Ciałko Barra. Barwienie komórek nabłonka

jamy ustnej na obecność ciałek Barra.

Teoria Lyon.

Aleksandra Włoskiewicz

gr.5

Pielęgniarstwo rok I

CIAŁKO BARRA

• Ciałka Barra są to płasko wypukłe grudki

chromatyny położone przy błonie jądrowej
komórki, występujące np. w komórkach nabłonka
jamy ustnej, w krwinkach białych („pałeczki
dobosza”) i w innych. W warunkach prawidłowych
stwierdza się je jedynie u kobiet. Okazało się,
bowiem, że ciałko Barra to nieczynny, odłożony
chromosom X. Jak pamiętamy, geny leżące na
chromosomie X są niezbędne do życia, dlatego
też każda komórka, która ma utrzymać się przy
życiu musi posiadać ten chromosom.

• Jeżeli jednak w komórce są dwa chromosomy

X, jeden z nich może pozostać nieczynny,
odłożony w postaci heterochromatyny,
albowiem geny odczytywane są na drugim,
czynnym chromosomie X. A zatem w
organizmie kobiety (XX) występują ciałka
Barra, a w organizmie mężczyzny (XY) ich nie
ma. Poszukując chromatyny płciowej
możemy określić płeć chromatynową. Jeśli
występują ciałka Barra, płeć chromatynowa
jest żeńska, gdy jest ich brak – męska.

Hipoteza inaktywacji chromosomu X

• Hipotezy inaktywacji chromosomu X

Badania były prowadzone w Anglii na myszach
przez Mary Lyon w 1961roku. Zaproponowała
ona, że:

• 1.Skondensowany chromosom X w

somatycznych kom. żeńskich ssaków jest
genetycznie nieaktywny.

• 2.Inaktywacja zachodzi we wczesnych

etapach rozwoju(w stadium 32 lub 64
komórek), chromosom pochodzenia
matczynego lub ojcowskiego ulega inaktywacji z
jednakowym prawdopodobieństwem.

• 3.Inaktywacja zachodzi w sposób niezależny,

losowy i nieodwracalny w każdej komórce
embrionu. Wzór inaktywacji zostaje zachowany w
komórkach potomnych tzn., że gdy inaktywacji
ulega pierwotnie X matczyny, to we wszystkich
komórkach potomnych inaktywowany pozostanie
chromosomom pochodzenia matczynego.

• Proces inaktywacji chromosomu X- lyonizacaja,

prowadzi do zrównoważenia fenotypu męskiego
i żeńskiego przez kompensację dawki(kobiety
posiadające 2 X mają taką samą liczbę
aktywnych kopii genów sprzężonych z X jak
mężczyźni.

• Lyonizacji towarzyszy metylacja

cytozyny w kontrolujących obszarach DNA,
w wyniku kondensacji chromosom X zostaje
wyłączony ( nie zachodzi transkrypcja
genów)

• Inaktywacja obejmuje większość genów

chromosomu X z wyjątkiem genów w
obszarze psedoautosomalnym oraz
położonych w proksymalnej części ramienia
krótkiego i długiego.

Etapy inaktywacji:

• -inicjacja- wymaga obecności dwóch

chromosomów XX

• -zliczenie całkowitej ilości chromosomów X w

jądrze

• -wybór chromosomu który ulegnie inaktywacji
• -zablokowanie centrum inaktywacji chromosomu,

który pozostanie czynny

• -rozprzestrzenienie się inaktywacji na drugim

chromosomie

• -utrzymanie stanu inaktywacji podczas podziałów

komórkowych

Dowody na losową inaktywację chromosomu X - badania

nad żeńskimi osobnikami będącymi heterozygotami pod

względem cech sprzężonych z płcią

• badania Lyona na myszach. Jednolicie zabarwieni

rodzice -XX ciemna, XY -jasny, łaciate potomstwo tylko
samiczki, komórki z nieaktywnym Xmat wytwarzały
barwnik jasny, Xpat wytwarzały barwnik ciemny.

