Metody badań

strukturalnych w

biotechnologii

Wykład III

Spektroskopia

magnetycznego rezonansu

jądrowego – podstawowe

pojęcia

Magnetyczny

rezonans jądrowy

–

NMR (Nuclear
Magnetic Resonance)
– podstawą metody jest
wykorzystanie
właściwości
magnetycznych
cząsteczek,
związanych z
występowaniem w nich
jąder magnetycznych

Kilka faktów z historii rozwoju

NMR:

1946 – wykrycie zjawiska magnetycznego rezonansu
jądrowego,
1955 – spektrometry 1H NMR 40MHz,
1965 – opracowanie algorytmu szybkiej transformacji
Fouriera (FFT),
1974 – początek rozwoju metod dwuwymiarowych
(2D NMR),
1985 – metoda określania III-rzędowej struktury białek
w roztworze za pomocą spektroskopii NMR,
1995 – komercyjnie dostępne spektrometry z

magnesami

nadprzewodnościowymi, umożliwiające

wykonanie

widm wielowymiarowych o częstości

podstawowej

1H NMR 200 – 750 (obecnie do 900) MHz

Normalnie położenie spinów

jądrowych jest przypadkowe:

A po przyłożeniu zewnętrznego pola

magnetycznego:

Warunek rezonansu

:

Warunek rezonansu

:

Właściwości jąder atomowych badanych za

pomocą NMR:

izotop

Zawartość

procento

wa w

populacji

Kwantowa

liczba

spinowa

jądra I

Częstość

rezonanso

wa MHz

(B

0

=

2.3T)

1H

99.98

½

100

13C

1.08

½

25.1

15N

0.365

½

10.1

17O

3.7•10

-2

5/2

13.5

19F

100

½

94

31P

100

½

40.5

Metody rejestracji widm

NMR:

• Metoda fali ciągłej – CW

(continuous wave),

• Metoda impulsowa, znacznie lepsza

i nowocześniejsza, polegajaca na
rejestracji FID (Free Induction
Delay) i zastosowaniu transformacji
Fouriera do jego obróbki

Metoda fali ciągłej

Metoda impulsowa

FID w funkcji czasu → widmo

uzyskane po

transformacji

Fouriera

FT NMR

1H NMR – protonowy

rezonans magnetyczny

Na powszechne zastosowanie tej

metody składa sie kilka zalet:

- łatwość przygotowania próbki,
- wymagana niewielka ilość związku

(10

-6

g),

- krótki czas pomiaru – rzędu kilku

minut

Na podstawie jednowymiarowych widm

protonowych można wnioskować o
budowie prostych związków. Cały
problem sprowadza się do określenia
trzech wielkości:

• Wartości przesunięć chemicznych

poszczególnych sygnałów na widmie.

• Multipletowości sygnałów (sprzężenie

spin – spin).

• Intergracja sygnałów

.

Przesunięcie chemiczne

Na jądro atomowe działa

pole mniejsze od

przyłożonego pola

zewnętrznego – tzw efekt

ekranowania, która jest

tym większy im większa

jest gęstość elektronowa

wokół danego jadra:

B

ef

= B

0

(1 – σ)

σ – stała ekranowania

Dzięki temu na widmie

obserwujemy

zróżnicowanie sygnałów

w zależności od

otoczenia chemicznego

protonów.

Przesunięcie chemiczne

B

ef

= B

0

(1 – σ)

σ – stała ekranowania

Różnica stałych ekranowania

wzorca i próbki nosi nazwę

przesunięcie chemiczne δ,

wyrażane jest w ppm (part

per milion):

δ = B

0WZ

– B

0PR

/B

0WZ

•10

6

[ppm]

Ponieważ z warunku

rezonansu wynika, że B

0

i ν

są do siebie proporcjonalne,

zatem:

δ = ν

pr

- ν

wz

/ν

wz

•10

6

Najczęściej stosowanym

wzorcem w 1H NMR jest

tetrametylosilan (TMS).

Przesunięcie chemiczne

Grupa

δ [ppm]

R-COOH

R-COH

Ar-H

R-OH

R-NH

2

=CH-
-CH

2

-

-CH

3

12 –10

11 – 9

9 – 7

6 - 4

4 – 2
6 – 1
5 – 1

3 - 1

Przesunięcie chemiczne

Przesunięcie chemiczne

NH

2

CH

2

CH

3

Dlaczego na widmach NMR pojawiają się multiplety?

Sprzężenia spinowo-

spinowe

Kolejnym elementem ułatwiającym analizę widm

NMR są sprzężenia spinowo-spinowe,

wynikające z oddziaływań momentów

magnetycznych jąder. Efektem tego jest

podział sygnału na multiplet, ilość linii w

multiplecie opisuje wzór:

P = 2nI + 1

gdzie: n – liczba równocennych jąder

rozszczepiających, I – kwantowa liczba

spinowa

sprzężenia spinowo-

spinowe

sprzężenia spinowo-

spinowe

dla I = ½:

Liczba

równocenny

ch jąder

Ilość i

intensywnośc

i sygnałów w

multiplecie

0
1
2
3
4
5
6

1

1 1

1 2 1

1 3 3 1

1 4 6 4 1

1 5 10 10 5 1

1 6 15 20 15

6 1

Równocenne protony

Ostatnim czynnikiem istotnym w

analizie protonowego rezonansu
magnetycznego

jest

krzywa

integracji. W przypadku 1H NMR
powierzchnia

piku

jest

wielkością wprost proporcjonalą
do ilości protonów od których
dany pik pochodzi.

Przykład widma 1H
NMR: