BIOTECHNOLOGIA

POJ

Ę

CIA:

1

.

Biotechnologia jest interdyscyplinarn

ą

dziedzin

ą

ł

ą

cz

ą

c

ą

w sobie nauki techniczne i przyrodnicze,

obejmuj

ą

c

ą

badanie, wytwarzanie i wykorzystanie DNA/RNA, białek/enzymów, drobnoustrojów, kultur

komórkowych w procesach modyfikacji genetycznej, biosyntezy, biotransformacji, bioutylizacji a tak

ż

e

wyodr

ę

bnianie i modyfikacje tak otrzymanych bioproduktów.

2. Biotechnologia tradycyjna- przebiegaj

ą

ca z u

ż

yciem drobnoustrojów i komórek organizmów

wy

ż

szych ni

ż

zawieraj

ą

cych obcego materiału genetycznego

3. Biotechnologia nowoczesna gdzie stosowane s

ą

szczepy drobnoustrojów lub inne linie

komórkowe skonstruowane metodami in

ż

ynierii genetycznej

4. In

ż

ynieria genetyczna-ingerencja w materiał genetyczny organizmów, w celu zmiany ich

wła

ś

ciwo

ś

ci dziedzicznych. Polega na wprowadzaniu do komórek organizmu biorcy, okre

ś

lonego

odcinka DNA dawcy.
5. Biotechnologia czerwona wykorzystywana w ochronie zdrowia i medycynie. Jest wa

ż

nym i

dynamicznie rozwijaj

ą

cym si

ę

obszarem biotechnologii, w szczególno

ś

ci w zakresie produkcji nowych

biofarmaceutyków, rozwoju diagnostyki genetycznej, geoterapii i
ksenotransplantologii.
6. Biotechnologia zielona zwi

ą

zana jest z rolnictwem, obejmuje zastosowanie metod in

ż

ynierii

genetycznej w celu doskonalenia produkcji ro

ś

linnej i zwierz

ę

cej. Wa

ż

nym obszarem jest

wprowadzanie transgenicznych ro

ś

lin do produkcji szczepionek doustnych i rekombinowanych białek

a tak

ż

e wykorzystanie tych

ż

e ro

ś

lin jako surowców odnawialnych w biorafineriach.

7. Biotechnologia biała- biotechnologia przemysłowa wykorzystuj

ą

ca systemy biologiczne w

produkcji przemysłowej i ochronie

ś

rodowiska

8. Fermentacja- z łac. burzenie si

ę

. W praktyce biotechnologicznej słu

ż

y do okre

ś

lania przemian

chemicznych w wyniku aktywno

ś

ci metabolicznej drobnoustrojów czyli obejmuje zarówno fermentacje

beztlenowe jak np. fermentacj

ę

etanolow

ą

jak równie

ż

tlenowe np. fermentacj

ę

octanow

ą

.

9. Mikroorganizm (drobnoustrój) - organizm obserwowany dopiero pod mikroskopem.
Mikroorganizmami s

ą

bakterie, archeany, pierwotniaki i niektóre grzyby.

10. Komórka prokariotyczna- komórka nie posiadaj

ą

ca j

ą

dra komórkowego. Podstawowym

materiałem genetycznym jest nukleoid. Materiał genetyczny nie jest oddzielony od reszty komórki

ż

adn

ą

błon

ą

.

11. Komórka eukariotyczna - materiał genetyczny tej komórki jest umieszczony w j

ą

drze.

Zawieraj

ą

ce DNA z histonami upakowane w chromosomy.

12. J

ą

dro- najwa

ż

niejsze z organelli komórkowych wyst

ę

puj

ą

ca w komórkach organizmów j

ą

drowych

(Eukarionty), odgrywaj

ą

ca decyduj

ą

c

ą

rol

ę

w przekazywaniu cech dziedzicznych i przebiegu

przemiany materii.
13. Chromosomy-samoodtwarzaj

ą

ce si

ę

, stałe składniki j

ą

dra komórkowego, b

ę

d

ą

ce nosicielami

genów.
14. Gen-odcinek DNA nadaj

ą

cy komórce zdolno

ść

do tworzenia ró

ż

nych form RNA, po

ś

redniczy w

kodowaniu białek. Gen decyduje o przekazywaniu poszczególnych dziedzicznych cech organizmu.
15. Genom człowieka-kompletny zestaw informacji genetycznej człowieka; składa si

ę

z 2 odr

ę

bnych

genomów.
16. Ekspresja genu - proces, w którym informacja genetyczna zawarta w genie zostaje odczytana i
przepisana na jego produkty, które s

ą

białkami lub ró

ż

nymi formami RNA.

17. DNA
18. Nukleozydy-s

ą

zbudowane z zasady heterocyklicznej (adenina,cytozyna,guanina,uracyl,tymina) i

odpowiedniego cukru deoksyrybozy lub rybozy w zale

ż

no

ś

ci od tego w skład którego biopolimeru

wchodz

ą

DNA czy RNA

19. Nukleotyd- poł

ą

czenia rybozy lub deoksyrybozy, zasady purynowej albo pirymidynowej i kwasu

fosforowego.
20. Zasada heterocykliczna- zwi

ą

zek organiczny wchodz

ą

cy w skład nukleozydu.

