Jak powszechnie wiadomo genom każdej komórki roślinnej czy zwierzęcej zawiera wiele tysięcy genów. Nie są one jednak wszystkie odczytywane jednocześnie, ponieważ żadna komórka nie mogłaby funkcjonować w tak mało ekonomiczny sposób. Dlatego też w toku ewolucji powstały różne sposoby wyciszania niektórych genów, których ekspresja jest niepotrzebna w danej tkance czy komórce. Najbardziej znanym zabezpieczeniem ekspresji genów jest obecność regionów regulatorowych w pobliżu genów, które mogą ulegać transkrypcji tylko wtedy, gdy do odpowiedniego miejsca przyłączy się pewna grupa białek-aktywatorów (tzw. czynników transkrypcyjnych). Czy istnieją jednak geny, których ekspresja jest szczególnie niebezpieczna i wymaga wyjątkowej kontroli ze strony komórki? Odpowiedź brzmi: tak. Należy bowiem pamiętać o ruchomych elementach genetycznych np. transpozonach, które bez ograniczeń rozprzestrzeniają się w postaci mRNA co może w pewnych sytuacjach wywołać raka lub inne choroby. Należy tu mieć także na uwadze niekontrolowane, zdradliwe mRNA syntetyzowane na matrycy genów wirusa, wykorzystujące wszystkie elementy komórkowego aparatu syntezy białek zainfekowanej komórki. Komórki umieją się jednak bronić, o czym może świadczyć dawno zidentyfikowany system tzw. odpowiedzi interferonowej. Ulega on aktywacji w ludzkich komórkach wtedy, gdy zostają dostrzeżone w ich wnętrzu geny wirusa i powoduje on gwałtowne zahamowanie ekspresji niemal wszystkich genów. Od kilku lat wiadomo, że nie jest to jedyna linia obrony większości komórek roślinnych i zwierzęcych, w których wnętrzu naukowcy odkryli obecność bardzo subtelnego i precyzyjnego systemu działającego niczym wyrafinowany strażnik ekspresji genów. Nazwano go interferencją RNA (RNAi). Gdy ekspresji ulega, mimo wielu zabezpieczeń, "groźny" gen, system RNAi wycisza go przechwytując i niszcząc jego mRNA. Co ważne nie zostaje przy tym zakłócony przepływ informacji z innych genów. Zainteresowanie biologów tym systemem rośnie w miarę postępów badań. Obecnie naukowcy pracujący nad roślinami, nicieniami, muszką owocową i innymi organizmami są w stanie wykorzystać ten system do wyłączania prawie wszystkich interesujących ich genów. Dzięki temu można poznać funkcję, jaką pełnią one w komórce. Fascynacja ta jest jak najbardziej zrozumiała ze względu na fakt, iż teoretycznie naukowcy mogą znaleźć metody pokierowania interferencją RNA, tak aby dało się tłumić wybrane geny np. te, które są zaangażowane w powstawanie raka, infekcje wirusowe lub inne choroby. Gdyby te optymistyczne oczekiwania spełniły się, to technologie oparte na RNAi pozwoliłyby na stworzenie nowej klasy leków.

PRZYPADEK NA MIARĘ ZŁOTA

Cała historia z inferencją RNA rozpoczęła się przypadkowo 13 lat temu, gdy niezależnie od siebie Richard A. Jorgensen i Joseph Mol wprowadzili do komórek fioletowych petunii dodatkowe kopie genu warunkujące barwę kwiatów. Miało to na celu zintensyfikować dotychczasowy kolor kwiatów. Ku ich zdziwieniu stało się inaczej - zmodyfikowane petunie miały na płatkach białe plamy.