• -Efekt wariegacji (fenotypowej mozaikowatości)

obserwowany u kotek. Tylko u heterozygotycznych samic
pojawia się futro łaciate czarno- żółto- białe. Kotka
otrzymuje od rodziców jeden gen- barwa czarna, a drugi-
barwa żółta) na skutek losowej inaktywacji jednego z X
w pewnych klonach komórek dochodzi do ekspresji
genów barwy czarnej, w innych glonach- genów barwy
żółtej. Barwę sierści warunkują tez inne geny dlatego
zwykle na futerku pojawiają się białe plamy

• Anhydrotyczna ektodermalna dysplazja- choroba

recesywna u ludzi. Chorzy mężczyźni nie mają gruczołów
potowych, zębów i owłosienia na ciele. Heterozygotyczne
kobiety cechuje brak gruczołów potowych na skórze oraz
utrata lub uszkodzenie pojedynczych zębów. Miejsca
pozbawione gruczołów są rozmieszczone nieregularnie na
skórze w zależności od tego, który z chromosomów X
został wyłączony.

• Objawy dysplazji manifestują się zmianami w zakresie

skóry, błon śluzowych, włosów, paznokci i zębów. Chorzy
mają bladą, cienką skórę, często z pigmentacjami powiek,
łokci i kolan, skąpą podściółkę tłuszczową, szeroki,
siodełkowaty nos, odstające, nisko osadzone małżowiny
uszne, skąpe i jasne owłosienie głowy, często brak rzęs i
brwi, grube wywinięte wargi, zniekształcone płytki
paznokci, niekiedy zaburzenia neurologiczne i niedorozwój
soczewki oka.

• Rozróżnia się: postać hydrotyczną – dziedziczoną

na drodze autosomalnej dominującej oraz postać
anhydrotyczną – dziedziczoną na drodze
autosomalnej recesywnej, sprzężoną z płcią
męską kobiety są nosicielkami.

• Badanie poziomu enzymu dehydrogenazy

glukozo-6-fosforanowej (metabolizm glukozy)
kodowanej przez gen G6PD znajdujący się na
chromosomie X, wykazały że poziom tego
enzymu jest inny u kobiet i mężczyzn. U kobiet
46, XX i mężczyzn 46, XY oraz 47, XXY, poziom
enzymu jest jednakowy, co może świadczyć o
aktywności tylko jednego allelu u kobiet,
mężczyzn i mężczyzn z zespołem Kinefeltera.

BADANIA CHROMATYNY PŁCIOWEJ

(Test CHX)

• Uwagi ogólne:

Testy chromatynowe są proste w wykonaniu,
nie są obciążające dla badanego dziecka lub
pacjenta dorosłego, pozwalają na szybkie
wykluczenie aberracji liczbowych
chromosomów płciowych X i Y oraz
niektórych typów ich aberracji strukturalnych.
Ocenie podlegają jądra komórek w okresie
między podziałowym (interfazy), dzięki
czemu nie jest potrzebna hodowla materiału
pobranego do badań.

• Testy chromatyny płciowej X (test CHX) oraz

chromatyny płciowej Y (CHY) umożliwiają
określenie płci chromatynowej pacjenta. Są
szczególnie przydatne w przypadkach
stwierdzenia wad rozwojowych narządów
płciowych, zwłaszcza u noworodków, u
których konieczne jest szybkie podjęcie
decyzji dotyczących ustalenia płci
fenotypowej, a w ślad za tym płci
metrykalnej dziecka. Wszystkie
nieprawidłowe wyniki testów CHX i CHY
muszą być zweryfikowane w pełnym
badaniu kariotypu.

• Chromatyna X jest efektem inaktywacji jednego z

dwóch chromosomów X u zdrowej kobiety (kariotyp
46,XX) celem zapobieżenia efektowi "dawki genów"
w stosunku do jednego chromosomu X u mężczyzny
(kariotyp 46,XY). W jądrach wielu typów komórek
widoczna jest jako grudka chromatyny X lub jako
"pałeczka dobosza" w granulocytach
obojętnochłonnych krwi obwodowej. Liczba grudek
(pałeczek) jest zawsze o jeden mniejsza niż liczba
chromosomów X w kariotypie. Test jest zatem ujemny
przykładowo u mężczyzny z kariotypem 46,XY ale i u
pacjentki z kariotypem 45,X (zespół Turnera). Będzie
natomiast dodatni zarówno u kobiety (46,XX) jak i u
mężczyzny z zespołem Klinefeltera (47,XXY),
u którego jeden X ulega inaktywacji.