21. Replikacja-jest to powielanie materiału genetycznego.
22. Polimeraza DNA - enzym katalizuj

ą

cy syntez

ę

DNA w czasie replikacji lub naprawy DNA.

23. Ligaza-enzym restrykcyjny, ł

ą

cz

ą

cy odcinki DNA.

24. Transkrypcja w genetyce oznacza proces syntezy RNA na matrycy DNA przez ró

ż

ne polimerazy

RNA. Jest to, zatem przepisywanie informacji zawartej w DNA na RNA.
25. mRNA- cz

ą

steczki informacyjne RNA powstaj

ą

ce jako kopie odcinków DNA podczas transkrypcji

w biosyntezie białka.

26. Ekson- koduj

ą

ca cz

ęść

cz

ą

steczki DNA, ulegaj

ą

c transkrypcji pojawia si

ę

w dojrzałej cz

ą

steczce

RNA. Mo

ż

e kodowa

ć

element białkowy.

27. Intron- niekoduj

ą

ca cz

ęść

cz

ą

steczki DNA, ulega transkrypcji, jest wycinany podczas obróbki

potranskrypcyjnej, w procesie splicingu.
28. Kod genetyczny-to zasada, według której informacja genetyczna, zawarta w DNA lub RNA, w
komórkach wszystkich organizmów mo

ż

e ulega

ć

"tłumaczeniu" na kolejno

ść

aminokwasów w białka w

procesie translacji. Kod genetyczny jest: kodem trójkowym, zdegenerowany, bezprzecinkowy,
uniwersalny, jednoznaczny, kodony nie zachodz

ą

na siebie.

29. Kodon- jednostka informacji genetycznej; 3 kolejne nukleotydy w ła

ń

cuchu DNA lub mRNA,

wyznaczaj

ą

ce rodzaj i miejsce 1 aminokwasu w ła

ń

cuchu polipeptydu podczas biosyntezy białka w

komórce.
30. Kodony synonimowe- kodony okre

ś

laj

ą

ce ten sam aminokwas.

31. Degeneracja kodu genetycznego-nadmiarowo

ść

kodu genetycznego, przejawiaj

ą

ca si

ę

tym,

ż

e

okre

ś

lony aminokwas jest kodowany przez wi

ę

cej ni

ż

jeden kodon

32. Mutacja-jest to nagła zmiana materiału genetycznego. Mutacja mo

ż

e by

ć

wywołana samorzutnie,

lub przez czynniki zewn

ę

trzne.

33. tRNA- transportuj

ą

cy RNA,po

ś

redniczy w przył

ą

czaniu kolejnych aminokwasów w procesie

biosyntezy białka.
34. Antykodon-3 kolejne nukleotydy tRNA, stanowi

ą

ce jednostk

ę

czynn

ą

w procesie syntezy białka w

komórce
35. rRNA- rybosomowy RNA. Cz

ą

steczki kwasu rybonukleinowego wchodz

ą

ce w skład rybosomów,

bior

ą

cych udział w procesie biosyntezy polipeptydów.

Rekombinowany DNA- DNA zawieraj

ą

cy wprowadzone za pomoc

ą

wektorów dane sekwencje zasad

tworz

ą

ce gen.

36. Rybosom- organelle słu

żą

ce do produkcji białek w ramach translacji.

37. Wektor- cz

ą

steczka DNA mog

ą

ca by

ć

przeno

ś

nikiem interesuj

ą

cego nas genu i która posiada

zdolno

ść

do automatycznej replikacji w danym typie komórek.

38. Klonowanie to proces tworzenia organizmów maj

ą

cych tak

ą

sam

ą

informacj

ę

genetyczn

ą

.

39. Klon- komórki b

ę

d

ą

ce swoimi wiernymi kopiami (o jednakowym składzie genetycznym).

40. Retrowirusy - rodzina wirusów, których materiał genetyczny zawarty jest w RNA. Najdokładniej
poznanym retrowirusem jest wirus HIV.
41. Odwrotna transkryptaza- proces syntezy komplementarnej nici DNA na matrycy wirusowego
RNA, katalizowany przez enzym zw. odwrotn

ą

transkryptaz

ą

.

42. Enzym restrykcyjny-enzym z grupy endonukleaz wyst

ę

puj

ą

cy w komórkach bakterii. Rozpoznaje

kre

ś

lone odcinki ła

ń

cucha DNA obcego dla komórki i wycina je.

43. Sekwencja palindromowa - jest to sekwencja rozpoznawana przez enzymy restrykcyjne.
Odczytywana z nici nonsensownej i sensownej jest taka sama.
5' A A T T 3'
3' T T A A 5'
44. Lepkie ko

ń

ce- kohezyjne ko

ń

ce fragmentu DNA, poci

ę

tego przez enzymy restrykcyjne w ten

sposób,

ż

e ci

ę

cia przesuni

ę

te s

ą

wzgl

ę

dem siebie o kilka nukleotydów.

45. cDNA- komplementarny DNA, cz

ą

steczka DNA b

ę

d

ą

ca kopi

ą

sekwencji mRNA.

46. Plazmid- dwuniciowa, kolista cz

ą

steczka DNA naturalnie wyst

ę

puj

ą

ca w niektórych bakteriach.

Stosowana jako wektor w in

ż

ynierii genetycznej.

47. Miejsce wielokrotnego klonownia
48. Marker selekcyjny
49. Bakteriofag-wirus atakuj

ą

cy bakterie, zbudowany z otoczki białkowej, w której znajduje si

ę

materiał genetyczny.
50. Kosmidy- sztucznie wytworzone wektory u

ż

ywane w in

ż

ynierii genetycznej. Tworzy si

ę

je ł

ą

cz

ą

c

plazmidy z sekwencj

ą

cos bakteriofaga lambda.

51. PCR-(Polymerase Chain Reaction) – ła

ń

cuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania

ła

ń

cuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegaj

ą

ca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i

ozi

ę

biania próbki.

52. Primer PCR
53. Polimeraza Taq- polimeraz kodowana w genomie bakterii Thermus aquaticus
54. Termocykler- urz

ą

dzenie u

ż

ywane w laboratorium do przeprowadzenia PCR.

55. Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych- wyst

ę

powanie w populacji osobników danego gat.

DNA (deoksyrybonukleinowy kwas) ró

ż

ni

ą

cego si

ę

długo

ś

ci

ą

fragmentów odci

ę

tych enzymami

restrykcyjnymi

56. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych- metoda badania kwasów nukleinowych oparta na
zdolno

ś

ci do tworzenia kompleksu dwuniciowego przez jednoniciowe, komplementarne fragmenty

kwasów nukleinowych.
57. Insulina-hormon peptydowy o działaniu ogólnoustrojowym, odgrywaj

ą

cy rol

ę

głównie w

metabolizmie w

ę

glowodanów, lecz tak

ż

e białek i tłuszczów.

58. GMO(genetically modified organisms) - ro

ś

liny i zwierz

ę

ta zawieraj

ą

ce w swych komórkach

wł

ą

czony do genomu gen obcego gatunku; uzyskiwane metodami in

ż

ynierii genetycznej.

59. Protoplasty- aktywna metabolicznie cz

ęść

komórki bakterii, grzyba lub ro

ś

liny czyli cz

ęść

komórki

bez

ś

ciany komórkowej.

60. Elektroporacja- chwilowa dezintegracja błony komórkowej za pomoc

ą

pola elektrycznego

podczas inkubacji komórek z egzogennym DNA.
61. Lipofekcja- opłaszczanie egzogennego DNA lipidami, które spontanicznie wnikaj

ą

przez błon

ę

komórkow

ą

do cytoplazmy

62. Mikroiniekcja- wprowadzenie fragmentów DNA za pomoc

ą

mikropipety

63. Plazmid T

i

- plazmid z bakterii Agrobacterium tumefaciens, wywołuj

ą

cy guzowato

ść

korzeni ro

ś

lin

64. Insulina ludzka- produkowany w trzustce polipeptyd zbudowany z 51 aminokwasów. Zbudowana
jest z dwóch ła

ń

cuchów: ła

ń

cuch A zawiera 21 reszt aminokwasów, a ła

ń

cuch B zawiera 30 reszt

aminokwasów. Oba ła

ń

cuchy poł

ą

czone s

ą

dwoma mostkami disiarczkowymi, a w ła

ń

cuchu A

znajduje si

ę

jeszcze mostek S-S.

65. Insulina rekombinowana- insulina powstała w wyniku rekombinacji DNA w plazmidzie
66. Gensulin- lek stosowany w leczeniu cukrzycy
67. Zaproponowana przez Watsona i Cricka struktura dwuniciowej helisy DNA ma dwie cechy o
kluczowym znaczeniu w pełnieniu przez DNA funkcji no

ś

nika informacji genetycznej

a) struktura ta jest kompatybilna z ka

ż

d

ą

sekwencj

ą

zasad (pary zasad maj

ą

zasadniczo taki sam

kształt)
b) sekwencja wzdłu

ż

jednej nici determinuje całkowicie sekwencj

ę

drugiej nici (jako wynik

komplementarno

ś

i).

A zatem je

ś

li dwuniciowa helisa ulega rozdzieleniu na dwie pojedyncze nici to ka

ż

da z nich mo

ż

e

pełni

ć

rol

ę

matrycy w tworzeniu nowej komplementarnej nici poprzez specyficzne parowanie zasad

.

PYTANIA OPISOWE:
Pyt. 1.
Ogólnie rzecz ujmuj

ą

c biotechnologia jest to

ś

wiadczenie dóbr i usług z zastosowaniem metod

biologicznych. Inaczej –biotech. Jest to integracja nauk przyrodniczych i in

ż

ynieryjnych w celu

osi

ą

gni

ę

cia zastosowa

ń

organizmów, komórek lub ich cz

ęś

ci oraz molekularnych analogów dla

.pozyskania produktów i usług (definicja wg Europejskiej Federacji Biotechnologii). U podstaw
biotechn. le

ż

y wiele dziedzin nauki i techniki, jednak szczególne miejsce zajmuje biologia i genetyka

molekularna.
W nowoczesnej biotechnologii uto

ż

samianej i zaw

ęż

anej do in

ż

ynierii genetycznej, stosowane

procedury polegaj

ą

przede wszystkim na przenoszeniu lub modyfikacji okre

ś

lonych, zdefiniowanych

genów pomi

ę

dzy ro

ż

nymi osobnikami, najcz

ęś

ciej pomi

ę

dzy ro

ż

nymi gatunkami za pomoc

ą

technik

laboratoryjnych. W „klasycznej" hodowli równie

ż

ma miejsce przenoszenie genów, np podczas

dokonywanych krzy

ż

ówek; jednak

ż

e, nikt nie wie jakie geny czy zespoły genowe zostały przeniesione

Ta „nowoczesna" biotechnologia

ś

ci

ś

le wi

ąż

e si

ę

z „klasyczn

ą

", a zatem taki podział jest sztuczny,

wr

ę

cz niewła

ś

ciwy. Mo

ż

na natomiast wyró

ż

ni

ć

in

ż

ynieri

ę

genetyczn

ą

, czyli zespół metod stosowanych

dla modyfikacji genomu, a zatem w celu zmian wła

ś

ciwo

ś

ci organizmu.

Rys historyczny
Okres I- Przedpasteurowski (korzenie biotechnologii)- od zarania ludzko

ś

ci do poł. XIX w;

Spontaniczne procesy fermentacyjne, m.in. produkcja wina, piwa, octu, napojów mlecznych, chleba.
Osi

ą

gni

ę

ciem tego okresu było wprowadzenie techniki inokulacji - szczepienia kolejnych cykli

fermentacji cz

ęś

ci

ą

produktu, finalnego łub ubocznego.

Okres II przej

ś

ciowy (pocz

ą

tki nowych technologii mikrobiologicznych) IIpoł. XIX w., do lat 40- tych

XXw. —Naukowe poznanie procesów mikrobiologicznych i wdra

ż

anie nowych rozwi

ą

za

ń

technicznych; Opracowano i wdro

ż

ono do produkcji na skal

ę

przemysłow

ą

etanol, butanol, metanol,

aceton, kwasy organiczne Zastosowanie do oczyszczania

ś

cieków techniki zło

ż

a zraszanego, na

którym rozwijała si

ę

mikroflora degraduj

ą

ca składniki wód

ś

ciekowych. Opracowano pierwsze metody

biotransformacji mikrobiologicznej: sorbitolu do sorbozy, glukozy do kwasu glukonowego.

Okres III- Era nowoczesnej biotechnologii (po II wojnie

ś

wiatowej): Podokres 1 (1940-1970) Złota era

antybioz.- Opracowano nowe biotechnologie: ok. 100 antybiotyków w tym penicylina, kilkunastu
enzymów, kilku aminokwasów, dwóch witamin, nukleotydów, dekstranu, biotransformacje steroidów,
szczepionki wirusowe, białka paszowego pochodzenia drobnoustrojowego (SCP). Wprowadzenie
pierwszych technologii z zastosowaniem biokatalizatorów immobilizowanych. Podokres 2 (od 1970)
Współczesna biotechnologia - Narodziła si

ę

koncepcja manipulacji genami poza komórk

ą

. Nast

ą

pił

rozwój metod rekombinaqi DNA in vitro i in vivo. Opracowano szereg nowych biotechnologii, m.in.
mikrobiologiczn

ą

produkcj

ę

insuliny, hormonów wzrostu, białek odporno

ś

ciowych, wytwarzania

przeciwciał monoklonalnych, powszechne stosowanie metod klonowania i rozmna

ż

ania ro

ś

lin in vitro

Pyt.2.
Etapy w opracowaniu procesu biotechnologicznego

1.Pozyskiwanie drobnoustrojów (skrining) Jest to poszukiwanie odpowiednich drobnoustrojów
prowadz

ą

cych okre

ś

lony bioproces lub wytwarzaj

ą

cych okre

ś

lony bioprodukt. (izolacja, ocena

przydatno

ś

ci, warunki przechowywania), charakterystyka materiału biologicznego (szybko

ść

wzrostu,

szybko

ść

przyswajania substratu, szybko

ść

tworzenia produktu, szybko

ść

oddychania)

2.Dobór warunków hodowli. Stworzenie warunków zapewniaj

ą

cych szczepom max. produkcj

ę

(min.

