1.Fazy mikrorozmnażania i który jest najważniejszy, co to jest, kiedy się stosuje, cel

Etapy mikrorozmnażania:

1.Założenie kultury (wyłożenie wybranego, sterylnego eksplantantu pierwotnego na wybraną pożywkę i jego dalszy rozwój)

2.Masowe namnażanie (rozdzielanie i przenoszenie tworzących się pędów, pąków, mikrocebulek lub zarodków somatycznych na nowe pożywki).

3.Adaptacja uzyskanych in vitro roślin do naturalnego rozwoju.

Najważniejszy jest etap: 1

Mikrorozmnażanie – jest to wegetatywne rozmnażanie roślin w sterylnych warunkach laboratoryjnych na sztucznych pożywkach; warunki są ściśle kontrolowane, temperatura, wilgotność, natężenie światła.

Metoda mikrorozmnażania znalazła zastosowanie przede wszystkim w produkcji roślin, które słabo się rozmnażają wegetatywnie metodami tradycyjnymi.

2. Co to jest zmienność samoklonalna- podział i jak ją odróżnić w roślinach (tu chodziło o to że wyst. w niej kalus), powody tych zmian i objawy, opisać zmienność samoklonalną

Zmienność somatoklonalną – obiektem selekcji są głownie zawiesiny komórkowe, kalus, zarodki zygotyczne czy uzyskanie z nich siewki.
Podstawą selekcji w kulturach in vitro jest zmienność somatoklonalna.
Zmienność somatoklonalna jest klasyfikowana jako suma różnych zjawisk genetycznych takich jak mutacje genomu jądrowego i plazmatycznego powstającego pod wpływem warunków kultura oraz zmiany będące skutkiem stresu taki jak zwiększenie amplifikacji genów uaktywnienie trans pozonów, zmiany merylacji DNA.
Podział zmienności somatoklonalnej
- niedziedziczna zmienność somatoklonalna pojawia się w wyniku bezpośredniego wpływu warunków kultur a szczególnie regeneracji wzrostu. Może zostać wykorzystana jedynie w przypadku gatunków rozmnażanych wegetatywnie o ile utrzymuje się w kolejnych pokoleniach. Wykazuje dużą tendencję do zanikania w kolejnych pokoleniach.
- dziedziczna zmienność somatoklonalna mechanizm powstanie tego typu zmienności jest taki sam jak w przypadku mutacji. Zmiany dotyczą zarówno genomu jądrowego jak i genomów plastydowych i mitochondrialnych.
Zmienność somatoklonalna powstająca w kulturach spontanicznie może być kontrolowana tylko w ograniczony sposobów. Zmienność ta może być wynikiem genetycznego zróżnicowanie tkanek, z których składa się eksplantant pierwotny. Eksplantanty mogą zawierać tkanki o różnej poliploidalności i zmutowane komórki somatyczne które poza kulturą nie miałyby możliwości przekazanie zmienności zmiennych cech drogą genetyczną. Oprócz zmienności somatoklonalnej wpływa istotnie sposób wegetatywny roślin oraz niektóre czynniki kultury.
Indukowanie zmienności somatoklonalnej
- mutacje chemiczne np.:
▪ powoduje modyfikacje zasad azotowych, a w konsekwencji nieprawidłowy odczyt informacji zawartej z DNA (np. kwas azotowy, iperyt.)
▪ będące przyczyną nieprawidłowego wstawiania nukleotydów
- mutacje fizyczne
▪ promieniowanie jonizujące
▪ promieniowanie ultrafioletowe
▪ wysoka temperatura.

3. Wiruletne geny i ich znaczenie

Vir A 1 gen

Vir B 11 genów

Vir C 2 geny

Vir D 4 geny

Vir E 2geny

Vir F 1 gen

Vir G 2 geny

Vir H 1 gen

Rola genów wirulencji A i G jest aktywacja pozostałych genów. Geny Vir B kodują białka błonowe przez które przedostaje się odcinek T. Produkty genów Vir C i E biorą udział w ochronie i transporcie odcinka T. Geny Vir D SA odpowiedzialne za wycięcie odcinków T. Geny odc. F i H są związane z podtrzymaniem procesu rakowacenia, m.in koduja białka pełniące role detoksyfikatów, związków roślinnych utrudniających rozwój tumorów.

W procesie transformacji SA tez zaangażowane geny chr.A B i E leżące na chromosomie bakteryjnym. Białka kodowane przez 2 pierwsze geny są odpowiedzialne za połączenie bakterii z kom. Rosliny a trzeci bierze udział w aktywacji genów Vir.

4. Kultury zawiesinowe, dlaczego kultury zaw. Należy wytrząsać, fazy wzrostu kultury zaw., etapy kultur zawiesinowych, opisz struktury zaw., zawiesiny komórkowe

Kultury zawiesinowe (kultury zawiesin komórek)
Zawiesina komórek to populacja pojedynczych komórek lub niewielkich agregatów komórkowych intensywnie rosnące w rytmicznie wstrząsanej pożywce płynnej charakteryzująca się powtarzalnymi parametrami wzrostu. Wielkość 40-200 nm nie większe niż 3mm.
Do inicjacji kultur zawiesinowych wykorzystuje się
- luźny i podatny na rozbicie kalus – najlepszy
- drobno pocięte zarodki
- drobno pocięte blaszki liściowe
Kultury zawiesinowe prowadzi się zwykle w kolbach stożkowych umieszczonych na wytrząsarce rotacyjnej zarówno w ciemności jak i w świetle o niezbyt dużym natężeniu.
Sposoby hodowli w laboratorium
- system okresowy – w danej objętości pożywki komórki kontynuują podziały i wzrost aż do wyczerpania zapasów i kończy to rozwój kultury
- system ciągły wymiana pożywki na świeżą zapewnia stały dostęp do pożywki, usuwa metabolity toksyczne.
Etapy kultury zawiesinowej
- założenie kultury wielkość inokulum ustala się eksperymentalnie objętość pożywki nie powinna przekraczać 1/4 -1/5 pojemności naczynia
- wstrząsanie rozbicie tkanki na mniejsze fragmenty i uwalnianie się pojedynczych komórek; zapewnia jednolite warunki kultury
- filtrowanie ma na celu usuniecie resztek eksplantantu i zbyt dużych agregatów komórkowych
- pasażowanie zawiesiny czyli przenoszenie do świeżej pożywki odbywa się zwykle co 7-21 dni

5. Budowa tDNA
Fragment T
- geny odpowiedzalne za syntezę auksyn (iiM, iaaH) oraz cytokinien (itp.)
- gen biorący udział w morgogenezie tumorów (tml)
geny biotace udzial w syntezie (ops) i wydzielaniu opin (ocs)
Geny fragmentu T są zaopatrzone w sekwencja rozpoznawane przez czynniki transformacyjn e rosliny takie jak TATA – bedace sygnalem do rozpoczęcia transkrypcji czy AATAAA stanowiace sygnał do terminacji i poliaderykcji.
Fragment T jest z obu stron otoczony sekwencjami granicznymi i składającymi sia z prostych powtórzeń nukleotydów, które biorą udział w procesie integracji fragmentu T z genomem biorcy. Każda z sekwencji granicznych ma dłogość 25 par zasad.

W rejonie wirulencji o dłogości 30-40 kpz znajdują się geny wirulencji (vir) . 24 geny vir są ułozone w 8 operolach

6. Somatyczna embriogeneza (omówić), pośrednia somatyczna embriog., fazy somatycznej embriogenezey, embriogeneza somatyczna

Somatyczna embriogeneza – kierunek morfogenezy in vitro w którym z roślinnych komórek somatycznych formują się zarodki przybyszowe nie połączone wiązkami przewodzącymi z tkanką macierzystą, zarodki powstają z komórek które nie są produktem fuzji generatywnej.

Bezpośrednia – zarodki tworzą się bezpośrednio z komórek eksplantantu.

przykład Eksplantant – zarodek

Pośrednia – w trakcie procesu występuje faza kalusa, tkanki, z której komórek regenerowane są zarodki

przykład Eksplantant – kalus – zarodek.

Indukcja somatycznej embriogenezy zachodzi najczęściej pod wpływem auksyn.
Somatyczna embriogeneza przebiega w dwóch fazach

1. Indukcja – następuje pod wpływem auksyn powodujących odróżnicowanie komórek i ich podziały. Komórki potomne rozdzielają się ale tworzą zgrupowania zwane jako masa zarodkowa. Polega ona intensywnym podziałom nie zmieniając kierunku rozwojowego do czasu usunięcia auksyn z pożywki.

2. Różnicowanie – w masie zarodkowej przeniesionej na pożywkę bez auksyny następuje rozwój zarodków poprzez stadium globularne, sercowate, torpedy.

- dla prawidłowego kiełkowania zarodka powinny wykształcić funkcjonalne merystemy pędowe i korzeniowe co dokonuje się w procesie ich dojrzewania a sprzyjają temu zwiększona ilość sacharozy i dodatek ABA w pożywce.

Do kiełkowania somatycznych zarodków stosuje się pożywkę pozbawioną hormonów. W niektórych przypadkach poddaje się je wcześniej różnym zabiegom utrwalającym, takim jak np. wysuszanie.

7. Po czym poznać że organizm jest modyfikowany i jakimi metodami sprawdzić, czym cechują się rośliny transgeniczne(5 cech), sposoby rozmnażania org. Transgenicznych (PCR), co to są rośliny transgeniczne i czym się charakteryzują, metoda PCR, etapy i temperatura jaka jest przy elongacji -72, co to jest protoplast
Identyfikacja roślin transgenicznych
Ponieważ w genom roślinny zostaje wbudowany fragment T-DNA zatem elementami rozpoznania organizmu transgenicznego będą: promotor, sekwencja kodująca, terminator, marker selekcyjny .
Zatem kontrolę transgeniczność możemy przeprowadzić:
1. Na poziomie kw. nukleinowych za pomocą PCR
2. Na poziomie białek – analizuje się produkty białkowe transgenów.
PCR można stosować do powielania (amplifikacji) tylko takiego DNA, którego sekwencje początkowa i końcowa są znane. Naprowadzanie przez sterydy, polimeraza DNA syntetyzuje wiele kpi (ok. miliona) potrzebnego odcinka DNA. PCR jest niezwykle czuła: ze jej pomocą można wykryć pojedyncza kopię jakiejś sekwencji DNA gdyż PCR powieli ją tak mocno, że produkty amplifikacji staja się wykrywalne np. przez barwienie po elektroforetycznym rozdziale w żelu.

Aby powielić jakiś odcinek DNA metodą PCR, należy znać sekwencje nukleotydowe krótkich rejonów oskrzydlających okolice przeznaczone do amplifikacji. Umożliwia to zaprojektowanie dwóch syntetycznych oligonulkeotydów z których jedna na komplementory do sekwencji oskrzydlającej powielany odcinek DNA po jednej jego stronie a drugi po przeciwnej. Oligonuklotydy te służą jako startery do syntezy DNA in vitro, katalizowanej przez polimerazą DNA i jednocześnie określają długość powielanego odcinka DNA.