Badania na CHX

• Badanie na CHX wykonuje się na nabłonku

jamy ustnej, który pobiera się plastikową
szpatułką w postaci tzw. wyskrobiny.
Natomiast test CHY przeprowadza się na
jądrach limfocytów krwi obwodowej - kropla
pobrana z opuszka palca. Wynik zwykle jest
nastęnego dnia.

WYBARWIANIE

• Wybarwianie ciałek Barra to jedna z metod

rozróżniania płci. Liczba ciałek Barra = liczba X – 1.
Najłatwiej ciałka Barra uzyskać z nabłonka błony
śluzowej jamy ustnej lub z płynu owodniowego
zrobić rozmaz na szkiełku i wybarwić.

• pałeczka dobosza X – są to grudki chromatyny

chromosomu X wyrzucone poza obręb jądra, ale
pozostające z nim w łączności. Występują w
granulocytach obojętnochłonnych, które mają
segmentowane jądra. U kobiety pałeczka dobosza
tworzy tą część chromatyny jądrowej, z której
powstałby chromosom (nieczynny).

• u mężczyzn:

• pałeczka dobosza Y – u mężczyzn pałeczka dobosza

tworzona jest przez tą część chromatyny jądrowej, z
której powstałby chromosom Y – u mężczyzn fluoryzuje.

• Dystalna część ramion dolnych chromosomu Y ma

zdolność silnej fluorescencji. Aby odróżnić pałeczkę
dobosza X od Y wystarczy wybarwić preparat barwnikiem
fluorescencyjnym i jeżeli pałeczka dobosza zaświeci, jest
to Y.

• ciałko Y (chromatyna Y) – występuje w jądrze

komórkowym komórek męskich wybarwionych
barwnikami fluorescencyjnymi – stanowi je dystalna
hetero chromatynowa część ramion długich chromosomu
Y, która ma dolność silnej fluorescencji. Liczba ciałek Y =
liczba chromosomów Y. Jest to ta część, z której
powstałby chromosom Y.

Barwienie ciałek Barra

• Fuksyna zasadowa:

• roztwór podstawowy

-fuksyna zasadowa 3 g
-70% alkohol etylowy – 100 ml

• roztwór fuksyny

-roztwór podstawowy – 10 ml
-5% wodny kwas karbolowy (FENOL) – 30 ml
-kwas octowy lodowaty – 10 ml
-37% formaldehyd (cz.d.a.) – 10 ml

• (roztwór nadaje się do użycia po 24 godzinach)

Wykonanie

• 1.      Alkohol absolutny - 3 min
• 2.      Alkohol 70% - 3 min
• 3.      H

O destylowana – 5 min

• 4. H

O destylowana – 5 min

• 5.      Fuksyna – 5 – 10 – 20 min
• 6.      Alkohol 95% - 1 min
• 7.      Alkohol absolutny – 3 min
• 8.      Alkohol absolutny – 3 min
• 9.      Ksylen
• 10. Ksylen

Przygotowanie kwasu karbolowego: wstawić fenol do
cieplarki, odważyć 5 g i uzupełnić do 100 ml wodą.

Barwienie pałeczek dobosza

• Wykonanie rozmazu:

• 1. Kroplę krwi umieścić na jednym końcu szkiełka przedmiotowego.
• 2. Oprzeć brzeg szkiełka szlifowanego kroplę krwi tak, aby rozpłynęła

się wzdłuż jego krawędzi. Szkiełko ustawić pod kątem 20-30⁰ w stosunku
do szkiełka przedmiotowego.

• 3. Trzymając szkiełko szlifowane w prawej ręce a przedmiotowe w lewej

podpierając je palcem środkowym, jednym ruchem rozmazać kroplę krwi.

• 4.      Po wykonaniu rozmazu szkiełko wysuszyć na powietrzu.
• Barwienie:
• 1.      Utrwalić w alkoholu metylowym absolutnym – 10 min.
• 2.      Zalać barwnikiem May – Grunwalda, zbuforowanym do pH 6,8 na 5

min.

• 3.      Płukać w wodzie destylowanej.
• 4.      Barwić 3% roztworem Giemsy przez 10-20 min.
• 5.      Płukać w wodzie destylowanej.
• 6.      Wysuszyć i przechowywać na sucho.
• Analizować należy ok. 500 leukocytów. U osobników żeńskich stwierdza się

co najmniej 12% granulocytów z typowymi pałeczkami dobosza X.