Skład podło

ż

a czyli

ź

ródła C,N,P i inne prekursory, pH, . potencjał 02, potencjał redox, , pH, dalej;

temp., natlenienie, sposób prowadzenia, hodowli.). Na tym etapie ustala si

ę

równie

ż

metody

wyodr

ę

bniania i oczyszczania bioproduktów oraz warunki tych operacji: temp., ci

ś

nienie, lepko

ść

,

piana, pobór mocy.
3.Doskonalenie cech produkcyjnych szczepów. Zwi

ę

kszenie potencjału genetycznego szczepu

w zakresie biosyntezy / biotransformacji okre

ś

lonego substratu w ilo

ś

ci przewy

ż

szaj

ą

cej potrzeby

własne drobnoustrojów od kilkuset (aa) do kilkudziesi

ę

ciu tysi

ę

cy razy (witaminy). Stosuje si

ę

nast

ę

puj

ą

ce metody manipulacji genami: mutacje genetyczne, fuzj

ę

protoplastów, rekombinacj

ę

DNA

in vitro Ponadto dzi

ę

ki in

ż

. genetycznej mo

ż

na konstruowa

ć

szczepy, które syntezuj

ą

bioprodukty,

których drobnoustroje macierzyste nigdy nie produkowały.
4.Optymalizacja bioprocesu. Jest ostatnim etapem laboratoryjnym. Jest konsekwencj

ą

maksymalnego wykorzystania potencjału metabolicznego drobnoustrojów. Ustala si

ę

skład podło

ż

a,

warunki jego mieszania i napowietrzania, kinetyki bioprocesu.
5.powi

ę

kszenie skali- Przeniesienie opracowanej w laboratorium technologii do skali

półtechnicznej (fementatory o poj. 20-1000L)
6.Uruchomienie produkcji przemysłowej

Pyt.3.

Pyt.4.
Podstawy biochemiczne procesów technologii rekombinacyjnego DNA
a) schemat przepływu informacji genetycznej w komórce

b) monomery buduj

ą

ce DNA

DNA jest liniowym polimerem czterech monomerów (zasad A,G,T,C). Ka

ż

dy nukleotyd składa si

ę

reszty cukrowej deoksyrybozy i grupy fosforanowej i z zasady heterocyklicznej. Zasady
heterocykliczne- adenina, guanina, cytozyna, tymina.
c) istotne cechy budowy dwuniciowej helisy DNA
- Dwa helikalne ła

ń

cuchy polinukleotydowe oplataj

ą

wspóln

ą

o

ś

Ła

ń

cuchy te biegn

ą

w przeciwnych

kierunkach
- Zasady purynowe i pirymidynowe znajduj

ą

sie wewn

ą

trz, a fosforany i reszty deoksyrybozy — na

zewn

ą

trz helisy. Płaszczyzny zasad s

ą

prostopadle do osi helisy a płaszczyzny pier

ś

cieni cukrów s

ą

uło

ż

one prostopadle wzgl

ę

dem zasad.

-

Ś

rednica helisy wynosi 2.0 ma Odległo

ść

miedzy s

ą

siednimi zasadami mierzona wzdłu

ż

osi helisy

wynosi 0.34nm. Zasady te s

ą

skr

ę

cone wzgl

ę

dem siebie pod katem 36°. Na całkowity skr

ę

t helisy

przypada po JO nukleotydów w ka

ż

dym ła

ń

cuchu, co daje okres powtarzalno

ś

ci równy 3.4 nm

- Dwa ła

ń

cuchy ł

ą

cz

ą

si

ę

ze sob

ą

wi

ą

zaniami wodorowymi mi

ę

dzy zasadami tworz

ą

cymi

komplementarne pary. Adenina zawsze tworzy par

ę

z tymin

ą

a guanina z cytozyn

ą

. Dodatkowo

struktur

ę

stabilizuj

ą

oddziaływania asocjacji warstwowej pomi

ę

dzy zasad

ą

.

- Kolejno

ść

zasad w ła

ń

cuchu polinukleotydowym nie jest w

ż

aden sposób ograniczona.

Ś

CISŁE

OKRE

Ś

LONA SEKWENCJA ZASAD NIESIE INFORMACJE.

d) proces replikacji u bakterii
Polimeraza DNA I z E. coli wymaga prekursorów w postaci wszystkich czterech 5'-trifosforanów
deoksynukleozydów (dNTP) jonów Mg