Na tej podstawie wywnioskowano, iż dodatkowe kopie genu spowodowały, w nieznany dotychczas badaczom sposób, inaktywację genów tej barwy. W wyniku tego powstały kwiaty w białe plamy lub nawet wyglądające jak gatunek albinotyczny. Tak rozpoczęła się seria doświadczeń mających na celu wyjaśnienie mechanizmu tego zjawiska. Zagadka, w jaki sposób są wyciszane geny, została częściowo rozwikłana za sprawą badań Williama G. Dougherty'ego z Oregon State University i jego współpracowników, którzy robili doświadczenia na zmodyfikowanym tytoniu, do którego wprowadzono kilka kopii genu CP (kodującego białko płaszcza wirusa wżerkowej plamistości tytoniu). Ku ich zdziwieniu, niektóre z roślin zakażonych wirusem były odporne na infekcję. Dougherty stwierdził, że najwyraźniej po wprowadzeniu obcych dla tytoniu genów białka CP w niektórych roślinach doszło do hamowania ich ekspresji. W konsekwencji nieaktywne stawały się również geny CP atakującego wirusa. Wspomniani naukowcy udowodnili także, że również wirusy są w stanie wyciszać specyficznie geny roślin.

W tym samym czasie inny zespół badawczy prowadził badania z wdzięcznym zwierzakiem, jakim się okazał nicień Caenorhabditis elegans. Przez wiele lat naukowcy nie mogli zrozumieć, dlaczego podanie nicieniowi "sensownego" RNA dawało taki sam efekt jak użycie antysensownego RNA. Z czasem zdano sobie sprawę z niejednorodności preparatów sensownego i antysensownego RNA, zawierających śladowe ilości dwuniciowego RNA. To właśnie jego obecność mogła zaktywować enigmatycznych strażników. Aby zweryfikować swoje przypuszczenia naukowcy przeprowadzili doświadczenie polegające na wprowadzeniu do nicieni jedno- i dwuniciowego RNA odpowiadającego genowi unc-22, który jest istotny w funkcjonowaniu mięśni. Tylko kilka cząsteczek dwuniciowego RNA wystarczyło do zakłócenia ekspresji genu unc-22, co objawiło się niekontrolowanymi drgawkami robaków. Po tym sukcesie kolejnym celem badaczy było testowanie innych genów i we wszystkich przypadkach zaobserwowano silny efekt wyciszania (Rys.1).

• 
  Rys.1 RNAi wygaszające ekspresję genu dla białka GFP w C.elegans. (A,B) Obraz kontrolny widziany w mikroskopie fluorescencyjnymi i w mikroskopii Nomarskiego. (C,D) Obraz zarodków, w których doprowadzono do wygaszenia GFP.

Zjawisko to nazwano interferencją RNA (RNAi). W niedługim czasie obecność systemu RNAi potwierdzono także u glonów, płazińców i muszki owocowej, będących przedstawicielami odrębnych gałęzi drzewa ewolucyjnego. Nieco trudniej było natomiast udowodnić obecność RNAi w komórkach ssaków i człowieka, ale również i to się udało.

RNAi - NIEUSTRASZONA ARMIA NISKOCZĄSTECZKOWYCH RNA

Podczas gdy większość zespołów badawczych próbuje wykorzystać interferencję RNA jako metodę, niektórzy pracują nad rozszyfrowaniem mechanizmów rządzących tym systemem.

Na podstawie wielu prac można obecnie wyobrazić sobie jak działa system iRNA. Wewnątrz komórki dwuniciowy RNA (pochodzący np. z replikującego się wirusa, z ruchomych elementów genetycznych lub nieprawidłowych genów czy mikro-RNA) napotyka w cytoplazmie komórki na enzym o nazwie DICER. W procesie hydrolizy enzym ten tnie RNA na dwuniciowe fragmenty, zwane siRNA (małe interferujące RNA). Z których każdy ma długość około 22 nukleotydów, a na każdym z końców wystają po dwa nukleotydy (Rys.2B). Wynika to z tego, że DICER tnie każdą z dwóch nici RNA asymetrycznie. Komplementarne nici siRNA zostają rozplątane, a następnie jedna z nich przyłącza się do kompleksu białkowego, tworząc tzw. kompleks wyciszający indukowany przez RNA (RISC). RISC napotyka tysiące genów, ale wyłapuje tylko te, które idealnie lub prawie idealnie do niego pasują. A zatem w przeciwieństwie do działania interferonu kompleks wyciszający jest wysoce selektywny. Jeśli pojedyncza nić siRNA lub mikro-RNA w kompleksie RISC pasuje idealnie do złapanego mRNA to do akcji wkracza kolejny enzym-SLICER, przecinający łańcuch na bezużyteczne fragmenty inaktywując tym samym matrycowy RNA. Następnie kompleks RISC uwalnia oba fragmenty i w niezmienionej formie jest gotowy do dalszej aktywności (Rys.2C). Jeśli parowanie nie jest idealne, odpowiedź jest inna. RISC pozostaje złączony z mRNA nie tnąc go na fragmenty, ale może w ten sposób na przykład zablokować rybosom przesuwający się po mRNA, przez co zatrzymana zostaje synteza białka (Rys2.D). W ten oto wyrafinowany sposób cenzura iRNA używa kawałków dwuniciowego RNA "wroga" do identyfikacji zdradliwych mRNA.

