrze jako ciałka Barra – składa się głownie z heterochromatyny. Ok. 20% genów jest aktywna. Inaktywacja chromosomu X zachodzi w bardzo wczesnym etapie rozwoju zarodkowego. Jest regulowana przez centrum inaktywacji chromosomu X – Xc. Jest to rejon na każdym chromosomie X, na wczesnym etapie rozwoju zarodkowego ulega aktywacji.

Wytwarza się heterochromatyna od tego centrum i rozprzestrzenia się na cały chromosom. Proces ten trwa kilka dni. Zależy on od genu w centrum inaktywacji (Xist)podlega on na początku transkrypcji – powstaje niekodujący RNA – pokrywa chromosom. Towarzyszy temu formowanie heterochromatyny. Zachodzą również inne procesy np.: metylacja lizyny 9 na histonie 3, często obserwuje się deacetylację histonu 4.

Histon H2A – jest zastępowany przez macroH2A. obserwuje się hipermetylację niektórych histonów.

W komórce diploidalnej samicy jeden z chromosomów X jest inaktywowany, drugi jest aktywny. Jeżeli jest tylko jeden chromosom X – nie podlega on inaktywacji. Jeżeli 3 – to 2 ulegają inaktywacji.

Fenotypowo inaktywacja chromosomu może się również przejawiać, np.: u kobiet w pewnych komórkach może być obserwowany fenotyp chorobowy, a inne mogą wykazywać fenotyp typu dzikiego, np.: hemofilia, bielactwo.

Replikacja genomu

Informacja genetyczna musi być replikowana.

Problem topologiczny – problem związany z semikonserwatywną replikacją.

Są 3 możliwe modele replikacji:

- rozproszony – wymaga przerwania ciągłości cząsteczki DNA

- semikonserwatywny

- konserwatywny – cząsteczka nie ulega rozpleceniu, a nowa jakoś się syntetyzuje przez aparat replikacyjny.

Replikacja jest semikonserwatywna i wymaga rozwinięcia cząsteczki DNA. Kluczem są topoizomerazy – enzymy zdolne na drodze katalizy do przecinania i łączenia łańcuchów DNA. Wyróżnia się 2 klasy topoizomeraz:

1. Typu I – wprowadzają nacięcie do jednego z łańcuchów polipeptydowych, drugi łańcuch jest przesunięty przez to przecięcie i dochodzi do lokalnego rozplecenia. Substratem może być tylko pojedyncza nić DNA

2. Typu II – przecinają jednocześnie oba łańcuchy podwójnej helisy, stwarza to przejście, gdzie cały fragment DNA może być przesunięty.

Jeden koniec przeciętego łańcucha jest zawsze związany kowalencyjnie z topoizomerazą przez co jest zablokowany.

Topoizomerazy nie rozcinają podwójnej helisy. Likwidują napięcie torsyjne. Dzięki tym enzymom następuje lokalne rozwinięcie, bez konieczności rozwijania całej cząsteczki.

Widełki replikacyjne – miejsce gdzie zachodzi replikacja.

Replikacja DNA nie jest jedynym proces, gdzie topologia podwójnej helisy jest istotna i topoizomerazy odgrywają główną rolę. Topoizomerazy są istotne tam, gdzie następuje zwijanie i rozwijanie DNA. (transkrypcja, rekombinacja DNA). Topoizomerazy są również jednym z podstawowych składników matriks jądrowej.