2

*, matrycy DNA oraz odcinka starterowego zawieraj

ą

cego

woln

ą

grup

ę

3'-OH. Synteza DNA przebiega w kierunku 5`-»3'. Polimeraza DNA I wykazuje te

ż

aktywno

ść

egzonukleazy3'-»5' {sprawdzaj

ą

c

ą

wierno

ść

replikacji) oraz aktywno

ść

egzonukleazy 5'-»3\

Polimerazy DNA II i III z E. coli nit wykazuj

ą

egzonukleotycznej aktywno

ś

ci 5`-»3. Replikacja

rozpoczyna si

ę

w pojedynczym miejscu inicjacji (ori).przebiega dwukierunkowo i jest

semikonserwarywna. Ka

ż

de oczko replikacyjne zawiera dwa widełki replikacyjne.Synteza QNA

przebiega w kierunku 5'->3' na ka

ż

dej nici wyj

ś

ciowego DNA. Na jednej z nici, o orientacji 3*->5

ł

(nic

wiod

ą

ca) nowo powstaj

ą

cy DNA jest syntetyzowany w sposób ci

ą

gły. Na drugiej nici, o orientacji 5'-»3'

{ni

ć

opó

ź

niona) synteza DNA przebiega w sposób nieci

ą

gły (skokowy) z tworzeniem si

ę

najpierw serii

krótkich fragmentów Okazaki, które nast

ę

pnie ulegaj

ą

poł

ą

czeniu. Do zainicjowania replikacji

konieczny jest starter RNA („primer"), syntetyzowany przez polimeraz

ę

RNA zwan

ą

prymaz

ą

. Starter

jest wydłu

ż

any przez polimeraz

ę

DNA III, która syntetyzuje DNA na obu matrycowych niciach. DNA, to

jest na nici wiod

ą

cej i opó

ź

nionej. Polimeraza. DNA I degraduje starter i zast

ę

puje go odcinkiem DNA,

a nast

ę

pnie ligaza DNA ł

ą

czy, ko

ń

ce DNA. Dwuniciow

ą

helis

ę

DNA rozplataj

ą

helikazy, a białka

ł

ą

cz

ą

ce si

ę

z jednoniciowym DNA (SSB) stabilizuj

ą

jednoniciowy odcinek DNA podlegaj

ą

cy replikacji.

Potrzebna te

ż

jest topoizomeraza DNA I, umo

ż

liwiaj

ą

ca rozplatanie DNA bez konieczno

ś

ci rotacyjnych

ruchów całego chromosomu. Topoizomeraza DNA II oddziela od siebie potomne cz

ą

steczki kolistego

DNA powstałe w wyniku replikacji.
e) kod genetyczny i cechy kodu genetycznego
Kod genetyczny- jest zestawem reguł, która okre

ś

laj

ą

sposób, w jaki sekwencja nukleotydów w

mRNA zostaje przetłumaczona na sekwencj

ę

aminokwasów w polipeptydzie. Sekwencja nukleotydów

jest czytana trojkami. Kodony UAG, UOA, UAA nie specyfikuj

ą

ż

adnego aminokwasu i s

ą

okre

ś

lane

jako kodony terninacyjne, czyli kodony „stop". Kodon AUG koduje metionin

ę

i działa równie

ż

jako kodon

inicjuj

ą

cy, czyli start

Cechy kodu:
1) zdegenerowany- wi

ę

kszo

ść

aminokwasów jest kodowana przez wi

ę

cej ni

ż

jeden kodon;

2) Uniwersalny- jest taki sam w wi

ę

kszo

ś

ci organizmów,;

3) Nienakładaj

ą

cy si

ę

4) Jednoznaczny
5) Bezprzecinkowy
6) Jest to kod trójkowy

Pyt.5.
Idea rekombinacji i klonowania DNA
Rekombinacja DNA:
a) izolowanie genów poprzez ci

ę

cie genomu danego organizmu enzymami restrykcyjnymi

b) otrzymywanie cDNA; wykorzystanie procesu odwrotnej transkrypcji
c) chemiczno- enzymatyczna syntez genów

Klonowanie DNA:
a) odpowiednie przygotowanie wektorowego DNA
b) przygotowanie interesuj

ą

cego nas genu, który chcemy powieli

ć

(sklonowa

ć

) lub uzyska

ć

jego

ekspresj

ę

c) ligacja czyli poł

ą

czenie genomowego i wektorowego DNA aby uzyska

ć

zrekombinowan

ą

cz

ą

steczk

ę

DNA

d) transformacja komórki biorcy, analiza rekombinatów


Pyt. 6.
Podstawowe narz

ę

dzia stosowane w in

ż

ynierii genetycznej to enzymy:

a) endonukleazy przecinaj

ą

ce DNA; w tym endonukleazy restrykcyjne = enzymy restrykcyjne

b) polimerazy DNA:
c) odwrotna transkryptaza-synteza DNA na matrycy RNA
d) Ligaza-enzym ł

ą

cz

ą

cy kowalencyjnie odcinki DNA (w strukturze dwuniciowych)

Pyt.7.
Co to s

ą

i jak działaj

ą

enzymy restrykcyjne?