• 
  

Rys.2 Schemat przedstawiający powstawanie cząsteczek siRNA i mikro-RNA . (A) mikro-RNA występuje w postaci spinki do włosów, która to powstaje z pierwszorzędowego transkryptu genu np. MIR. Kompleks DICER rozpoznaje mikro-RNA, przecina je do postaci krótkiej, dwuniciowej formy, z której jedna nić zostaje związana przez kompleks miRNP/RISC gotowy w tej postaci do wyciszania odpowiednich mRNA. (B). Długi, dwuniciowy fragment RNA pochodzący np. z wirusa, transpozonu ulega pocięciu przez DICER na wiele fragmentów siRNA, które w postaci jednoniciowego RNA zostają związane w kompleksie RISC. (C) Idealne parowanie między miRNA/siRNA, a matrycowym RNA kończy się pocięciem tego ostatniego na fragmenty czyniąc go nieaktywnym. Objawia się to wyciszeniem genu, na matrycy którego powstało dane mRNA. (D) miRNA/siRNA wydają się także wiązać do fragmentu 3' UTR w sposób nie do końca komplementarny przez co kompleks miRNP/RISC nie przecina mRNA, ale blokuje translację.(E) Metylacja histonów aktywnej chromatyny przez endogenne siRNA(tzw. heterochromatyczne siRNA) powoduje wyciszanie transkrypcji zmodyfikowanych regionów chromatyny.

Fragmenty siRNA odkryto po raz pierwszy u roślin w laboratorium Davida C. Baulcombe'a z Sainsbury Laboratory in Norwich, w Wielkiej Brytanii. Następnie Tuschl i jego zespół wyizolowali siRNA z embrionów muszki owocowej. Udało im się wykazać jego rolę w wyciszaniu genów dzięki wyprodukowaniu sztucznych siRNA i użyciu ich bezpośrednio do niszczenia wybranych mRNA. Ponadto wprowadzili syntetyczne siRNA do komórek ssaków i stwierdzono, że system odpowiedzi interferonowej nie wykrywa dwuniciowego RNA krótszego niż 30 par nukleotydów. To odkrycie okazało się bardzo znaczące ze względu na fakt, iż gdy do komórek dorosłego ssaka wprowadzano dość długi sztuczny dwuniciowy RNA w celu aktywacji interferencji RNA, odpowiedź interferonowa powodowała niespecyficzne wyłączenie wszystkich genów w komórce. To, niepożądane w tym przypadku zjawisko ma miejsce na skutek aktywacji białka PKR blokującego translację matrycowych RNA i uaktywnienia RNazy L niszczącej wszystkie istniejące w danej chwili mRNA. Ten mało specyficzny mechanizm jest indukowany za sprawą interferonów, wydzielanych przez zainfekowane komórki.

ZBAWIENNA ROLA INTERFERENCJI RNA W KOMÓRKACH

Mechanizm systemu regulującego ekspresję genów prawdopodobnie powstał około miliarda lat temu. Już w tak odległych czasach zaistniała potrzeba zabezpieczenia ówczesnych organizmów przed obcym materiałem genetycznym, takim jak wirusowe DNA i ruchome elementy genetyczne. Dowodem jest fakt, iż prawie połowa ludzkiego mikro-RNA jest niemal identyczna z obecnym w genomie ryby z rodziny kolcobrzuchowatych Fugu rubripes. Należy tu także wspomnieć, że drogi obu tych gatunków rozeszły się jakieś 400 mln lat temu. Z licznych eksperymentów wykonanych na materiałach roślin i zwierząt wytwarzających bardzo małe ilości enzymu DICER wynika, iż interferencja RNA pełni również inne, równie ważne biologiczne funkcje. Bowiem wspomniane mutanty są bezpłodne i obciążone wieloma defektami rozwojowymi. Jedna z hipotez zakłada, iż mechanizm wycinania okazał się na tyle skuteczny, że w toku ewolucji organizmy zaczęły go wykorzystywać do innych celów.

Wszystkie komórki w danym organizmie mają taki sam materiał genetyczny, ale różnią się zestawem genów ulegających ekspresji. Właśnie system iRNA jest wykorzystywany do wyłączania części genów w komórkach embrionalnych roślin i zwierząt, w miarę rozwoju i wzrostu organizmu. I odwrotnie : geny, które do tej pory były nieaktywne należy przywrócić do życia.

Wszystko wskazuje na to, iż istnieje aparatura RNAi biorąca udział w wyciszaniu naturalnych genów komórkowych. Proces ten jest niezbędny do różnicowania się odrębnych typów komórek, na przykład neuronów lub komórek mięśniowych, oraz różnych organów, takich jak mózg czy serce.

Czynnikiem usypiającym naturalne geny komórkowe okazały się być mikro-RNA- małe fragmenty RNA, które przypominają siRNA, ale mają inne pochodzenie. Podczas, gdy siRNA są produktami genów, które mają zostać wyciszone, mikro-RNA pochodzą z odcinka DNA jądrowego, którego jedyną funkcją jest właśnie tworzenie tych maleńkich, regulatorowych RNA. Po transkrypcji tego regionu DNA cząsteczka mikro-RNA zwija się tworząc strukturę szpilki do włosów. Następnie DICER dokonuje wycięcia środkowej części szpilki. Tak powstaje fragment zachowujący się podobnie do siRNA, ale służący do cenzurowania innych genów niż ten, z którego powstał. Roślinne mikro-RNA "atakują" głównie geny istotne dla rozwoju pomagając w wyspecjalizowaniu się licznym komórkom. Do niedawna naukowcy byli przekonani o istnieniu jedynie dwóch mikro- RNA- lin 4 RNA i let 7 RNA. Obecnie szacuje się, że w komórkach ludzkich jest ich prawdopodobnie od 200- 255, czyli prawie 1% wszystkich ludzkich genów. Są one na tyle nietypowe, że ich każdym produktem nie jest białko lecz RNA. Dzisiejszy stan wiedzy pozwala także przypuszczać, iż RNAi nie tylko wyłapują matrycowe RNA będące celem ich zniszczenia, ale mogą ponadto powodować wyciszanie genów na poziomie DNA, w najbardziej skrajnym przypadku bezpośrednio z nim oddziałując. W rezultacie dochodzi do utworzenia specyficznej formy DNA-RNA, która nie może ulegać transkrypcji.

WYMARZONE NARZĘDZIE GENETYKI PRZYSZŁOŚCI

Odkrycie Tuschla w postaci siRNA zafascynowało genetyków, bowiem do niedawna ustalenie funkcji genu przez jego usunięcie z genomu wymagało miesięcy pracy. Tymczasem marzenia o prostej i szybkiej metodzie wyciszania genów zdają się stawać rzeczywistością. Dzięki zastosowaniu siRNA, prawie każdy interesujący nas gen w ciągu kilku godzin może zostać odwracalnie wyłączony w kulturze tkankowej ssaków (łącznie z komórkami ssaków). Efekt ten utrzymuje się całymi dniami, co pozwala na przeprowadzenie pożądanego eksperymentu. Interferencja RNA daje olbrzymie możliwości i na dodatek łatwo ją wywołać. Obecnie, kiedy genomy wielu organizmów zostały zsekwencjonowane, naukowcy mogą użyć RNAi, by odkrywać funkcje poszczególnych genów. Świadomi ogromnej roli RNAi w światku biologicznym są nie tylko genetycy i biochemicy. Zjawisko interferencji RNA wzbudziło także ogromne zainteresowanie wśród firm farmaceutycznych i biotechnologicznych. Systematyczne wyciszanie kolejnych genów może bowiem m.in. pomóc naukowcom znaleźć gen krytyczny dla wzrostu komórek nowotworowych, nieistotny jednocześnie dla komórek zdrowych. Znając cel, można wtedy stworzyć lek zakłócający działanie białka-produktu wyciszonego genu. Ten system ma szansę w przyszłości stać się skuteczną metodą leczenia. Nowotwory, infekcje wirusowe czy pewne choroby dałoby się zwalczać przez powstrzymywanie syntezy odpowiedzialnych za nie białek.