Punktem wyjścia PCR jest dwuniciowy DNA, każdy cykl reakcji rozpoczyna się od krótkiego ogrzania dwuniciowej cząsteczki w celu oddzielenia od siebie obu jej łańcuchów (etap 1) – denaturacja 95stC.

Po oddzieleniu łańcuchów mieszaninę reakcyjną oziębia się w obecności dużego molowego nadmiaru obydwóch oligonulkeotydów starterowych, co powoduje ich hybrydyzację z komplementarnymi sekwencjami na końcach rejonu powielanego (etap 2) – przyłączanie starterów 54stC.

Mieszaninę indukuje się następnie z polimerazą DNA i czterema trifosforami deoksyrybonukleotydów dzięki czemu zachodzi synteza DNA, rozpoczynająca się od każdego z
dwóch starterów – (etap 3) – elongacja 72 stC.

Cykl reakcji powtarza się od termicznej dysocjacji nowo utworzonych dwuniciowych cząsteczek DNA. W metodzie tej wykorzystuje się specjalną polimerazę DNA, izolowana z bakterii termofilnych. Polimeraza ta jest trwała w temperaturach znacznie wyższych niż eukariotyczna polimeraza DNA. Dzięki temu nie ulega denaturacji podczas termicznej denaturacji DNA.

8. Do czego służą geny chrA i E omówic

9. Symetryczne i asymetryczne mieszańce jądrowe

10. Metody postępowania z zarodkami mieszańcowymi

11. Opisz przebieg przejścia genu z bakterii na kom. Roślinną (związane z wir A wir B), rejon 8 genów (wirAiG, wir Bi C, wir D,wir Ci E, wir Hi F
Rola genów virA i virG jest aktywacja pozostałych genów vir. Geny virB kodują bialka błonowe przez które przedostaje się odcinek T. Produkty genów vir C i vir E biorą udział w ochronie i transporcie odcinka T. Geny vir D są odpowiedzialne za wyciecie odcinka T. Geny vir F i vir H są związane z podtrzymywaniem procesu reakowacenia min kodujące białka pełniace rolę detoksyfikatów zawiązków roślinnych utrudniających rozwój tumorów.
W procesie transformacji sa też zaangażowane geny virA i vir E leżace na chromosomie bakteri. Bialka kodowane przez dwa prawe geny sa odpowiedzialne za połaczenie bakterii z komórka roslinną a trzecie bierze udział w aktywacji genów vir.
Dla bakteri sygnałem do informacji są związki fenolowe lub i cukry uwalniane ze zranionej tkanki roslinnej, np. acetosyringon – r. Solanaceae, alkochol koniferylowy, pochodne kwasów benzoesowego i cynamonowego. Cząsteczki te wiążą się z receptorami błonowymi bakterii. W skład receptowór vir wchodzą produkty genów vir A i vir E tworząc kompleks aktywujący gen vir G.
Białko vir G wiąze się ze specyficznymi miejscami promotorów pozostałych genów rejonu vir, stymulując ich transkrypcje.
Dwa regiony operonu vir D: vir D1 i vir D2odpowiadaja za wyciecia fragmentu T, kodują białka vir D1 i vir D2 o aktywności endonukleazy. Wycięcie rozpoczyna się w specyficznym miejscu prawej sekwencji granicznej a naspępnie lewej.
Do końca 5 wycietego jednoniciowego fragmentu T wiązą się kowelancyjnie białka vir D2 chroniąc go w ten sposób przed egzonukleazami.
Nastepnie białko vir E2 łaczy się jednociciowym fragmentem T i chroni go tworząc kompleks nukleoptoteinowy.

12. Trotipotencja
Trotipotencja – zdolność do odtworzenia całej rośliny z pojedynczej komórki.

Każda żywa komórka nawet zróżnicowana, zawiera pełną informację genetyczną, która w odpowiednich warunkach może zostać uruchomiana i doprowadzić do regeneracji poszczególnych organów bądź całej rośliny. Warunkiem warunkującym trotipotencje jest pozbawienie komórki korelatywnego wpływu organizmu macierzystego. W praktyce polega to na wyizolowaniu i przeniesieniu komórek na pożywkę zawierającą odpowiednią kombinację roślinnych regulatorów wzrostu i rozwoju.

13. Dyferencjacja (odróżnicowanie komórek)

Dyferencjacja – odróżnicowanie niezbędne do ponownego podjęcia podziałów komórkowych – uaktywnienia zablokowanych genów

Bodźce wyzwalające dyferencjację w kulturach in vitro

- odizolowanie komórek i tkanek od rośliny matecznej

- wpływ regulatorów wzrostu zastosowanych w pożywce

Redyferencjajca – powtórne różnicowanie 0dmłodzonych komórek – ponowne zablokowanie genów.

14. Bezpośrednie metody transformacji, pośrednia transformacja, na czym polega, zalety transformacji za pomocą agrobacterium, wady i zalety transformacji , metoda pośrednia transformacji
Transformacja roslin
- rośliny należą do najłatwiej transformowalnych wsród organów wyzszych
- do ich transformacji używane sa zarówno metody fizyczne jak i biologiczne
- do niedawna rosliny były jedynymi transgenicznymi organizmami dopuszczonymi do uzytki powszechnego

Metody transformacji
- wektorowe (pośrednie) polegają na wykorzystaniu bakteri z plazmoidem zawierającym transgen
- bezwektorowe (bezposrednie) gen wprowadza się do komórek biorcy bez posrednictwa bakterii.

Metoda wektorowaz uzyciem A.tumerfaciens
Transformacja z uzyciem A. transfaciens jest procesem zależnym od
- właściwosci bakterii
- rodzaju infekowanej tkanki roslinnej
- czynników środowiskowych
jego istotą jest przekazanie przez bakterie komórkom roslinnym fragmentu zwanego T-DNA stosowanego części plazmoidu Ti
Metody otrzymywania tranzgenicznych roślin.
1 Metody wektorowe – wykorzystanie plazmidu Ti z bakterii A. tumefaciens (guzowatość korzeni) posiadajacego naturalną zdolność wbudowywania swojego DNA do genomu roślin, w celu wprowadzenia transgenów proces ten nazywany jest TRANSFEKCJĄ.
A. rhizogenes – plazmid Ri wywołuje powstawanie dużej ilośći korzeni włośnikowych. Plazmid Ti kolista cząsteczka DNA o wielkośći 200 kpz ( kilo par zasad) replikująca się niezależnieod chromosomu bakteryjnego.
W procesach wykorzystujacych Agrobacterium najczęściej wykorzystuje się kulture in vitro biorcy, wybierając dobrze regenerujace eksplantanty. Procedura ta składa się z następujacych etapów:
1. Indukcja zwana także kokulturą, polega na umieszcczaniu eksplantantów w roztworze bakterii.
2. Wstepne pozbycir się nadmieru bakterii przez wyplukanie eksplantantów w wodzie lub pożywce i/lub osuszenie na bibule filtrujacej.
3. Umieszczenie eksplantantów na pozywce stymulujacej regeneracje pedów zawierajaca jednoczesnie antybiotyki w celu eliminacji baktrii.
4. Umieszczenie eksplantantu na podlożu z odpowiednim czynnikiem selekcyjnym.
5. Regeneracja rosliny.

Zalety transformacji za pomoca Agrobacterium
- jest metoda wykorzystujacą naturalne właściwości tej bakteri,
- w czasie transformacji wprowadzany fragment jest ochraniany,
- jest to metoda o stosunkowo dużej wydajności wynikajacej z wysokiej czescości integracji fragmentu T z genomem roslinnym,
- Istnieje mozliwość jednoczesnego wprowadzenia kilku szczepów bakterii zawierających różne geny. W stosunku do roślin jednoliściennych metoda to okazała się mniej skuteczna i ograniczyła się tylko do kilku gatunków Asparagus officinalis (szparag), Oryza sativa (ryż siewny), Zea mays (kukurydza), Triticum aestivum (pszenica zwyczajna).

15. Rejon wirulencji co to jest
W rejonie wirulencji o dłogości 30-40 kpz znajdują się geny wirulencji (vir) . 24 geny vir są ułozone w 8 operolach

16. Ryż jako roślina transgeniczna
Ryż
- zwiększona produkcja beta-karotenu, prekursora witaminy A - wszczepione został geny pochodzące z żonkila, modyfikacja w zamierzeniu miała rozwiązać problem braku witaminy A u dzieci w Azji Wschodniej.

17. Kultury kalusa co to jest kalus embriogenny czy morfogenny i co powoduje,
Kultury kalusa
- w naturze formowanie tkanki kalusowej (przyrannej) to odpowiedz rośliny na urazy mechaniczne, spowodowane infekcja mikroorganizmów lub uszkodzeniami przez zwierzęta roślinożerne,
- w warunkach in vitro kalus może powstać z każdego fragmentu żywej tkanki czy organu wyizolowanego z rośliny macierzystej i umieszczonego na pożywce zawierającej odpowiednie substancje odżywcze oraz regulatory wzrostu i rozwoju (głównie cukry)

Tempo formowanie się kalusa zależy m.in. od budowy eksplantantu
- eksplantanty zawierające tylko komórki macierzyste szybko tworzą kalus,
- jeśli natomiast w eksplantancie znajdują się głównie komórki zróżnicowane, ulegają one namnażaniu odróżnicowaniu i staja się merystematyczne a dopiero później w wyniku powtórnego różnicowania tworzą kalus trwa to zwykle od 2 do 4 tygodni.
- kalus może powstać tylko w miejscu cięcia rośliny jak także na całej powierzchni eksplantantu
- po uformowaniu na eksplantancie kalus zazwyczaj odcina się i przenosi na nowe pożywki (pasażuje się) celem dalszego namnażania komórek a potem stymuluje się regeneracje roślin
- inicjacja kalusa odbywa się zwykle w ciemności natomiast namnażanie i regeneracja roślin może zachodzić zarówno w ciemności jak i pod wpływem działania światła.

Powstający w kulturach in vitro kalus różnią się
- rodzajem i liczba tworzących go komórek
- strukturą (zwarta, luźna, jednolita, grudkowata)
- barwą biała  żółta  czerwona  zielona
- konsystencja twarde, miękkie, suche, wilgotne
- stabilnością genetyczna ( zmiany kariotypu dotyczące liczby i budowy chromosomów) – poliploidy, haploidy, aneuploidy
- zdolnościami rozwojowymi kalusy morfogenne, organogenne i embriogenne oraz niemorfogenne – proliferacja
- kompetencja komórek kalusa nie jest stała cechą. Różnice te wynikają m.in. z pochodzenia i rodzaju eksplantantu wieku kalusa, składu chemicznego pożywki oraz warunków prowadzenia kultury.

