Potranskrypcyjne wyciszanie ekspresji genów - interferencja RNA

Proces interferencji RNA, odkryty kilka lat temu, został okrzyknięty przez "Science" przełomem 2002 roku. Mechanizm potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genów, w którym udział biorą małe dwuniciowe cząsteczki RNA stał się nadzieją dla terapii genowej na efektywne leczenie chorób genetycznych, w których dochodzi do niepożądanej ekspresji konkretnych genów.

Rola przypadku w odkryciach naukowych, czyli jak doszło do odkrycia siRNA

Wiele odkryć naukowych zawdzięczamy przypadkowi, tak też było z odkryciem siRNA. Wszystko zaczęło się na Uniwersytecie Arizona, gdzie grupa naukowców, w skład której wchodzili Carolyn Napoli, Christine Lemieux i Richard Jorgensen, planowała wyhodować odmianę petunii (Petunia hybryda) o kwiatach barwy ciemniejszej od odmiany pospolitej. Logicznym podejściem do tego planu było przeprowadzenie doświadczenia, polegającego na dodaniu dodatkowej kopii genu kodującego enzym odpowiedzialny za syntezę fioletowego barwnika (syntaza chalonowa). Jakże wielkie było zdziwienie naukowców, gdy w wyniku doświadczenia otrzymali petunię o kwiatach nie dość, że barwy jaśniejszej od pospolitej odmiany, to jeszcze zawierających białe plamy. W niewytłumaczalny i niezrozumiały wówczas sposób doszło do zahamowania syntezy barwnika, po wcześniejszym dodaniu kopii genu dla enzymu, którego funkcją jest jego synteza. Chcąc rozwikłać tę zagadkę, badacze zmierzyli w komórce roślinnej petunii poziom mRNA genu, którego dodatkową kopię dodali. Okazało się, że poziom mRNA tego genu spadł, co z jednej strony było zaskoczeniem, a z drugiej tłumaczyło to efekt doświadczenia. W jaki zatem sposób doszło do wyciszenia ekspresji genu po tym jak dodano jego dodatkową kopię?

Przez 10 lat zagadka ta pozostawała niewyjaśniona. Wytłumaczenie jej przyszło dopiero wtedy, gdy kolejna grupa naukowców, pracująca nad nicieniem Caenorhabditis elegans, odkryła, że iniekcja dsRNA wycisza ekspresję genu, którego mRNA zawiera sekwencję komplementarną do wprowadzonego dsRNA. W ten sposób dowiedziano się, że dsRNA jest kluczowym obiektem w mechanizmie wyciszania ekspresji genów, który nazwano interferencją RNA.

Interferencja RNA jest to więc proces wyciszania ekspresji genów, w którym główną rolę odgrywa dsRNA o sekwencji komplementarnej do fragmentu sekwencji mRNA genu, który jest w tym procesie wyciszany. Wyciszanie ekspresji genów w tym mechanizmie jest rezultatem cięcia i degradacji mRNA albo zablokowania translacji nietkniętego mRNA. Cząsteczki dsRNA, które biorą w tym procesie udział, są krótkie, mają około 20pz długości i noszą nazwę siRNA - small interfering RNA.

Mechanizm działania siRNA

Gdy długie cząsteczki dsRNA wejdą do środka komórki, są rozpoznawane przez enzym Dicer, należący do rodziny dsRNaz III (dsRNA-specyficzne endonukleazy). Cięcie przez enzym Dicer generuje krótkie dsRNA, tzw. siRNA, których cechą charakterystyczną jest wystający dwunukleotydowy odcinek na 3'końcu obu nici siRNA. U nicieni, owadów i ssaków siRNA tworzy rybonukleinoproteinowy kompleks RISC (RNA-induced silencing complex), w którego skład wchodzi niezidentyfikowana jak dotąd nukleaza nazwana `Slicer'. Utworzony kompleks RISC na początku prowadzi do rozwinięcie dwuniciowego siRNA, które wchodzi w jego skład, tak że nić sensowna siRNA oddziela się od kompleksu, a pozostaje w nim jedynie nić antysensowna siRNA. Następnie kompleks RISC skanuje znajdujące się w komórce mRNA i gdy nić antysensowna siRNA znajdzie sekwencję do siebie komplementarną na mRNA, przyłącza się do niej na zasadzie parowania zasad. Kolejny krok podejmuje "Slicer", który katalizuje cięcie mRNA dokładnie w połowie fragmentu komplementarnego do siRNA. Przecięty mRNA jest następnie rozpoznawany przez komórkę jako „anormalny” i ostatecznie degradowany, co zapobiega jego translacji, a tym samym wycisza ekspresję genu, na matrycy którego był transkrybowany. Dodatkowo u roślin „anormalny” mRNA może służyć jako matryca dla RNA-zależnej polimerazy RNA (RDRP), która „dopisuje” do niego nić antysensowną, generując tym samym nowe cząsteczki dsRNA, mogące następnie służyć jako substraty dla enzymu Dicer. U niektórych organizmów posiadających endogenny mechanizm interferencji RNA (grzyby, rośliny, nicienie, ssaki) istnieje jeszcze inny mechanizm amplifikacji siRNA. Polega on na tym, że powstałe po aktywności Dicera siRNA zamiast wejść w skład kompleksu RISC, ulegają rozwinięciu do dwóch jednoniciowych cząsteczek ssRNA, przyłączają się do odpowiedniego mRNA w sposób komplementarny i służą jako starter dla polimerazy RDRP, która może wtedy katalizować dobudowę nici antysensownej do nici mRNA, produkując nowe długie dsRNA, która mogą stanowić substrat dla enzymu Dicer.

Rysunek 1. Mechanizm działania siRNA. Gdy dsRNA wejdzie do komórki, jest rozpoznawane i cięte przez enzym Dicer, w wyniku czego powstają krótkie cząsteczki siRNA charakteryzujące się dwoma wystającymi dwunukleotydowymi odcinkami na końcach 3' obu nici. siRNA wiąże się z białkami formując kompleks RISC i w tym kompleksie dwuniciowe siRNA jest rozwijane. Nić antysensowna siRNA pozostaje w kompleksie RISC i skanuje cząsteczki mRNA w poszukiwaniu fragmentu o sekwencji komplementarnej. Gdy taki fragment znajdzie, wiąże się z nim na zasadzie parowania zasad. Enzym "Slicer" rozcina mRNA dokładnie w środku fragmentu komplementarnego i tak rozcięty mRNA jest ostatecznie degradowany przez nukleazy komórki.

Po co komórkom endogenny proces interferencji RNA?

W komórkach roślinnych mechanizm interferencji RNA służy obronie przeciwko wirusom. Niektóre rodziny wirusów posiadają materiał genetyczny w postaci dsRNA. Po wtargnięciu do komórki gospodarza wirusy takie mogą aktywować mechanizm interferencji RNA skierowany przeciwko nim. Proces ten coraz częściej jednak zawodzi, gdyż w toku ewolucji wirusy nauczyły się chronić przed procesem RNAi np. poprzez inaktywację enzymów biorących w tym procesie udział.

Mechanizm interferencji RNA komórka wykorzystuje również w walce z transpozonami. Traspozony, nazywane również skaczącymi genami, są to fragmenty DNA, które potrafią przemieszczać się po genomie w procesie zwanym transpozycją. Pierwsza klasa transpozonów, tzw. retrotranspozony, do zmiany lokalizacji w genomie wymaga przepisania na RNA, a następnie powtórnego przepisania na DNA przez odwrotną transkryptazę i wklejenia do genomu. Proces interferencji RNA, stojący na straży integralności genomu, hamuje skakanie transpozonów poprzez degradację RNA powstającego po transkrypcji transpozonu, co zapobiega powrotnemu przepisaniu RNA na DNA i wklonowaniu retrotranspozonu do genomu. Ponadto proces interferencji RNA pełni rolę w endogennej regulacji ekspresji genów, w czym udział biorą małe cząsteczki RNA o strukturze spinki do włosów, tzw. miRNA (mikroRNA), kodowane w genomie.