Enzymy restrykcyjne umo

ż

liwiaj

ą

rozcinanie DNA w specyficznych miejscach. Hybrydyzacjia kwasów

nukleinowych pozwala wykrywa

ć

specyficzne ich sekwencje. Okre

ś

lanie kolejno

ś

ci uło

ż

enia

nukleotydów w cz

ą

steczce DNA nazywamy sekwencjonowaniem DNA, jego przeprowadzenie jest

stosunkowo łatwe. Enzymy restrykcyjne (restryktazy) rozpoznaj

ą

specyficzne sekwencje i rozcinaj

ą

DNA pozostawiaj

ą

c w miejscu rozci

ę

cia kohezyjne lub t

ę

pe jego ko

ń

ce. Ko

ń

ce fragmentów

restrykcyjnych DNA mo

ż

na poł

ą

czy

ć

za pomoc

ą

ligazy, uzyskuj

ą

c w ten sposób nowe

zrekombinowane cz

ą

steczki DNA.

Pyt.8.
Metody pozyskiwania DNA do zastosowa

ń

w technologii rekombinacyjnego DNA

Pyt. 9.
Wektory stosowane do klonowania DNA w bakteriach
a) wektory plazmidowe
- niektóre plazmidy wyst

ę

puj

ą

ce naturalnie w mikroorganizmach zostały przekształcone metodami

in

ż

ynierii genetycznej w wektory pozwalajace na wprowadzenie obcego DNA do komórki biorcy

- po transformacji bakterii wektorem zawieraj

ą

cym obce fragmenty DNA mo

ż

na wyselekcjonowa

ć

linie

komórkowe czyli klony b

ę

d

ą

ce genetycznie czystymi kulturami wyprowadzonymi z pojedy

ń

czej

komórki.
b) wektory bakteriofagowe- wektory typu insercyjnego i zast

ę

pczego

- w genomie bakteriofaga

λ

geny s

ą

zorganizowane w funkcjonalne wa

ż

e grupy

- region

ś

rodkowy bakteriofaga mo

ż

e by

ć

usuni

ę

ty z genomu bakteriofaga nie powoduj

ą

c zmiany w

jego zdolno

ś

ci do litycznego rozwoju.

Z DNA faga

λ

mo

ż

na usun

ąć

odcinek stanowi

ą

cy ok. 30% genomu pozostawiaj

ą

c jego „lewe” i

„prawe” ramiona zawieraj

ą

ce niezb

ę

dne geny w cyklu litycznym. Podobnie jak w wektorach

plazmidowych, do wektorów bakteriofagowych faga

λ

równie

ż

wstawiono odpowiednie polilinkiery,

geny marlierowe, silne promotory itp.
c) kosmidy- sa sztucznie stworzonymi wektorami, powstałymi z połaczenia plazmidu i sekwencji
cos faga- (sekwencja odpowiedzialna za cyrkulizacje DNA). Kosmidy z wprowadzonym
insertem sa pakowane w kapsydy i sa wykorzystywane do zaka_enia komórek bakteryjnych.
W przeciwienstwie do faga _, kosmidy nie niszcza zainfekowanych komórek. Najprostszym
wektorem kosmidowym jest typowy plazmid z miejscem ori i markerem selekcyjnym,

zawierajacym dodatkowo sekwencje cos i odpowiednie miejsce restrykcyjne do klonowania.
Po trawieniu (cieciu) wektora odpowiednim enzymem restrykcyjnym i zligowaniu3
z docelowym insertem, kosmid pakowany jest do czasteczek fagowych. Po wprowadzeniu
wiekszego insertu do kosmidu wydłu_a sie czas jego replikacji oraz zmniejsza sie liczba jego
kopii. Kosmidy umo_liwiaja klonowanie długich fragmentów DNA (ok. 45 kpz).

Pyt.10.









Pyt.11.
Biblioteka genomowa człowieka w fagu

λ

a) preparat zawieraj

ą

cy wiele cz

ą

steczek genomowego DNA najpierw poddaje si

ę

mechanicznej

fragmentacji lub cz

ęś

ciowemi ci

ę

ciu enzymami restrykcyjnymi

b) t

ą

statystyczn

ą

mieszanin

ę

wzajemnie nakładaj

ą

cych si

ę

fragmentów rozdziela si

ę

elektroforetycznie i izoluje z niej fragmenty o długo

ś

ci 15000 par zasad. Do ko

ń

ców fragmentów

przył

ą

cza si

ę

syntetyczne linkiery, tworzy si

ę

kohezyjne ko

ń

ce i wprowadza si

ę

do wektora fagowego

c) zrekombinowanymi fagami infekuje si

ę

komórkami E-coli. Uzyskany w wyniku lizat zawiera

fragmenty DNA znajduj

ą

ce si

ę

w na tyle du

ż

ej populacji zrekombinowanych fagów,

ż

e fragmenty w

sumie stanowi

ą

prawie kompletny genom

d) taka kolekcja fagów stanowi bibliotek

ę

genomow

ą

Pyt. 12
Wielokrotne powielanie DNA przez zastosowanie reakcji ła

ń

cuchowej polimeryzacji (PCR)

PCR to metoda enzymatycznego powielania kwasów nukleinowych ze współczynnikiem wzmocnienia
ok. 1000000. Cykl powielania polega na:
a) denaturacji cieplnej powielanego DNA
b) renaturacji- syntetyczne startery tworz

ą

hybrydy z jednoniciowymi cz

ą

steczkami DNA

c) elongacji czyli dodaniu polimerazy i substratowych trifosforanów 2’- deoksynukleozydów (dNT) i
przeprowadzeniu reakcji polimeryzacji
Jeden cykl w zale

ż

no

ś

ci od potrzeby mo

ż

e trwa

ć

od kilkudziesi

ę

ciu sekund do kilku minut.