Zdolności rozwojowe kalusa in vitro
Eksplantant  indukcja kalusa  kalus  (morfogenne) korzenie, pędy, zarodki somatyczne, (niemorfogenne) poliferacja kalusa.
kalus embriogenny czyli zarodkotwórczy

18. Markery selekcyjne co to są, marker selekcyjny, geny selekcyjne

Gen selekcyjny, gen markerowy – gen, którego produkt pozwala na oddzielenie transformowanych komórek od tych, które nie uległy transfekcji. Wyróżniane są pozytywne geny selekcyjne, których obecność w komórce pobudza wzrost tkanek oraz negatywne geny selekcyjne, których obecność prowadzi do śmierci transformowanej tkanki

19. Budowa plazmidu Ti i charakterystyka, opisać plazmid. I wymienić rodzaje Ti i Ri, budowa Ti co nazywamy plazmidem

A. rhizogenes – plazmid Ri wywołuje powstawanie dużej ilośći korzeni włośnikowych. Plazmid Ti kolista cząsteczka DNA o wielkośći 200 kpz ( kilo par zasad) replikująca się niezależnieod chromosomu bakteryjnego.
Plazmid pomocniczy jest modyfikowanym plazmidem Ti, nie ma on rejonu T ale zawiera region vir którego geny aktywnie uczestniczą w wycinaniu fragmentu DNA zawartego pomiędzy sekwencjami LB-RB wektora binarnego.

20. Sposoby sterylizacji pożywek

1) Sterylizacja w autoklawie - pożywki najczęściej jałowi się na mokro, w gorącej parze wodnej a aparatach zwanych autoklawami. W urządzeniach tych wykorzystuje się nadciśnienie pary wodnej, co umożliwia podwyższenie temp. powyżej 100°C. Autoklaw to hermetycznie zamknięty kocioł stalowy o podwójnych ścianach i dnie, który jest zaopatrzony w manometry, termometr, zawór bezpieczeństwa, elektryczny system grzewczy i wodowskaz. Większość pożywek sterylizuje się przy ciśnieniu 0,1 MPa w ciągu 20-30 minut.

2) Pasteryzacja - jest to proces działania na drobnoustroje temperaturą do 100°C. Pasteryzację pożywek prowadzi się w aparatach Kocha, w którym czynnikiem wyjaławiającym jest bieżąca para wodna o temperaturze około 100°C. Wyjaławiany materiał ustawia się na ażurowych półkach. Czas pasteryzacji zależy od objętości i rodzaju wyjaławianego materiału i wynosi 15-60 minut. Podczas tego procesu niszczą się tylko formy wegetatywne drobnoustrojów, nie niszą się formy przetrwalne.

3) Tyndalizacja - jest to proces trzykrotnej pasteryzacji (100°C przez 30 minut) przeprowadzanej w odstępach co 24 godziny w celu pełnego wyjałowienia pożywek. W przerwach między wyjaławianiem podłoże umieszcza się w cieplarce w temp. 32°C. W pierwszej fazie giną formy wegetatywne. Tyndalizacja prowadzi do pełnej jałowości- niszczy formy wegetatywne i przetrwalne drobnoustrojów.

21. Standardowa krzywa wzrostu 5faz
Standardowa krzywa wzrostu ma kształt sinusoidy i można w niej zaznaczyć 5 faz:
1) spoczynkowa – adaptacja komórek do warunków środowiska
2) wykładnicza – intensywny podział komórek
3) wzrostu liniowego – intensywny wzrost komórek tempo podziału maleje
4) obniżonego wzrostu – komórki osiągają swoje maksymalne rozmiary ustają podziały komórkowe. Tworzą się agregaty komórkowe (zwiększanie intensywności mieszania zapobiega temu)
5) stacjonarna – może dochodzić do obumierania pojedunczych komórek

22. Co zawiera fragment t

Fragment T
- geny odpowiedzalne za syntezę auksyn (iiM, iaaH) oraz cytokinien (itp.)
- gen biorący udział w morgogenezie tumorów (tml)
geny biotace udzial w syntezie (ops) i wydzielaniu opin (ocs)
23. Jak rozpoznać czy dana roślina jest odporna na konkretny szczep bakterii bądź kulturę mikroorganizmów

24. Co to jest eksplantant?

Eksplantant – wyizolowany fragment rośliny umieszczony na podłożu (pożywce) o odpowiednio dobranym składzie.

25. Czynniki selekcji

Przykłady czynników selekcyjnych w odniesieniu do określonej cechy

Czynnik selekcyjny	Cecha
Stosowana chemia - streptomycyna - herbicydy - jony metali - NaCl	Odporność - antybiotyki - środki ochrony roślin - metale ciężkie - zasolenie
Wyciągi i koncentraty z kultury mikroorganizmów patogennych (np. Fusarium oxysporum)	Odporność na Fusarium
Intensywność elisytory bakterie Erwinia carotoworum	Odporność na dana bakterię
Czynnik fizyczny - niska temperatura - wysokie ciśnienie osmotyczne pożywki	- Mrozoodporność - tolerancja na suszę

26. Gen odpowiedzialny za przenoszenie plazmidu miedzy bakteriami

27. Gen odpowiedzialny za katabolizm

28. Miejsce Inicjacji replikacji

29. Jakie związki zawierają auksyny (podać przykłady auksyn) Auksyny i ich działanie, wymienić
role cytokinin w kulturach in vitro, przykłady i działanie regulatorów

