Mikroskopy w
mikrobiologii

Badanie mikroskopowe

Badanie mikroskopowe pozwala na
stwierdzenie obecności bakterii w
badanym materiale i obserwację
morfologii komórek bakteryjnych. W
większości przypadków badanie to stanowi
tylko pierwszy etap identyfikacji
drobnoustroju, ukierunkowując dalsze
etapy badania mikrobiologicznego.

Historia mikroskopu w
mikrobiologii

Antony Leeuwenhoek urodził się 24 października 1632 roku w Delft.
W 1668 roku zawitał w interesach do Londynu. Otóż w Londynie w ręce Leeuwenhoeka wpadła
znakomita książka Roberta Hooke’a ”Micrographia”, przedstawiająca ryciny z obserwacji
mikroskopowych najrozmaitszych obiektów: wesz, pcheł, much, korka, a także tkanin. Początkowo
praca ta zainteresowała Leeuwenhoeka najprawdopodobniej dlatego, że sam, jako handlarz
suknem, niejednokrotnie badał struktury tkanin, oceniając na tej podstawie ich jakość.
Ostatecznie jednak niezwykłość wielkoformatowego i niezwykle szczegółowego dzieła Hooke’a
skłoniła Leeuwenhoeka do własnych badań mikroskopowych.
Nie było go oczywiście stać na zakup profesjonalnego mikroskopu, jakiego używał Hooke.
Zakupiony dla Hooke’a przez Towarzystwo Królewskie mikroskop dawał powiększenie około 30x,
czyli zbyt małe, aby dokładnie zobaczyć świat pleśni, a tym bardziej bakterii. Co więc zrobił
Leeuwenhoek? Skonstruował własny mikroskop. Na pomysł, jak to zrobić, nie wpadł oczywiście
samodzielnie. Wskazówki odnośnie konstrukcji takiego prostego, jednosoczewkowego mikroskopu
znalazł we wstępie do Micrographii. Mikroskop stworzony przez Leeuwenhoeka składał się z
blaszki, bardzo cienkiego, oszlifowanego lub nawet częściej topionego i “wydmuchiwanego”
szkiełka oraz śruby umożliwiającej mocowanie preparatu. Najbardziej interesujące jest jednak to,
że jest on wielkości znaczka pocztowego i daje powiększenie nawet do 300x. To on jako pierwszy
opisał organizm, o którym z podręczników biologii uczą się w szkole podstawowej wszyscy i na
całym świecie .Wszystkie swoje obserwacje skrzętnie notował. Językiem prostym, ale niezwykle
żywym i obrazowym.

Mikroskopia
świetlna

Polega na wykonywaniu zdjęć
mikrostruktury materiałów przy
powiększeniach do 1000x. Istnieje
możliwość prowadzenia obserwacji
mikroskopowych zarówno w polu jasnym,
jak i ciemnym. Na podstawie zdjęć
mikrostruktur wykonujemy ilościowy opis
udziału objętościowego faz, wielkości,
kształtu i rozmieszczenia wybranych
elementów mikrostruktury przy
wykorzystaniu programów komputerowych
do analizy struktur krystalicznych.

W laboratorium mikrobiologicznym do badań mikroskopowych
stosowany jest zwykle mikroskop świetlny z obiektywem
immersyjnym o dużych powiększeniach (zwykle 100x) i
wysokiej zdolności rozdzielczej (apertura 1,4-1,6).
Najpowszechniej stosuje się preparaty barwione z
zastosowaniem różnych metod barwienia. Preparaty
przygotowywane są na szkiełkach mikroskopowych
bezpośrednio z materiału pobranego od pacjenta
zawieszonego w kropli soli fizjologicznej (0,9% roztwór NaCl)
lub też w postaci rozmazu zawiesiny wyhodowanych komórek
bakteryjnych w kropli soli fizjologicznej. Następnie preparaty
suszy się na powietrzu i utrwala poprzez ogrzanie preparatu
nad płomieniem palnika.
Najczęściej stosowaną metodą barwienia jest metoda Grama,
która różnicuje bakterie na dwie grupy: barwiące się fioletowo
bakterie Gram-dodatnie i barwiące się różowo bakterie Gram-
ujemne

Mikroskopia fluorescencyjna

Metodą stosowaną głównie do stwierdzenia obecności
drobnoustrojów bezpośrednio w materiale pobranym jest
mikroskopia fluorescencyjna. Przygotowanie preparatów
oglądanych w mikroskopie fluorescencyjnym polega na
nałożeniu na utrwalony preparat roztworu przeciwciał
wyznakowanych barwnikiem fluorescencyjnym,
skierowanych przeciwko poszukiwanemu drobnoustrojowi, a
następnie dokładnym wypłukaniu niezwiązanych z
drobnoustrojami przeciwciał. Oświetlenie preparatu światłem
UV wywołuje świecenie barwnika fluorescencyjnego i
uwidacznia komórki o kształcie charakterystycznym dla
danego gatunku jedynie wtedy, gdy nastąpiło połączenie
przeciwciał z poszukiwanym drobnoustrojem.

Mikroskopia kontrastowo-
fazowa

Zdecydowanie rzadziej niż preparaty barwione stosuje się
preparaty wilgotne, gdzie przygotowany rozmaz nakrywa się
szkiełkiem nakrywkowym. Tak przygotowany preparat może
być oglądany w mikroskopie kontrastowo-fazowym, który
pozwala obserwować zarówno kształt jak i szczegóły
struktury komórki bakteryjnej lub też w mikroskopie z
ciemnym polem widzenia, gdzie lepiej widoczne są
drobnoustroje o niewielkich rozmiarach i spiralnej
budowie.Oglądanie preparatów w mikroskopie elektronowym
pozwala na uwidocznienie szczegółów struktury komórek
drobnoustrojów: wielkości, kształtu oraz organelli
wewnątrzkomórkowych, a także obserwowanie kolejnych faz
podziału komórek bakteryjnych.

Mikroskopia konfokalna

Mikroskopia konfokalna jest odmianą mikroskopii świetlnej charakteryzująca się
zwiększonym kontrastem, a zatem i rozdzielczością. W zwykłej mikroskopii
(szerokiego pola, w tym mikroskopie fluorescencyjnym) próbka jest oświetlana
przez źródło światła w całości. W odpowiedzi na to, albo odbija światło, albo
fluoryzuje, przy czym sygnały te są zbierane przez obiektyw. Obiektyw zbiera
sygnał nie tylko z miejsca ogniskowania, ale też całego przekroju próbki.
Powoduje to, że tło wobec sygnału z miejsca ogniskowania jest dość wysokie, co
zmniejsza kontrast. Zastosowanie przesłony z małym otworem przed
detektorem (na przykład kamerą CCD), odcina sygnał dochodzący spoza
płaszczyzny ogniskowania, co znacznie powiększa kontrast i jakość uzyskanego
obrazu. Mikroskopia konfokalna ma wiele zalet w porównaniu z konwencjonalną
mikroskopią optyczną. Cechują ją wysoki kontrast i rozdzielczość. Światło, które
jest wzbudzane w punktach leżących poza ogniskiem jest eliminowane przez
system pinholi i nie bierze udziału w tworzeniu obrazu. Wynikiem tego jest
obraz niezawierający składowych pochodzących z płaszczyzn innych niż
ogniskowa. Dzięki temu rozdzielczość i kontrast w tym mikroskopie są lepsze niż
w zwykłym mikroskopie fluorescencyjnym.