Obecnie wiadomo, że przynajmniej sześć laboratoriów na świecie obniosło sukces wykorzystując system iRNA do powstrzymania na pewien czas rozwoju wirusów w komórkach ludzkich - m.in. HIV, polio i wirusa zapalenia wątroby typu C. Kika firm (m.in. Alnylam Pharmaceuticals, Ribopharma, Sirna Therapeutics) realizuje obecnie projekty mające na celu modyfikację chemiczną siRNA będących podstawą nowo konstruowanych leków do leczenia chorób wirusowych i nowotworowych (m.in. wielopostaciowego glejaka, raka trzustki czy raka jelita grubego). Wszystkie sukcesy z pewnością zachęcą badaczy do dalszych badań. Jakkolwiek miną lata, zanim leczenie oparte na RNAi będzie powszechnie praktykowane w szpitalach. Tymczasem największy problem dotyczy wprowadzania siRNA do komórek. W przypadku człowieka i innych ssaków, którym podano siRNA w postaci zastrzyku efekt wywołany interferencją RNA nie rozprzestrzenia się na cały organizm. Zupełnie inaczej jest w przypadku roślin i nicieni.

Cząsteczki siRNA są bardzo duże w porównaniu z tymi, które są składnikami typowych leków. Dodatkowo nie mogą być połykane w postaci pigułek, ponieważ układ pokarmowy szybko je strawi, a nie wchłonie. Obecnie w wielu laboratoriach na świecie testowane są różne metody wnikania małych cząsteczek RNA do organów i do wnętrza komórek.

Jak na razie nie wiadomo, czy którakolwiek z tych strategii będzie skuteczna.

Największe nadzieje pokłada się jednak w terapii genowej. Pozwala ona bowiem na wprowadzenie do komórek za sprawą wektora ( np. retrowirusa) materiał genetyczny, na podstawie którego powstaje interesujący nas rodzaj siRNA. Gen taki, pod kontrolą promotora H1polimerazy III, zawiera sekwencję rozpoznającą mRNA, kilka nukleotydów rozdzielających sekwencję odwróconą do sekwencji rozpoznającej mRNA. Na końcu takiego nukleotydu znajduje się 5 nukleotydów T. W wyniku transkrypcji powstaje siRNA mający strukturę szpilki do włosów i posiadający na końcu 3' kilka niesparowanych nukleotydów U. Takie oligonukleotydy posiadające niesparowane nukleotydy z końca 3' są dużo bardziej wydajne w procesie degradacji mRNA niż oligonukleotydy bez tych nukleotydów. W ten sposób możemy otrzymać długotrwałą transfekcję komórek danego organizmu, w którym zaszła potrzeba swoistego hamowania ekspresji zmutowanego genu.

Grupa Beverly Davidson z Uniwersity of Iowa użyła na przykład zmodyfikowanego adenowirusa, by wprowadzić geny produkujące siRNA do komórek mózgu i wątroby.

W dniu dzisiejszym, dzięki bardzo dynamicznym badaniom, zbliżamy się do całkowitego zgłębienia wiedzy na temat fascynującego zjawiska siRNA. Wiele nurtujących pytań pozostaje jednak nadal bez odpowiedzi, na co trzeba jeszcze cierpliwie poczekać.. Należy jednak pamiętać, że z każdą odpowiedzią na zadawane sobie pytania odkrywamy kolejny rąbek tajemnicy, co w przyszłości być może pozwoli nam uczynić zjawisko interferencji RNA podstawą całkiem nowej gałęzi medycyny genetycznej.

---