Auksyny
-syntetyzowane są przede wszystkim w młodych częściach roślin, wierzchołkowych pędów, młodych liściach i owocach.
- stymulują wzrost wydłużeniowy komórek, tworzenia korzeni, indukują powstawanie owoców, partenokarpu. Uczestniczą w regulacji dominacji wierzchołkowej.
- w kulturach in vitro auksyny inicjują przedziały komórkowe, w konsekwencji dochodzi, do wytworzenia kalusa, powodują również elongację komórek oraz stymulują tworzenie korzeni, a także indukują somatyczną embriogenezę,
- w kulturach in vitro wykorzystywane są zarówno auksyny naturalne jak i syntetyczne.
Auksyny wzory:
a) naturalne IAA – kwas indololo-3-octowy,
IBA – kwas indolilo-3-maslowy,
b) syntetyczne 2;4 D – 2,4-dichlorofenoksyoctowy
NAA – kwas alfa-naftylo-1-octowy
piktoram – kwas 4-amino-3,5,6-trichloropikolonowy (?)
dicamba – kwas 2-metoksy-3,6-dichlorobenzoesowy
Cytokininy
- miejscem syntezy cytokininy są wierzchołki korzeni, kambium, rozwijających się liściach, pakach, owocach oraz kiełkujące nasiona,
- stymulują podziały komórkowe i opóźniają starzenie oraz stymulują kiełkowanie nasion, powodują ustępowanie spoczynku pąków znoszą dominacją wierzchołkowa, hamują tworzenie i wzrost korzeni,
- w kulturach in vitro cytokininy wykorzystywane są w celu indukcji podziałów komórek, merystemów pędowych, znoszenie dominacji wierzchołkowej (co umożliwia wyrastanie pąków bocznych) zahamowanie tworzenia korzeni oraz opóźnienie procesów starzenia.

Tranz-zeatyna
2iP – 6 (yy dimetyloallioamino)-puryna – naturalna
BA – 6 benzoyloaminopuryna
PBA -
TDZ –

30. Metody eliminacji wirusów, jak je wyeliminować

1. Kultury in vitro merystemów wierzchołkowych
Fragmenty merystemów (0,2 – 1,0 mm dł.) izoluje się z
- pąków wierzchołkowych lub bocznych,
- kultury merystemów indukuje się w pomieszczeniu o temp. 18 -22 st. C przy doświetlaniu światłem ciągłym stosują pasaże na świeżą pożywkę co 3-4 tygodnie. Duże znaczenie ma przygotowanie roślin do przeniesienia ze szkła do doniczki ( pasaż na pożywkę ukorzeniającą o zwiększonej zawartości auksyn, zmniejszonym stężeniu soli mineralnych oraz bez sacharozy) zabieg ten ułatwia roślinom podjęcie fotosyntezy i powrót do samożywności. Po czym otrzymujemy roślinę odpowiednia do wysadzenia na podłoże glebowe. Po przeprowadzeniu pierwszego testowania i wyeliminowania roślin podejrzanych o zawirusowanie otrzymujemy elitarny matecznik, który utrzymuje się w warunkach pełnego zabezpieczenia przed wtórną infekcją. Rośliny mateczne co trzy miesiące poddawane są regularnym kontrolom fitosanitarnym.

2. Chemioterapia
– Antymetabolity należą do związków o wysokiej aktywności przeciwwirusowej są to substancje włączające się w metabolizm wirusów i wywołujące zmiany w kodzie genetycznym RNA wirusowego, hamując ich namnażanie się. Należy do nich analogi pirymidyn – uracyl, troiuracyl, bromuracyl oraz analogi puryn. Najczęściej są stosowane jako dodatki do pożywki dla kultury merystemów.
- Takie niektóre surfaktanty wykazują właściwości podobne do antymetabolitów np. DEMEB (białek dodecylo-N-metyloefedryny) i są stosowane jako dodatek to pożywki

3. Termoterapia
- Traktowanie eksplantantów wyłożonych na pożywkę (np. merystemów wierzchołkowych, pędowych czy kalusa) podwyższona temperaturą (36 st. C podczas dnia i 30 st. C w nocy przez 4-8 tygodni) eliminuje wiele wirusów nawet niektóre gatunki bakterii systemicznych zasiedlających tkanki przewodzące roślin.
-Warunki terapeutyczne dobiera się eksperymentalnie dla konkretnego gatunku rośliny rodzaju wirusa uwzględniając zakres temperatur tolerowanych przez roślinę; a jednocześnie mieszczących się pomiędzy optimum inaktywującym wirusa a maksimum tolerowanym jeszcze przez eksplantant,
- Termoterapia in vitro np. Vitis vinifera dały najlepsze rezultaty kiedy traktowano podwyższona temp. 36 st.C przez 6 tygodni ukorzenione rośliny. Niektóre świeżo izolowane merystemy bardzo źle znosiły ten zabieg zwłaszcza ze należało go powtórzyć 2x aby uzyskać całkowitą eliminacje wirusów.

4. Krioterapia
- Większość wirusów toleruje niska temperaturę podczas krioprezerwacji eksplantantów. Tylko niektóre grupy termolabilarnych wirusów roślinnych może być eliminowane przez mrożenie.
- Przykładem może być szaraka śliwy który eliminowano stosując metodę kombinowana czyli izolacje małych merystemów wierzchołkowych pędów (od 0,3 do 1mm) i krioterapia.
- Izolowane merystemy Prunus wyłożono na 24 godziny do pożywki zawierające 5% DMSO (dimetylosulfotlenek) i 2% proliny, po czym schłodzono do 4 st.C.
- Następnie przełożono je na 20 do 40min do mieszaniny krioprotektantow PVS2 (12% DMSO, 15% glikolu etylenowego, 25% glicerolu, 3% glikolu polietylenowego i 0,4% M-Sacharozy).
- Po prakulturach merystemy poddany powtórnemu schłodzeniu (-1st.C na 1min) i potem do temp 40st.C po czym zanurzono ich w ciekłym azocie -169st.C
- Następnego dnia merystemy odmrożono i wyłożono na pożywkę MS. Przeprowadzone po 4 miesiącach testowanie metoda PCR wykazało ze 54% roślin zostało uwolnionych od wirusa.

31. Komórki kompetencyjne
kompetencja komórek kalusa nie jest stała cechą. Różnice te wynikają m.in. z pochodzenia i rodzaju eksplantantu wieku kalusa, składu chemicznego pożywki oraz warunków prowadzenia kultury.