siRNA molekularnym narzędziem w terapii genowej

siRNA jako kluczowa molekuła w mechanizmie wyciszania genów stał się obiektem wielkiego zainteresowania naukowców zajmujących się terapią genową. Zaczęto prace badawcze nad zastosowaniem procesu wyciszania ekspresji genów z udziałem siRNA w chorobach wirusowych, neurodegeneracyjnych, nowotworowych oraz autoimmunologicznych, czyli w chorobach, w których supresja ekspresji genów może przynieść pozytywny skutek.

W przypadku chorób wirusowych wywołanych przez wirus grypy, polio, HIV czy wirusy zapalenia wątroby typu B i C, terapia genowa z udziałem siRNA miałaby polegać na wyciszaniu ekspresji genów pochodzących od wirusa lub na wygaszeniu ekspresji genów gospodarza, które umożliwiają replikację i prawidłowy przebieg cyklu życiowego wirusa.

Jeżeli chodzi o terapię chorób neurodegeneracyjnych to możliwym jest, że poważne choroby takie jak choroba Alzheimera, Parkinsona czy Huntingtona będą w przyszłości uleczalne właśnie za sprawą wprowadzenia siRNA do terapii genowej tych chorób. Obecnie prowadzone są intensywne prace nad leczeniem pląsawicy Huntingtona, choroby genetycznej centralnego układu nerwowego, której pierwsze objawy pojawiają się ok. 30-40 roku życia i są to niekontrolowane ruchy kończyn, drgawki, zaburzenia umysłowe, utrata kontroli ruchowej. Przyczyna tej choroby tkwi w mutacji dynamicznej genu kodującego białko huntingtoninę, którego locus znajduje się na chromosomie czwartym. Mutacja ta polega na wydłużaniu ciągu powtórzeń trójnukleotydowych CAG w obrębie tego genu, czego efektem jest synteza wadliwego białka. Białko huntingtonina to białko cytoplazmatyczne ulegające ekspresji również poza układem nerwowym. Jako że jego funkcja nie została jak dotąd poznana, nie znany jest też mechanizm patogenezy choroby Huntingtona, choć wiadomym jest, że ma on związek z wcześniej wspomnianą mutacją. Terapia genowa z udziałem siRNA testowana na myszach spowodowała efektywne wyciszenie ekspresji zmutowanego genu, czego rezultatem było zahamowanie rozwoju choroby.

Choroby nowotworowe są powodowane przez nagromadzenie się wielu mutacji w różnych genach. Nie są to więc choroby monogenowe, a też odmian raka jest bardzo wiele. Naukowcy starają się jednak znaleźć geny uniwersalne dla wszystkich rodzajów nowotworów, takie, których wygaszenie przyniosłoby pozytywny skutek w walce z komórkami rakowymi namnażającymi się poza wszelką kontrolą. Takimi genami mogłyby być np. geny naprawiające DNA, których wyciszenie uniemożliwiłoby komórkom rakowym regenerację po chemioterapii czy radioterapii. Innym potencjalnym targetem dla siRNA mogłyby być geny nadające komórkom nowotworowym znamiona nieśmiertelności.

Choroby autoimmunologiczne z kolei są wynikiem błędnego skierowania ataku układu odpornościowego przeciwko własnym komórkom, czego przyczyna tkwi w nieprawidłowościach w uzyskiwaniu kompetencji przez limfocyty w narządach limfoidalnych. Jak dotąd udało się zahamować zapalenie wątroby o podłożu autoimmunologicznym u myszy za pomocą terapii genowej opartej na siRNA.

Obiecujące efekty badań przyniosła terapia genowa choroby degeneracyjnej plamki żółtej prowadzona za pomocą leku Sirna-027, który jest obecnie w pierwszej fazie badań klinicznych. Choroba ta objawia się tworzeniem nieprawidłowych naczyń krwionośnych, które narastają w poprzek środkowej części siatkówki (plamki żółtej), doprowadzając ostatecznie do zniszczenia widzenia centralnego. Aby temu zapobiec należałoby zahamować ekspresję genu kodującego VEGF (czynnik wzrostu śródbłonka naczyń) albo jego receptor. Lek Sirna-027 jest chemicznie zmodyfikowanym siRNA skierowanym przeciwko genowi kodującemu receptor dla czynnika VEGF - VEGFR-1. Na etapie badań przedklinicznych tego leku wykazano, że Sirna-027 efektywnie zahamował neowaskularyzację w siatkówce oka, co wielu ludziom może dać w przyszłości szansę na poprawę pogarszającego się wskutek choroby degeneracyjnej plamki żółtej wzroku.

Rysunek 2. Zdjęcia pokazujące jak terapia z wykorzystaniem Sirna-027 hamuje destrukcyjny przyrost naczyń krwionośnych w siatkówce oka myszy.

Metody wprowadzania siRNA do komórki

By móc myśleć o siRNA jako o nowym molekularnym narzędziu w terapii genowej, należy zacząć od efektywnego wprowadzenia siRNA do komórek organizmu. Istnieje kilka takich metod. Po zaprojektowaniu odpowiedniej sekwencji siRNA (najczęściej o długości 21 nukleotydów) przeciwko genowi, którego ekspresję chcemy zahamować, można zsyntetyzować dwa oligonukleotydy DNA, jeden kodujący nić sensowną siRNA, a drugi nić antysensowną i przeprowadzić ich transkrypcję in vitro. Otrzymamy wówczas dwie pojedyncze nici RNA, które można następnie zhybrydyzować dostając tym samym siRNA gotowe do transfekcji. Można też zastosować bardziej efektywne sposoby generacji siRNA, a mianowicie transkrypcję siRNA in vivo. Osiągnąć to można przez wykorzystanie wektorów ekspresyjnych - plazmidów z wklonowanym odcinkiem DNA kodującym siRNA przeciwko genowi, którego ekspresję chcemy wyłączyć.

Rysunek 3. Wektor ekspresyjny pSilencer zawierający promotor CMV dla polimerazy II, sygnał terminacji transkrypcji - poly(A), gen oporności na hygromycynę (gen selekcyjny) oraz gen oporności na ampicylinę, dzięki któremu możliwe jest namnożenie wektora ekspresyjnego w bakteriach.

Takimi wektorami transfekuje się komórkę, także do transkrypcji dochodzi już w jej wnętrzu. Powstają wówczas krótkie jednoniciowe cząsteczki RNA o strukturze spinki do włosów, które są następnie rozpoznawane przez enzym Dicer i przecinane na obu końcach, w wyniku czego powstają dwuniciowe siRNA. Tak wygenerowane małe cząsteczki interferującego RNA łączą się z odpowiednimi białkami tworząc kompleks RISC i są zdolne do wygaszania ekspresji genu docelowego.

Podsumowanie

Ostatnimi czasy, pole badań nad procesem interferencji RNA było jednym z najszybciej rozwijających się obszarów w nauce. Pełny wymiar korzyści płynących z odkrycia siRNA będziemy zapewne mogli poznać w niedalekiej przyszłości. Dziś wiadomo na pewno, że odkrycie to otworzyło kolejną ścieżkę terapii genowej i dało nadzieję wielu ludziom na przełom w medycynie. Odkrycie to również potwierdziło fakt, jak dalece wyrafinowanym tworem jest organizm, jak wiele mechanizmów wykształciło się w nim w procesie ewolucji, by mógł on jako całość działać jak najdoskonalej.

Link Nature -interferencja RNA

http://search.nature.com/search/?sp_a=sp1001702d&sp_sfvl_field=subject%7Cujournal&sp_t=results&sp_q_1=MolCellBio&sp_x_1=subject&sp_p_1=phrase&sp-q=interference+rna

---