Ćwiczenie nr 3,4 dr Sławomir Wierzba, dr Teresa Farbiszewska
Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Uniwersytetu Opolskiego
OCENA AKTYWNOŚCI UTLENIAJ
CEJ BAKTERII
ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS.
I. Charakterystyka mikrobiologiczna bakterii At. ferrooxidans.
Gramujemne bakterie wyodrębnione przez Colmera i Hinkla w 1947r. Kształt krótkich pałeczek o rozmiarach 0,4
źm  0,7-1,1 źm z jedną polarną rzęską. Błona komórkowa ma liczne wewnątrzkomórkowe wgłębienia. Bakterie te
posiadają zdolność utleniania różnych związków siarki, a nawet siarki elementarnej do jonów siarczanowych.
Spośród związków siarki jony S2O32- i S2- są utleniane najszybciej. Najbardziej charakterystyczne dla tych bakterii
jest utlenianie jonów Fe2+ w środowisku H+ do Fe3+ gdyż ilość energii wydzielająca się w tej reakcji jest większa od
ilości energii wydzielającej się w czasie utleniania S2O32- czy S2-.
4FeSO4 + 2H2SO4 + O2 2Fe2(SO4)3 + 2H2O "H 300C = -38 kJxmol-1
Bakterie te utleniają również siarczki metali, w których utlenieniu ulega zarówno S2- do SO42- jak i jon metalu. At.
ferrooxidans należą do chemoautotrofów. Reakcje utleniania jonów Fe2+ i jonów S2- sprzężone są z reakcjami
fosforylacji i energia magazynowana jest w wysokoenergetycznych wiązaniach ATP. Energia ta jest następnie
wykorzystywana do chemolizy wody. Powstający przy tym czynnik zredukowany [H], redukuje produkt asymilacji
CO2. Czynnik utleniony [OH], redukowany jest przez ten sam związek nieorganiczny. Rozwój At. ferrooxidans
najlepiej przebiega przy pH około 2-2,5 a zanika przy pH = 4,5 . Optymalna temperatura wzrostu 28-370C ,
powyżej 650C ulegają zniszczeniu. Ponieważ są to bakterie aerobowe ich hodowla wymaga ciągłego
napowietrzania .
II. Przygotowanie pożywki do hodowli bakterii At. ferrooxidans.
Hodowlę prowadzi się w pożywce 9K Silvermana i Lundgrena - zwanej inaczej pożywką 9K, która zawiera 9g
żelaza w 1dm3 roztworu.
Pożywkę Silvermana i Lundgrena sporządza się mieszając dwa oddzielnie przygotowane i wyjałowione roztwory,
w proporcji 7: 3 (I i II roztwór).
I roztwór
(NH4)2SO4 - 0,6 g
KCl - 0,02 g
K2HPO4 - 0,1 g
MgSO4 x 7H2O - 0,1 g
Ca(NO3)2 - ślad
H2O - 140 cm3
Pożywkę sterylizuje się przez 20 min. w autoklawie.
II roztwór
FeSO4 x 7H2O - 8,84 g
10n H2SO4 - 0,2 cm3
H2O - 60 cm3
Pożywkę sterylizuje się przesączając przez lejek Schotta G-5.
III. Wykonanie ćwiczenia.
1. Sporządzić roztwór II w kolbie stożkowej o pojemności 250-300 cm3. Do przygotowanego roztworu II
dolać roztwór I (dostarczony przez prowadzącego) i całość wymieszać.
2. Do dwóch sterylnych kolb o poj. 250-300 cm3 rozlać po 100 cm3 przygotowanej wcześniej pożywki 9K.
Do nalewania pożywki używać cylindrów miarowych.
3. Do jednej kolby wprowadzić 2 cmł aktywnej hodowli bakterii A. ferrooxidans - HODOWLA. Do drugiej
kolby wprowadzić niewielką ilość sproszkowanego tymolu  KONTROLA.
Do pobierania hodowli bakteryjnej używać sterylnych pipet.
Kolby zatkać korkami z waty lub ligniny, które należy wykonać samemu.
Ćwiczenie nr 3,4 dr Sławomir Wierzba, dr Teresa Farbiszewska
Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Uniwersytetu Opolskiego
4. Opisać kolby wg wzoru:
HODOWLA: imię i nazwisko; nr grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli; rodzaj użytych
bakterii.
KONTROLA: imię i nazwisko; numer grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli.
5. W obydwu kolbach oznaczyć zawartość jonów Fe2+ i Fe3+ metodą podaną poniżej. Po wykonaniu
pomiarów, opisane kolby odstawić na miejsce wskazane przez prowadzącego.
6. Oznaczenie powtórzyć po tygodniu. Po zakończeniu ćwiczenia należy umyć używane szkło laboratoryjne.
Wyniki muszą być podpisane przez prowadzącego. Dopiero po ich zaakceptowaniu można wylać
zawartość kolb i umyć je.
Sprawozdanie do ćwiczenia:
7. Na podstawie uzyskanych wyników przedstawić na wykresie zmianę zawartości jonów Fe2+ i Fe3+ w
obydwu układach.
8. Znając ilość utlenionego przez bakterie żelaza (wykresy) obliczyć ilość energii zmagazynowanej w ATP, w
oparciu o równanie reakcji utleniania żelaza. Obliczenia można wykonać dla żelaza Fe2+ lub Fe3+.
IV. Oznaczanie zawartości jonów Fe2+ i Fe3+.
1. Oznaczenie przeprowadzić metodą kompleksometryczną, miareczkując roztwór z jonami żelaza roztworem
EDTA wobec wskaz
nika, którym jest roztwór kwasu sulfosalicylowego.
2. Do każdej z dwóch starannie umytych kolb stożkowych o pojemności 50 cm3 wprowadzić po 1 cm3
hodowli i po 10cm3 wskaz
nika (jeżeli w roztworze są obecne jony Fe3+ powinien się on zabarwić na kolor
fioletowy). Kolby ogrzewać do początku wrzenia roztworów, a następnie gorące roztwory miareczkować
0,025M roztworem EDTA do odbarwienia z koloru fioletowego na słomkowy. Zanotować ilości a cm3
EDTA. Następnie do kolb dodać nadsiarczanu amonu do zmiany barwy na fioletową i powtórnie
miareczkować EDTA do odbarwienia  b cm3.
Ilość nadsiarczanu amonu powinna być tak dobrana, żeby po zakończonym miareczkowaniu i
wprowadzeniu niewielkiej ilości utleniacza barwa roztworu nie uległa zmianie.
3. Powyższe czynności powtórzyć dla próby kontrolnej.
4. Ze wzorów obliczyć zawartość jonów Fe2+ i Fe3+ w 1 dm3 badanego roztworu:
A g/dm3 Fe3+ = a cm3 x 1.396
B g/dm3 Fe2+ = b cm3 x 1.396
UWAGA!!! roztwory pobierać sterylnymi pipetami
V. Zagadnienia teoretyczne:
1. Charakterystyka bakterii At. ferrooxidans.
2. Autotrofizm.
3. Chemosynteza.
4. Sposoby odżywiania bakterii.
5. Miareczkowanie kompleksometryczne.
6. Umiejętność wyliczania ilości utlenionego żelaza.
VI. Literatura:
1. Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998
2. Russel S.; Biotechnologia; Wyd. PWN; Warszawa; 1990
3. Kowal K., Libudzisz Z.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki A
ódzkiej; 2000
4. Ostrowski M., Sokołowska A., Małe bakterie wielka miedz
 czytelnia (B.W. ul. Oleska).