32. Rodzaje promotorów i opisać
Promotory:

- promotory nieswoiste,

- promotory tkankowo swoiste,

- promotory indukowane chemicznie

Promotory nieswoiste:

- to najczęściej promotory kontrolujące syntezę transkryptów 19 s i 35s wirusa mozaiki kalafiora

- powodują wysoką wydajność ekspresji

- są one niepodatne na regulację przez światło

Zastosowanie:

- wzmocnienie syntezy pożądanych związków

- zwiększenie odporności na patogeny

Promotory tkankowe swoiste:

- sterują tkanką swoistą ekspresją genów

Przykłady:

- B330 swoisty dla bulw s.Tuberosum

- ST- LS1- swoisty dla liści

Promotory indukowane chemicznie:

- mają zastosowanie szczególnie wtedy obcego genu wpływa na wzrost i rozwój rośliny lub obcy gen ma ulec ekspresji w określonym miejscu i czasie.

Przykłady:

-PR-1a- aktywowany atakiem patogenu uruchamiający geny odpowiedzi i obrony

-In 2-2- aktywowany bafenerem, wzmacniający tolerancję na herbicydy

33.Fazy wnikania DNA do kom. Roślinnej, proces wprowadzania Dna genomu do kom. Rośl

Proces wprowadzania DNA go genomu do komórki roslinnej obejmuje 3 podstawowe fazy:
1. Klonowanie i modyfikowanie DNA dokonuje się w plazmidach z wykorzystaniem rekombinacji DNA
Aby do plazmidu wprowadzić DNA przeznaczone do klonowania oczyszczony plazmidowy DNA poddaje się działaniu nukleazy restrykcyjnej, która go przecina tylko z jednym miejscu i z tak rozcietym plazmidem łaczy się kowalencyjnie za pomocą ligazy DNA przeznaczony do klonowania fragmen DNA (insert)
2.Przeniesienie plazmidu zawierajacego skonstruowany gen do Agrobactwrium na drodze koniungancji.
Proces transformacji komórki roslinnej zachodzi zarówno, gdy funkcja vir T-DNA ulokowane są na tych samych lub oddzielnych plazmidach w Agrobecterium. Cecha te umozliwiła opracowanie dwóch systemów wektorowej transfrormacji.
I.To system kointegracyjny (cis), w którym nowe geny wprowadzane są drogą homologicznej rekombinacji do T-DNA obecnego w plazmidzie Ti.
II.To system binarny (trans), w którym nowy gen ulokowany zostaje w T-DNA plazmidu zdolnego do replikacji w Agrobacterium, i nastepnie wprowadzony do komórki Agrobacterium zawierającej tzw. rozbrojony (pozbawiony T-DNA) plazmid Ti (Ri). W tym przypadku plazmid Ti pełni funkcję plazmidu pomocniczego, indukującego przez geny wirulencji proces przenoszenia DNA z plazmidu binarnego.

Plazmid pomocniczy jest modyfikowanym plazmidem Ti, nie ma on rejonu T ale zawiera region vir którego geny aktywnie uczestniczą w wycinaniu fragmentu DNA zawartego pomiędzy sekwencjami LB-RB wektora binarnego.

3. Przenoszony fragment DNA ulega integracji z genomem rośliny podczas wspólnej inkubacji (kokultywacji) Agrobacterium z komórkami roślinnymi lub eksplantatami.
Dla dokonania selekcji transformantów, u których wprowadzony gen nie wywołuje łatwo dostrzegalnych zmian fenotypowych, wymagane są konstrukty plazmidowe posiadające oprócz genu, którego ekspresję chcemy badać, także gen selekcyjny (markerowy) oraz gen reporterowy.
Przykładami są:
▪Beta – glukuronidaza (GUS)
Obecnie najczęściej stosowany gen pochodzący z E.coli
Użyteczność GUS jako enzymu reporterowego wynika z jego małej endogennej aktywności u badanych dotychczas roślin.

34. Co to jest habituacja

Habituacja, anergizacja

- to zjawisko stopniowego uzależniania się kalusa od egzogennych auksyn i/ lub cytokinin oraz przystosowania się do wzrostu na pożywce bez lub przy znacznym obniżeniu ich zawartości.

- zjawisko habituacji względem auksyn i względem cytokinin mogą występować niezależnie

lub jednocześnie w tym samym kalusie.

35. Wyjaśnić kompetencje co to jest

Kompetencja – zdolność komórki do odbierania sygnałów i reagowania na nie za pomocą odpowiedniego receptora.

36. Adaptacja do warunków in vivo
Adaptacja do warunków in vivo.
▪ Ponieważ rośliny z kultur in vitro charakteryzują się
- znacznym uwodnieniem tkanek,
- słabym zdrewnieniem,
- niecałkowicie wykształcona tkanką okrywającą
- niefunkcjonalnymi aparatami szparkowymi.
▪ Dlatego też są podatne na wysychanie i porażanie przez choroby i szkodniki.
▪ z tego powodu w okresie adaptacji należy je chronić przed wysychaniem o zakażeniem wykorzystując szklarnie, mnożarki, pokoje wzrostowe o ustalonych warunkach temperatury, światła i wilgotności.