Specyficzno

ść

procesu powielania wynika z oddziaływania mi

ę

dzy polimerami, które tworz

ą

wi

ą

zania

wodorowe z ła

ń

cuchami jednoniciowego DNA. Niespecyficzno

ść

wi

ą

zania mo

ż

na eliminowa

ć

stosuj

ą

c

primery o odpowiedniej długo

ś

ci i st

ęż

eniu, dostatecznie wysok

ą

temperatur

ą

renaturyzacji.

Pyt.13.






Pyt.14.
Nowoczesna biotechnologia w przemy

ś

le spo

ż

ywczym

a) główne cele dla których modyfikuje si

ę

ro

ś

liny

- odporno

ść

na herbicydy

- odporno

ść

na choroby przenoszone przez wirusy, grzyby, bakterie

- odporno

ść

na szkodniki

- poprawa cech jako

ś

ciowych i u

ż

ytkowych

- uodpornienie na działanie niekorzystnych warunków

ś

rodowiska

b) przykład procedury genetycznego modyfikowania ro

ś

lin

- wybrany fragment DNA zostaje poł

ą

czony z DNA organizmu dawcy. Wykonuje si

ę

to przy pomocy

enzymów restrykcyjnych

- wyci

ę

ty fragment DNA zostaje poł

ą

czony z DNA wektora, który posiada umiej

ę

tno

ść

przenoszenia

kodu genetycznego do komórek innych organizmów. Wektorami mog

ą

by

ć

organizmy lub plazmidy

posiadaj

ą

ce zdolno

ść

przenoszenia własnych genów oraz genów do nich doł

ą

czonych

- fragment DNA przenoszony przez wektor „wbudowany” w DNA biorcy
c) argumenty za i przeciw
ZA:
- ro

ś

liny transgeniczne s

ą

zazwyczaj bardziej odporne na niekorzystne warunki

ś

rodowiska.

Poprawiaj

ą

si

ę

te

ż

ich cechy u

ż

ytkowe- smak, wygl

ą

d, skład chemiczny

- wzgl

ę

dy ekonomiczne- ro

ś

liny GMO odznaczaj

ą

si

ę

lepszym smakiem, ładniej wygl

ą

daj

ą

, s

ą

bardziej

dorodne
- mo

ż

liwo

ść

zmniejszonego u

ż

ycia chemicznych

ś

rodków ochrony ro

ś

lin, mo

ż

e prowadzi

ć

do

obni

ż

enia kosztów produkcji, a tym samym do obni

ż

enia cen

- odporno

ść

na trudne warunki wzrostu oraz potencjalnie wy

ż

sze plony, mog

ą

pomóc w eliminacji

problemu głodu w krajach Trzeciego

Ś

wiata

PRZECIW:
- szkodliwo

ść

upraw transgenicznych wzgl

ę

dem

ś

rodowiska naturalnego oraz konsumentów

- nie jest dokładnie znany wpływ GMO na

ś

rodowisko- szczególnie ro

ś

liny zawieraj

ą

ce geny

odporno

ś

ci na herbicydy, co mo

ż

e prowadzi

ć

do powstania superchwastu odpornego na działanie

ś

rodków ochrony ro

ś

lin

- zbyt du

ż

e ujednolicenie upraw

- bezpo

ś

rednia szkodliwo

ść

produktów GMO wzgl

ę

dem organizmu ludzkiego

Pyt.15.
Produkcja insuliny technologi

ą

zrekombinowanego DNA

a) ekstrakcja z ludzkich trzustek
b) chemiczna synteza via indywidualne aminokwasy
c) transformacja

ś

wi

ń

skiej insuliny semi-synteza

d) produkcja metodami in

ż

ynierii genetycznej SEMI-SYNTEZA

e) ekstrakcja insuliny

ś

wi

ń

skiej z zamro

ż

onych tkanek

f) oczyszczanie insuliny

ś

wi

ń

skiej

g) biochemiczna transformacja (insulina

ś

wi

ń

ska ma alanin

ę

w B30 zamiast treoniny). Transformacj

ę

wykonuje si

ę

wobec trypsyny przy du

ż

ym nadmiarze treoniny (najlepsze rezultaty daje ester t-

butylowy)
h) oczyszczanie ludzkiej insuliny aby ograniczy

ć

do minimum zawarto

ść

proinsuliny

i) ostateczna foemulacja insuliny