37. Rejon vir co to jest opisac geny vir
Rola genów virA i virG jest aktywacja pozostałych genów vir. Geny virB kodują bialka błonowe przez które przedostaje się odcinek T. Produkty genów vir C i vir E biorą udział w ochronie i transporcie odcinka T. Geny vir D są odpowiedzialne za wyciecie odcinka T. Geny vir F i vir H są związane z podtrzymywaniem procesu reakowacenia min kodujące białka pełniace rolę detoksyfikatów zawiązków roślinnych utrudniających rozwój tumorów.
W procesie transformacji sa też zaangażowane geny virA i vir E leżace na chromosomie bakteri. Bialka kodowane przez dwa prawe geny sa odpowiedzialne za połaczenie bakterii z komórka roslinną a trzecie bierze udział w aktywacji genów vir.
Dla bakteri sygnałem do informacji są związki fenolowe lub i cukry uwalniane ze zranionej tkanki roslinnej, np. acetosyringon – r. Solanaceae, alkochol koniferylowy, pochodne kwasów benzoesowego i cynamonowego. Cząsteczki te wiążą się z receptorami błonowymi bakterii. W skład receptowór vir wchodzą produkty genów vir A i vir E tworząc kompleks aktywujący gen vir G.
Białko vir G wiąze się ze specyficznymi miejscami promotorów pozostałych genów rejonu vir, stymulując ich transkrypcje.
Dwa regiony operonu vir D: vir D1 i vir D2odpowiadaja za wyciecia fragmentu T, kodują białka vir D1 i vir D2 o aktywności endonukleazy. Wycięcie rozpoczyna się w specyficznym miejscu prawej sekwencji granicznej a naspępnie lewej.
Do końca 5 wycietego jednoniciowego fragmentu T wiązą się kowelancyjnie białka vir D2 chroniąc go w ten sposób przed egzonukleazami.
Nastepnie białko vir E2 łaczy się jednociciowym fragmentem T i chroni go tworząc kompleks nukleoptoteinowy.
W tej formnie fragmen T jest transportowany do komórek roślinnych, oba białka tworzace kompleks z fragmentem T biora udział w jego integracji z genomem roslinnym.
38. lucyferaza i GPF
▪Lucyferaza (LUC) Lucyferaza ze świetlików (Photinus pyralis) katalizuje zależne od ATP utlenienie lucyferyny (naturalny pigment występujący w komórkach niektórych bakterii i świetlików), któremu towarzyszy emisja światła. Enzym wykazuje dużą specyficzność w stosunku do lucyferyny. Brak układu enzym-substrat w roślinach oraz znaczna czułość reakcji powodują iż jest to dogodny enzym reporterowy.
Zielone białko fluoryzujące (ang. greek fluorescent protein, GFP)
GFP jest bardzo użytecznym białkiem w biologii molekularnej komórki. Jego łatwa wizualizacja i brak toksyczności wobec organizmów żywych sprawia, że znakomicie sprawdza się jako cząsteczka reporterowa, służąca do badania np. aktywności promotorów lub wydajności transfekcji komórek. Dodatkowo, metodami inżynierii genetycznej można tworzyć białka funkcyjne złożone z GFP i badanego białka, co pozwala na uwidocznienie lokalizacji tego białka w komórce lub zmiany tej lokalizacji pod wpływem różnych czynników

39. Co to jest ryzogeneza (organogeneza korzeniowa)
ryzogeneza (ang. rhizogenesis) - organogeneza korzeniowa; powstawanie korzeni "od nowa", tj. w tkankach które w momencie zakładania hodowli nie zawierały zawiązków korzeni
Ukorzenianie
- pędy powstające w wyniku rozkrzewiana oddziela się od eksplantantu inicjalnego i przenosi na pożywkę stymulującą ukorzenianie co osiąga się najczęściej przez dodawanie auksyn (u niektórych gatunków ukorzenianie następuje pod koniec pasażu namnażania, stymulacja ukorzeniania zachodzi też pod wpływem retardantów, floroglucyralu, wit D, aminokwasów.

40. Pędogeneza
Namnażanie pędów
- celem jest uzyskanie pożądanej liczby pądów więc w zależności od wydajności, namnażanie polega na wykonaniu odpowiedniej ilości pasaży (może sterować najdłuższy okres ?)
- w zależności od gatunku, z nawet genotypu w składzie pożywki uwzględnia się cytokininy, auksyny i gibereliny.

41. Metody bezwektorowe wymienić opisać zalety wady
Metody bez wykorzystania wektora
Są to metody polegające na bezpośrednim wprowadzeniu DNA do komórek roślinnych pozwalają one na transformowanie dowolnych roślin.
Nim fragment będzie mógł być wprowadzony do komórki gospodarza ta musi być pozbawiona ściany komórkowej (oprócz mikrowstrzeliwania) By to osiągnąć można poddać ja działaniom enzymów degradujących ścianę komórkową. Otrzymuje się w ten sposób tzw. protoplast którego błona komórkowa stanowi kolejna barierę dla transgenu, wprowadzane do komórek z wykorzystaniem jednej z metod, ogólnie podzielonych na fizyczne i chemiczne.
Mikrowstrzeliwania
● wykorzystuje mikroskopijne kulki za złota lub wolframu o śr. 0,5 – 5 mikrometra. Fragment DNA którego pragnie się wprowadzić do komórek są opłaszczone na tych kulkach a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych.
Zaleta: możliwość transformowanie wszystkich rodzajów tkanek.
Wada: konstrukt genomu nie jest chroniony co naraża go na uszkodzenia.
Mikroiniekcja
● polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły mikromanipulatora (mikropipety)
Elektroporacja
● polega na wykorzystaniu serii impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstawanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki.
● może być stosowana tez przy wprowadzaniu genów do innych komórek – zwierzęcych, bakteryjnych.
Z użyciem PEG polega na wykorzystaniu glikolu polietylenowego który powoduje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez doprowadzenie do jej całkowitej odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wnikniecie transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym.

42. Metoda peg
PEG polega na wykorzystaniu glikolu polietylenowego który powoduje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez doprowadzenie do jej całkowitej odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wnikniecie transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym.