BIOTECHNOLOGIA
Biotechnologia to zintegrowane zastosowa-
nie wiedzy i techniki w dziedzinach bioche-
mii mikrobiologii i nauk in

ż

ynierskich w celu

technologicznego wykorzystania drobno-
ustrojów, kultur tkankowych lub ich cz

ęś

ci

oraz molekularnych analogów dla pozyska-
nia produktów i usług. Biotechnologia to

ś

wiadczenie dóbr i sług z zastosowaniem

metod biologicznych. Biotechnologia jest
dyscyplin

ą

nauk technicznych wykorzystuj

ą

-

c

ą

procesy biologiczne na skal

ę

przemysło-

wa. Biotechnologia jest interdyscyplinarn

ą

dziedzin

ą

ł

ą

cz

ą

c

ą

w sobie nauki techniczne i

przyrodnicze, obejmuj

ą

c

ą

badanie, wytwa-

rzanie i wykorzystanie DNA/RNA, białek /
enzymów, drobnoustrojów, kultur komórko-
wych w procesach modyfikacji genetycznej,
biosyntezy, biotransformacji, bioutylizacji a
tak

ż

e wyodr

ę

bnianie i modyfikacje tak

otrzymywanych bioproduktów.
Wykład 2
W zwi

ą

zku z pojawieniem si

ę

metod pozwa-

laj

ą

cych na ingerowanie w naturalny

materiał genetyczny drobnoustrojów przyj

ę

to

powszechnie podział biotechnologii na

-tradycyjn

ą

-przebiegaj

ą

c

ą

z u

ż

yciem

drobnoustrojów i komórek organizmów
wy

ż

szych nie zawieraj

ą

cych obcego mate-

riału genetycznego
-nowoczesn

ą

gdzie stosowane s

ą

szczepy

drobnoustrojów lub inne linie komórkowe
skonstruowane metodami in

ż

ynierii gene-

tycznej
Podział biotechnologii
biała biotechnologia – biotechnologia
przemysłowa wykorzystuj

ą

ca systemy

biologiczne w produkcji przemysłowej i
ochronie

ś

rodowiska

czerwona biotechnologia – wykorzystywana
w ochronie zdrowia
zielona biotechnologia – zwi

ą

zana z rolnic-

twem obejmuj

ą

ca stosowanie metod

in

ż

ynierii genetycznej w celu doskonalenia

produkcji ro

ś

linnej i zwierz

ę

cej.

Biotechnologia czerwona wykorzystuje
systemy biologiczne w produkcji przemysło-
wej. Opiera si

ę

na biokatalizie i bioproce-

sach. Surowce odnawialne s

ą

tu przekształ-

cane z wykorzystaniem ple

ś

ni, dro

ż

d

ż

y,

bakterii, enzymów w cenne chemikalia, leki,
biopolimery, czynniki energetyczne, funkcjo-
nalne, składniki

ż

ywno

ś

ci.

Biotechnologia czerwona wykorzystywana w
ochronie zdrowia i medycynie. Jest wa

ż

nym

i dynamicznie rozwijaj

ą

cym si

ę

obszarem

biotechnologii, w szczególno

ś

ci w zakresie

produkcji nowych biofarmaceutyków,
rozwoju diagnostyki genetycznej, geoterapii i
ksenotransplantologii.
Biotechnologia zielona zwi

ą

zana jest z

rolnictwem, obejmuje zastosowanie metod
in

ż

ynierii genetycznej w celu doskonalenia

produkcji ro

ś

linnej i zwierz

ę

cej. Wa

ż

nym

obszarem jest wprowadzanie transgenicz-
nych ro

ś

lin do produkcji szczepionek

doustnych i rekombinowanych białek a tak

ż

e

wykorzystanie tych

ż

e ro

ś

lin jako surowców

odnawialnych w biorafineriach.
HISTORIA BIOTECHNOLOGII
I okres przedpasteurowski (do połowy XIXw)
procesy fermentacyjne produkcja piwa,
wina, octu, chleba, napojów mlecznych.
Wprowadzenie procesu inokulacji – szcze-
pienia kolejnych cykli fermentacji cz

ęś

ci

ą

produktu finalnego lub ubocznego.
II okres przej

ś

ciowy (pocz

ą

tki nowych

technologii mikrobiologicznych. Naukowe
poznanie procesów mikrobiologicznych. W
1857r L Pateur wyja

ś

nił rol

ę

drobnoustrojów

w procesie fermentacji. Zastosowanie zło

ż

a

zraszanego w oczyszczaniu

ś

cieków. Nowe

metody biotransformacji mikrobiologicznej
orbitolu.
III okres Era nowoczesnej technologii,
podokres : ZŁOTA ERA ANTYBIOTYKÓW
nowe biotechnologie ok 100 antybiotyków w
tym penicylina, a tak

ż

e wielu enzymów,

aminokwasów, witamin nukleotydów SCP
(białko paszowe), katalizatory immobilizo-
wane, podokres: WSPÓŁCZESNA BIO-
TECHNOLOGIA manipulacja genami poza
komórk

ą

. Nast

ą

pił rozwój metod rekombina-

cji DNA in vitro, in vivo. Mikrobiologiczna
produkcja insuliny, hormonu wzrostu, białek
odporno

ś

ciowych metody klonowania i

rozmna

ż

ania ro

ś

lin in vivo.

Technologia mikrobiologiczna – obejmuje
procesy uwarunkowane obecno

ś

ci

ą

drobno-

ustrojów. Pozwalaj

ą

na wykorzystanie

mikroorganizmów do wywołania ró

ż

norod-

nych przemian chemicznych oraz do
nadprodukcji wielorakich metabolitów w
ilo

ś

ciach znacznie przewy

ż

szaj

ą

cych ich

potrzeby. Wi

ąż

e si

ę

to z mo

ż

liwo

ś

ci

ą

ukierunkowanej transformacji genotypu
drobnoustrojów oraz sterowania ich metabo-
lizmem poprzez dobór odpowiednich
warunków

ś

rodowiskowych. Obszar ten

obejmuje procesy mikrobiologicznej biosyn-
tezy i biotransformacji Fermentacja – z
punktu widzenia biochemii drobnoustrojów
poj

ę

cie to wi

ąż

e si

ę

z metabolizmem

beztlenowym w którym energotwórcze
procesy utleniania substratu w

ę

glowego

przebiegaj

ą

ce z wydzieleniem CO

2

nie

wymagaj

ą

tlenu cz

ą

steczkowego jako

ko

ń

cowego akceptora elektronów.

W praktyce biotechnologicznej fermentacja
słu

ż

y do okre

ś

lenia przemian chemicznych

w wyniku aktywno

ś

ci metabolicznej drobno-

ustrojów, czyli obejmuje zarówno fermenta-
cje beztlenowe (np fermentacja alkoholowa)
jak równie

ż

tlenowe (fermentacja octowa).

Technologia enzymów – obejmuje wszystkie
zagadnienia zwi

ą

zane z zastosowaniem

enzymów w procesach biotechnologicznych.
Dział biotechnologii intensywnie rozwijaj

ą

cy

si

ę

od II poł XX wieku. Szczególnie inten-

sywnie rozwijaj

ą

si

ę

techniki unieruchamia-

nia enzymów (immobilizacja) lub całych
komórek. Dzi

ę

ki immobilizacji zakres

zastosowa

ń

enzymów uległ znacznemu

rozszerzeniu. Powstał nowy dział biotechno-
logii – technologia biokatalizatorów unieru-
chomionych.
In

ż

ynieria genetyczna – metody biologii

molekularnej umo

ż

liwiaj

ą

ce manipulacje

genetyczne poza komórk

ą

czyli rekombino-

wanie DNA in vitro
In

ż

ynieria białka – zajmuje si

ę

problemami

zwi

ą

zanymi z przystosowaniem enzymów do

wykonywania odpowiednich procesów
technologicznych – syntezy, transformacji
lub degradacji zwi

ą

zków chemicznych, nie

zawsze b

ę

d

ą

cych substancjami naturalnymi.

In

ż

ynieria cytogenetyczna – in

ż

ynieria

genetyczna na poziomie komórkowym
zajmuj

ą

ca si

ę

głównie opracowaniem

technik fuzji komórek (np fuzja komórek
nowotworowych szpiczaka i

immunizowa-

nych komórek pozwoliła na otrzymanie
komórek mieszka

ń

ców (hybrydoma) które

zachowuj

ą

c cechy nowotworu szybko rosn

ą

i wydajnie produkuj

ą

przeciwciała.

Zalety biotechnologii gwarantuj

ą

ce jej

dynamiczny rozwój
- du

ż

a ró

ż

norodno

ść

bioprocesów

– łagodne warunki przebiegu bioprocesów
– procesy przyjazne dla

ś

rodowiska

– bezpiecze

ń

stwo procesów biotechnolo-

gicznych
– wykorzystanie surowców,które s

ą

odpa-

dami dla innych technologii
– przetwarzanie surowców odnawialnych
Tworzenie nowych biotechnologii
Program opracowania proces obejmuj

ą

cy:

-faz

ę

wst

ę

pn

ą

czyli analiz

ę

zapotrzebowania

społecznego na okre

ś

lone produkty

-faz

ę

badawcz

ą

maj

ą

c

ą

na celu opracowa-

nie technologii ko

ń

cz

ą

c

ą

si

ę

rachunkiem

ekonomicznym i podj

ę

ciem decyzji inwesty-

cyjnych
-faz

ę

wdro

ż

enia czyli projektowanie oaz

budow

ę

linii technologicznej i uruchomienie

produkcji.
Procesem technologicznym przyj

ę

to nazy-

wa

ć

zapis wszystkich czynno

ś

ci wyst

ę

puj

ą

-

cych po sobie w okre

ś

lonej kolejno

ś

ci,

powoduj

ą

cych przemiany fizyczne, che-

miczne, biochemiczne surowców oraz
materiałów i prowadz

ą

cych do otrzymania

po

żą

danego produktu. Opracowanie

procesu technologicznego wymaga wy-
szczególnienia procesów i operacji jednost-
kowych, okre

ś

lenia substratów i materiałów

pomocniczych, sposobu oczyszczania i
konfekcjonowania produktu jak równie

ż

planu zagospodarowania b

ą

d

ź

utylizacji

odpadów
Proces jednostkowy – elementarny etap
procesu produkcyjnego stosowany w
przemy

ś

le chemicznym i pokrewnych.

Rozró

ż

nia si

ę

procesy podstawowe o

charakterze fizykochemicznym lub chemicz-
nym , które dzieli si

ę

z uwagi na typ reakcji

lub rodzaj faz bior

ą

cych udział lub warunków

przebiegu procesu
Operacje jednostkowe – s

ą

to te czynno

ś

ci

jednostkowe w których wyniku zachodz

ą

przemiany fizyczne.

Procesy biotechnologiczne maj

ą

zró

ż

nico-

wany charakter, mog

ą

by

ć

prowadzone

wieloma sposobami i wymagaj

ą

ró

ż

nych

warunków technicznych Jest uzale

ż

nione od

-rodzaju surowca
-produktu wytwarzanego
-rodzaju biologiczno-chemicznej natury
czynnika katalitycznego
Wi

ę

kszo

ść

bioprocesów wymaga u

ż

ycia

-czystych kultur drobnoustrojów okre

ś

lonych

linii komórkowych lub konkretnych enzymów
-zapewnienia warunków aseptycznych
-prowadzenia procesów w specjalnych
bioreaktorach umo

ż

liwiaj

ą

cych kontrol

ę

warunków procesu. Prowadzone s

ą

tak

ż

e

procesy nie wymagaj

ą

ce warunków asep-

tycznych i przebiegaj

ą

ce z udziałem mie-

szanej populacji organizmów (np biologiczne
oczyszczanie

ś

cieków). Mog

ą

by

ć

równie

ż

prowadzone w innych warunkach np
mikrobiologiczne ługowanie metali.
Podział procesów biotechnologicznych:
-biosynteza
-biotransformacja
-biohydroliza
-fermentacja
-bioługowanie
-biodegradacja
PROGRAM OPRACOWANIA PROCESU
BIOTECHNOLOGICZNEGO
-przygotowanie technologii na przykładzie
procesu biosyntezy mikrobiologicznej
-proces obejmuje zarówno prace badawcze
jak i prace wdro

ż

eniowe Ogólnie mo

ż

na

wyró

ż

ni

ć

6 etapów opracowania procesu

1. pozyskiwanie odpowiednich drobnoustro-
jów (scrining)
2. wst

ę

pne ustalenie warunków hodowli

3. doskonalenie cech produkcyjnych
szczepów
4. optymalizacja procesu
5. powi

ę

kszenie skali procesu

6. uruchomienie produkcji
Ad.1. Pozyskiwanie drobnoustrojów –
poszukiwanie odpowiednich drobnoustrojów
prowadz

ą

cych okre

ś

lony bioproces lub

wytwarzaj

ą

cych okre

ś

lony bioprodukt

(izolacja, ocena przydatno

ś

ci, warunki

przechowywania) charakterystyka materiału
biologicznego (szybko

ść

wzrostu, szybko

ść

przyswajania substratu, szybko

ść

tworzenia

produktu, szybko

ść

oddychania)

Znajomo

ść

: mikrobiologia, biochemia,

biologia kmórki
Ad.2. dobór warunków hodowli – stworzenie
warunków zapewniaj

ą

cych szczepom

maksymaln

ą

produkcj

ę

(skład podło

ż

a,

prekursory, pH, potencjał O

2

, potencjał

redox, nast

ę

pnie temperatur

ę

, natlenienie

sposób prowadzenia hodowli: powierzch-
niowy czy wgł

ę

bny, okresowy czy ci

ą

gły. Na

tym etapie ustala si

ę

równie

ż

metody

wyodr

ę

bniania i oczyszczania bioproduktów,

oraz warunki tych operacji: ci

ś

nienie,

temperatura, lepko

ść

, pobór mocy.

Znajomo

ść

: mikrobiologia biochemia,

biologia komórki, in

ż

ynieria

Ad.3. doskonalenie cech produkcyjnych
szczepu – zwi

ę

kszenie potencjału gene-

tycznego szczepu w zakresie biosyntezy i
biotransformacji, okre

ś

lonego substratu w

ilo

ś

ci przewy

ż

szaj

ą

cej potrzeby własne

drobnoustrojów od kilkuset do kilkudziesi

ę

-

ciu tysi

ę

cy razy. Stosuje si

ę

nast

ę

puj

ą

ce

metody manipulacji genami: mutacje
genetyczne, fuzj

ę

protoplastów, rekombina-

cj

ę

DNA in vitro. Ponadto dzi

ę

ki in

ż

ynierii

genetycznej mo

ż

nakonstruowa

ć

szczepy,

które syntezuj

ą

bioprodukty, których drob-

noustroje macierzyste nigdy nie produkowa-
ły. Znajomo

ść

: genetyka, biologia moleku-

larna
Ad.4. Optymalizacja bioprocesu – ostatni
etap laboratoryjny. Jest konsekwencj

ą

maksymalnego wykorzystania potencjału
metabolicznego drobnoustrojów. Ustala si

ę

skład podło

ż

a, warunki jego mieszania i

napowietrzania, kinetyki bioprocesu i in.
Cz

ę

sto ten etap i nast

ę

puj

ą

ce po nim s

ą

opracowywane przy u

ż

yciu techniki kompu-

terowej. Znajomo

ść

: mikrobiologia, bioche-

mia,biologia komórki, chemia,in

ż

ynieria oraz

informatyka.
Ad.5. powi

ę

kszenie skali – przeniesienie

opracowanej w laboratorium technologii do
skali półtechnicznej (fermentatory o poj. 20-
1000L).
Znajomo

ść

in

ż

ynieria, informatyka, matema-

tyka, fizyka, ekonomia, ekologia
Ad.6. uruchomienie produkcji przemysłowej
– przeniesienie wyników do

ś

wiadcze

ń

laboratoryjnych, półtechnicznych do warun-
ków przemysłowych (fermentatory o poj.
10tys-200tys L)
Znajomo

ść

: in

ż

ynieria, informatyka, mate-

matyka, fizyka, ekonomia, ekologia.
Problemy bezpiecze

ń

stwa w biotechnologii.

Do głównych nale

żą

-analiza patogenno

ś

ci stosowanych drobno-

ustrojów
-ocena zagro

ż

e

ń

wynikaj

ą

cych z otrzymania

i stosowania organizmów konstruowanych
metodami in

ż

ynierii genetycznej.

W

ś

ród drobnoustrojów stosowanych w

biotechnologii przewa

ż

aj

ą

gatunki całkowicie

bezpieczne dla człowieka (np. bakterie
stosowane przy produkcji przetworów
mlecznych).Zastosowanie drobnoustrojów
chorobotwórczych (przy produkcji szczepio-
nek) wymaga przestrzegania

ś

cisłych

przepisów i tworzone s

ą

bardzo precyzyjne

mechanizmy kontroli warunków technicz-
nych bezpiecznego namna

ż

ania drobno-

ustrojów patogennych. Zagadnieniem
budz

ą

cym niepokój jest potencjalne niebez-

piecze

ń

stwo zwi

ą

zane z rozwojem in

ż

ynierii

genetycznej i biotechnologii z u

ż

yciem

organizmów modyfikowanych genetycznie.
Dotyczy to szczególnie szczepów konstru-
owanych dla rolnictwa jak równie

ż

wykorzy-

stywanych do utylizacji

ś

cieków.

Proces biotechnologiczny

Uproszczony schemat technologii zrekombi-
nowanego DNA

CHARAKTERYSTYKA DROBNOUSTRO-
JÓW PRZEMYSŁOWYCH
Termin drobnoustroje nie jest jednoznaczny.
Do grupy mikroorganizmów zalicza si

ę

bakterie, liczne grzyby a tak

ż

e niektóre

glony i pierwotniaki.
Wirusy to organizmy z pogranicza

ż

ycia i

materii nieo

ż

ywionej.

Drobnoustroje pełni

ą

wa

ż

n

ą

rol

ę

w proce-

sach biotechnologicznych dzi

ę

ki takim

cechom jak
-du

ż

a szybko

ść

przemiany materii

-wielka ró

ż

norodno

ść

prowadzonych reakcji

chemicznych
-znaczna zmienno

ść

fizjologiczna, co

pozwala na sterowanie przebiegiem proce-
sów
mikrobiologicznych przez dobór warunków

ś

rodowiskowych

-łatwo

ść

dokonywania zmian genetycznych

Rodzaje produktów wytwarzanych przez
drobnoustroje
-całe komórki (dro

ż

d

ż

e, preparaty paszowe,

szczepionki preparaty mikroflory)
-produkty ko

ń

cowe przemian metabolicz-

nych (etanol, kwas mlekowy, aceton,
butanol)
-produkty spo

ż

ywcze (jogurt, sery, piwo,

wino)
-produkty syntez podstawowych
a)małocz

ą

steczkowe (aminokwasy, kwas

cytrynowy, nukleotydy, witaminy)

b)wielkocz

ą

steczkowe (enzymy, lipidy,

polisacharydy)
-produkty syntez peryferyjnych (antybiotyki,
alkaloidy dekstran)
-produkty syntez i biotransformacji z udzia-
łem prekursorów (kwas 6-
aminopenicylanowy,
kwas akrylowy)
-produkty obce dla drobnoustrojów ze
zrekombinowanym DNA (insulina, interferon,
hormon wzrostu, inne białka).
Przydatno

ść

drobnoustrojów w biotechnolo-

gii ocenia si

ę

wg nast

ę

puj

ą

cych cech

u

ż

ytkowych

-wydajno

ść

i szybko

ść

tworzenia produktu

-czysto

ść

produktu

-szybko

ść

wzrostu

-niepatogenno

ść

i brak produktów toksycz-

nych
-stabilno

ść

genetyczna i fenotypowa

-fagooporno

ść

-wymagania pokarmowe (ilo

ś

ciowe i jako-

ś

ciowe)

-tolerancja na zmienne st

ęż

enia składników

podło

ż

a

-wielko

ść

zapotrzebowania na tlen oraz

tolerancja na zmiany warunków natlenienia
-wymagania w zakresie temperatury,
odczynu i innych parametrów procesów,
oraz wra

ż

liwo

ść

na ich zmiany

-łatwo

ść

wydzielenia produktu

-inne cechy technologiczne
a)korzystne np. zdolno

ść

do flokulacji

(proces tworzenia agregatów)
b)niekorzystne np. lepko

ść

pienisto

ść

hodowli
Sposoby od

ż

ywiania drobnoustrojów

Organizmy

ż

ywe dzielimy

Podział organizmów

ż

ywych:

*Podział ze wzgl

ę

du na zwi

ą

zki b

ę

d

ą

ce

ostatecznym akceptorem elektronów.
*Bilans materiałowy metabolizmu glukozy z
tlenowej i beztlenowej hodowli dro

ż

d

ż

y

*Wymagania pokarmowe drobnoustrojów
*Drobnoustroje wykorzystywane w proce-
sach biotechnologicznych charakteryzuj

ą

si

ę

niewielkimi wymaganiami pokarmowymi.
Wi

ę

kszo

ść

z nich to organizmy prototroficz-

ne
(zdolne do syntezy wszystkich składników
komórki z pojedynczego

ź

ródła w

ę

gla np.

glukozy) Niektóre szczepy s

ą

naturalnymi

lub sztucznie indukowanymi auksotrofami,

wymagaj

ą

cymi dodatku witamin aminokwa-

sów lub innych zwi

ą

zków organicznych,

specyficznych dla danego procesu.
Podło

ż

a do hodowli

-minimalne zawieraj

ą

ce jedynie zwi

ą

zki

niezb

ę

dne dla wzrostu drobnoustrojów (nie

sprzyjaj

ą

jednak szybkiemu namna

ż

aniu

drobnoustrojów, gromadzeniu du

ż

ej bioma-

sy czy te

ż

wydajnej biosytnezy dlatego s

ą

raczej stosowane w procesach badawczych
a rzadziej w procesach biotechnologicz-
nych).
-podło

ż

a wzbogacone zawieraj

ą

takie

składniki jak namok kukurydziany, melas

ę

i

serwatk

ę

. Podło

ż

a kompleksowe maj

ą

pewne wady, trudny do okre

ś

lenia skład

jako

ś

ciowy i ilo

ś

ciowy co jest wynikiem

zmienno

ś

ci i nieodtwarzalno

ś

ci składu

chemicznego u

ż

ytych surowców komplek-

sowych pochodz

ą

cych z ró

ż

nych

ź

ródeł.

Surowce kompleksowe
Namok kukurydziany zawiera 45-55%
suchej masy głównie zwi

ą

zki azotowe w tym

azotu białkowego 8% Jest

ź

ródłem amino-

kwasów i peptydów poza tym zawiera
cukry(2-10%sm) kwas mlekowy(10-30%sm)
zwi

ą

zki fosforowe(3-5%sm) jest tak

ż

e

ź

ródłem witamin i soli mineralnych.

Melasa - produkt uboczny przy produkcji
cukru z buraków cukrowych: g

ę

sty lepki

ciemnobrunatny syrop zawieraj

ą

cy ok 50%

cukru stosowana jet jako dodatek do pasz w
przemy

ś

le fermentacyjnym i spo

ż

ywczym

(produkcja spirytusu dro

ż

d

ż

y kw. Cytryno-

wego, kwasu mlekowego, gliceryny. Zwi

ą

zki

azotowe stanowi

ą

ponad 12% sm. Zawiera

równie

ż

sole mineralne i witaminy.

Serwatka – produkt uboczny uzyskiwany
podczas przerobu mleka na ser i twaróg.
Wyró

ż

nia si

ę

serwatk

ę

podpuszczkow

ą

oraz

kwasow

ą

. Zawieraj

ą

głównie wod

ę

a tak

ż

e

tłuszcz białko i laktoz

ę

. Serwatka zawiera k

50% laktozy zawartej w mleku jak równie

ż

białko witaminy zwi

ą

zki mineralne Białka

cz

ę

sto s

ą

wydzielane i oczyszczone sprze-

dawane jako białko serwetkowe.
Proces pozyskiwania i ulepszania szczepów
przemysłowych
Nowe biotechnologie wymagaj

ą

u

ż

ycia

szczepów drobnoustrojów produkcyjnych o

ś

ci

ś

le zaprogramowanych wła

ś

ciwo

ś

ciach

metabolicznych. Mo

ż

na wyselekcjonowa

ć

ze

ś

rodowiska naturalnego szczep dziki

wyró

ż

niaj

ą

cy si

ę

przydatno

ś

ci

ą

do okre

ś

lo-

nego procesu biotechnologicznego jednak

ż

e

opracowanie wydajnego i ekonomicznie
opłacanego procesu wymaga najcz

ęś

ciej

przeprowadzenia doskonalenia cech
u

ż

ytkowych szczepu dzikiego. Pozyskiwanie

szczepów zasady racjonalnego skriningu
Poj

ę

cie skriningu drobnoustrojów lub

produktów ich metabolizmu definiowane jest
jako kompleksowe post

ę

powanie obejmuj

ą

-

ce zespół selektywnych zabiegów maj

ą

cych

na celu
-wykrycie i izolacj

ę

spo

ś

ród du

ż

ej liczby

mo

ż

liwych tylko tych drobnoustrojów które

s

ą

celem bada

ń

-wst

ę

pn

ą

ocen

ę

przydatno

ś

ci do danego

procesu
Ulepszanie szczepów
Klasycznym sposobem wywoływania zmian
jest dokonywanie trwałych zmian genetycz-
nych poprzez proces mutagenizacji i selekcji
wykorzystywanych mutantów. Taka
mutagenizacja genetyczna mo

ż

e zwi

ę

kszy

ć

wydajno

ść

szczepu.

Mutacje
Mutacj

ą

nazywamy zmian

ę

w strukturze

DNA na skutek jego uszkodzenia. Mutacje
dziedziczy si

ę

w nast

ę

pnych pokoleniach.

Rodzaje mutacji
-mutacje spontaniczne (naturalne) zachodz

ą

samoczynnie z cz

ę

sto

ś

ci

ą

mniejsz

ą

ni

ż

10-5

S

ą

powa

ż

nym problemem w procesach

biotechnologicznych poniewa

ż

mog

ą

doprowadzi

ć

do zdominowania hodowli

przez niekorzystne mutanty i doprowadzi

ć

do utraty przez szczep produkcyjny cech
wa

ż

nych biotechnologicznie

-mutacje indukowane zachodz

ą

pod wpły-

wem czynników fizycznych (promieniowanie
UV najcz

ęś

ciej w zakresie tzw dalekiego UV

czyli 254-265nm, promieniowanie jonizuj

ą

-

ce,pr

ę

dkie neutrony oraz czynników che-

micznych (kwas azotawy, zwi

ą

zki alkiluj

ą

ce,

iperyt, nitrozoaminy, barwniki akrydynowe
przykłady zwi

ą

zków alkiluj

ą

cych:

-etyenoimina
-metylosulfonian metylu
-metylosulfonian etylu

-dimetylonitrozoamina
W strukturze DNA wywołane przez czynniki
mutagenne zmiany mog

ą

dotyczy

ć

obszaru

od kilku do kilku milionów par zasad.
Klasyczna mutagenizacja stanowi zatem
typowe post

ę

powanie losowe: opiera si

ę

na

pracochłonnej metodzie prób i bł

ę

dów.

Schemat mutacji punktowej:
Przepływ informacji genetycznej w
komórce:

DNA

Pary zasad: T=A i G

≡

C

Informacja genetyczna to sekwencja zasad
heterocyklicznych.
Struktura DNA ilustruje podstawow

ą

zale

ż

-

no

ść

wspóln

ą

dla wszystkich biocz

ą

steczek

-

ś

cisł

ą

zale

ż

no

ść

mi

ę

dzy struktur

ą

a funkcj

ą

Wła

ś

ciwo

ś

ci

ą

DNA które pozwalaj

ą

temu

biopolimerowi funkcjonowa

ć

jako wydajny i

stabilny no

ś

nik informacji jest struktura

-DNA jest liniowym polimerem czterech
monomerów (zasad A,G,T,C)
-ka

ż

dy nukleotyd składa si

ę

reszty cukrowej

deoksyrybozy i grupy fosforanowej i z
zasady heterocyklicznej
-rdze

ń

polimerowy stanowi

ą

powtarzaj

ą

ce

si

ę

reszty fosforanowo-cukrowe (rdze

ń

fosforanowo-cukrowy)
Do ka

ż

dej reszty cukrowej doł

ą

czona jest

zasada heterocykliczna. Kolejno

ść

zasad

oznacza sekwencj

ę

. Sekwencja stanowi

informacj

ę

genetyczn

ą

(instrukcj

ę

do syntezy

białek kieruj

ą

cych syntez

ą

innych cz

ą

ste-

czek, tworz

ą

cych całe komórki i całe

organizmy.
Zasady heterocykliczne
Dwie pojedyncze nici DNA ł

ą

cz

ą

si

ę

tworz

ą

c

dwuniciow

ą

helis

ę

.

Helisa DNA zło

ż

ona jest z dwóch oplataj

ą

-

cych si

ę

nici uło

ż

onych tak

ż

e cukrowo-

fosforowy rdze

ń

le

ż

y na zewn

ą

trz a zasady

heterocykliczne s

ą

we wn

ę

trzu helisy.

Najwa

ż

niejsz

ą

cech

ą

tej struktury jest

specyficzno

ść

parowania si

ę

zasad poprzez

wi

ą

zania wodorowe A=T G

≡

C Wi

ą

zania

wodorowe sa znacznie słabsze od kowalen-
cyjnych. Wi

ą

zania tego typu s

ą

jednak

bardzo istotne z punktu widzenia układów
biologicznych i ich aktywno

ś

ci.

Zaproponowana przez Watsona i Cricka
struktura dwuniciowej helisy DNA ma dwie
cechy o kluczowym znaczeniu w pełnieniu
przez DNA funkcji no

ś

nika informacji

genetycznej
1. struktura ta jest kompatybilna z ka

ż

d

ą

sekwencj

ą

zasad (pary zasad maj

ą

zasadni-

czo taki sam kształt)
2. sekwencja wzdłu

ż

jednej nici determinuje

całkowicie sekwencj

ę

drugiej nici (jako wynik

komplementarno

ś

i).

A zatem je

ś

li dwuniciowa helisa ulega

rozdzieleniu na dwie pojedyncze nici to
ka

ż

da z nich mo

ż

e pełni

ć

rol

ę

matrycy w

tworzeniu nowej komplementarnej nici
poprzez specyficzne parowanie zasad.
RNA po

ś

redniczy w przepływie informacji

genetycznej.
Organizmy których geny zbudowane s

ą

z

DNA musz

ą

najpierw zamieni

ć

informacj

ę

genetyczn

ą

z DNA na RNA by była ona

dost

ę

pna i funkcjonalna.

Struktura RNA jest podobna do DNA. Jest
polimerem zbudowanym z czterech mono-
merów- nukleotydów A, G, C, U. Podstawo-
w

ą

ró

ż

nic

ą

mi

ę

dzy RNA i DNA jest to,

ż

e

reszt

ą

cukrow

ą

jest tu ryboza a zamiast

tyminy wyst

ę

puje uracyl.

RNA wyst

ę

puje w komórce na ogół w

postaci pojedynczej nici jakkolwiek niektóre
segmenty s

ą

dwuniciowe.

Funkcje jakie pełni RNA:
1. po

ś

redniczy w przepływie informacji od

DNA do białek (transkrypcja: mRNA).
2. RNA pełni rol

ę

cz

ą

steczek adaptorowych

(tRNA) które przetwarzaj

ą

informacje

zawart

ą

w sekwencji kwasu nukleinowego

mRNA w okre

ś

lone białko (udział tRNA w

procesie translacji)
3. RNA jest wa

ż

nym składnikiem maszynerii

komórkowej, która prowadzi proces transla-
cji.

rRNA jest składnikiem buduj

ą

cym rybosomy.

Unikatowa pozycja roli RNA jako po

ś

rednika

pomi

ę

dzy „magazynem” informacji gene-

tycznej DNA a funkcjonalnym produktem tej
informacji – białkiem jak i mo

ż

liwo

ść

ł

ą

czenia wła

ś

ciwo

ś

ci no

ś

nika informacji

genetycznej i katalitycznych wła

ś

ciwo

ś

ci

(rybosomy) wskazuje

ż

e RNA odgrywa

istotn

ą

rol

ę

w ewolucji (hipoteza

ś

wiata

RNA). Wszystkie białka zaczynaj

ą

si

ę

od

metioniny Cz

ą

steczki transferowego RNA

po

ś

rednicz

ą

w odczytaniu informacji z DNA i

syntezie białka. Zawiera antykodon – trójka
zasad komplementarna do kodonu do ko

ń

ca

3' doł

ą

czony jest odpowiedni aminokwas.

Enzymy – narz

ę

dzia in

ż

ynierii genetycznej

-endonukleazy przecinaj

ą

ce DNA w tym

endonukleazy restrykcyjne
-polimerazy DNA
-odwrotna transkryptaza – synteza DNA na
matrycy mRNA (synteza cDNAkomplemen-
tarny DNA)
-ligaza enzym ł

ą

cz

ą

cy kowalencyjnie odcinki

DNA (w strukturach dwuniciowych)
UPROSZCZONY SCHEMAT TECHNOLO-
GII ZREKOMBINOWANEGO DNA
Enzymy restrykcyjne – rozpoznaj

ą

sekwen-

cje DNA i przecinaj

ą

j

ą

w danym miejscu s

ą

to tzw. no

ż

yczki molekularne. Wyst

ę

puj

ą

w

bakteriach a wytworzone zostały do obrony
przed bakteriofagami. Ka

ż

dy enzym restryk-

cyjny poł

ą

czony jest z innymi enzymami

zabezpieczaj

ą

cymi, dzi

ę

ki czemu nie

rozcinaj

ą

swojego DNA. Sekwencje typu

palindromowego – czyli takie które s

ą

symetryczne. Mog

ą

tu wyst

ą

pi

ć

trzy sposoby

rozcinania. Istnieje mo

ż

liwo

ść

poci

ę

cia DNA

w sposób odwracalny, mo

ż

emy ł

ą

czy

ć

je

cz

ą

steczk

ą

która słu

ż

y nam do transformacji

danego organizmu czy innego DNA.
Enzymy s

ą

narz

ę

dziami in

ż

ynierii genetycz-

nej
-polimerazy DNA- potrafi

ą

zsyntetyzowa

ć

komplementarn

ą

ni

ć

DNA wzoruj

ą

c si

ę

matryc

ą

(mo

ż

e powieli

ć

DNA)

-odwrotna transkryptaza- synteza DNA na
matrycy mRNA (synteza cDNAkomplemen-
tarny DNA). Enzym ten potrafi zsyntetyzo-
wa

ć

na matrycy RNA drug

ą

ni

ć

która jest ju

ż

nici

ą

DNA. Nast

ę

puje rozplecenie i do nici

DNA syntezowana druga ni

ć

DNA.

cDNA-geny wytworzone sztucznie na bazie
mRNA za pomoc

ą

odwrotnej transkryptazy.

-ligaza- enzym który w momencie gdy
wyst

ę

puj

ą

nici poł

ą

czone lepkimi ko

ń

cami

ł

ą

czy je na stałe Enzym ł

ą

czy odcinki

kowalencyjnie
PCR- polimerowa reakcja ła

ń

cuchowa. DNA

ogrzewamy do 100°C, nast

ę

puje rozplece-

nie nici.
Starter (primery) s

ą

to krótkie (najcz

ęś

ciej

ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA kom-
plementarne do matrycy. Do reakcji wpro-
wadza si

ę

matrycowy DNA, trifosforany

deoksyrybonukleotydów, startery (primery),
oraz termostabiln

ą

polimeraz

ę

DNA. W

wy

ż

szej temperaturze (zwykle około 95°C)

p

ę

kaj

ą

wi

ą

zania wodorowe i podwójna

helisa. DNA rozdziela si

ę

na dwa pojedyn-

cze ła

ń

cuchy. W temperaturze ni

ż

szej,

ś

ci

ś

le

okre

ś

lonej dla danej pary starterów (pomi

ę

-

dzy 45-70°C), przył

ą

czaj

ą

si

ę

one do

matrycy. Podwy

ż

szenie temperatury do

około 72°C powoduje utworzenie si

ę

na

matrycy, z przył

ą

czonymi do niej starterami,

kompleksu z polimeraz

ą

DNA, wskutek

czego rozpoczyna si

ę

synteza nici komple-

mentarnej do matrycy. Twórc

ą

metody PCR

jest Kary Mullis. Metoda ta zacz

ę

ła by

ć

szeroko stosowana gdy polimeraz

ę

Klerova

mo

ż

na było zast

ą

pi

ć

termostabiln

ą

polime-

raz

ą

z bakterii Thermus aquaticus.

Polimeraza Taq. Optymalna temperatura
polimeryzacji dla tego enzymu to 70-79°C.
Enzym zachowuje zdolno

ść

polimeryzacji po

wielokrotnym ogrzewaniu do temp 95°C
(taka temperatura jest wymagana do
przeprowadzenia denaturacji dwuniciowego
DNA). Dzi

ę

ki tym wła

ś

ciwo

ś

ciom polimerazy

Taq proces powielania DNA udało si

ę

zautomatyzowa

ć

. Proces ten polega na

umieszczeniu próbki powielanego DNA w
obj

ę

to

ś

ci nie wi

ę

kszej ni

ż

0,1ml. Proces

składa si

ę

z trzech etapów:

1. denaturacja podwójnej helisy DNA
zachodzi w temperaturze 95°C przez 15-
30sek
2. renaturacja (wi

ą

zanie hybrydyzacja

starterów) Mieszanin

ę

szybko si

ę

chłodzi do

okre

ś

lonej temperatury, w której startery

mog

ą

tworzy

ć

dwuniciowe struktury hybry-

dowe na ko

ń

cach ka

ż

dej nici DNA

3. elongacja (wła

ś

ciwy etap syntezy DNA na

matrycy DNA). Temperatur

ę

mieszaniny

podwy

ż

sza si

ę

zwykle do 72°C i utrzymuje

przez zadany okres czasu aby umo

ż

liwi

ć

polimerazie skopiowanie ka

ż

dej jednonicio-

wej matrycy
Metoda A (rys.)
Metoda cDNA

Metoda chemiczno enzymatyczna
Naturalne metody wymiany informacji
genetycznej u drobnoustrojów.
Rekombinacja genetyczna definiowana jako
proces w wyniku którego powstaj

ą

nowe

kombinacje genów, stanowi podstaw

ę

bardziej racjonalnego ani

ż

eli mutagenizacja,

sposobu otrzymywania szczepów przydat-
nych do celów biotechnologicznych. Proces
ten wykorzystywany jest w dwojaki sposób:
1) poprzez hybrydyzacj

ę

czyli krzy

ż

owanie

szczepów
2) konstruowanie sztucznych kombinacji
genów in vitro i uzyskiwanie dokładnie
zaprogramowanych informacji genetycznej
w komórkach odpowiednio dobranego
gospodarza (in

ż

ynieria gospodarcza

technologia zrekombinowanego DNA)
Podstawy hybrydyzacji
naturalna hybrydyzacja wi

ąż

e si

ę

z przeka-

zywaniem informacji genetycznej z komórki
dawcy do biorcy w wyniku przedłu

ż

onego

kontaktu obu komórek i polega na wymianie
odcinków DNA (rekombinacji) mi

ę

dzy

chromosomami lub genoforami dawcy i
biorcy w procesie okre

ś

lanym jako crossing

over. W wyniku zachodz

ą

cej nast

ę

pnie

separacji czyli rozdzielenia materiału
genetycznego w komórkach potomnych
mo

ż

na otrzyma

ć

hybrydy (rekombinaty) o

zmienionym genotypie i nowych wła

ś

ciwo-

ś

ciach metabolicznych. Jedn

ą

z koncepcji

wykorzystania procesu hybrydyzacji drob-
noustrojów do ich ulepszania było pozyski-
wanie nowego warto

ś

ciowego materiału

genetycznego ze

ś

rodowisk naturalnych i

u

ż

ycie do wzbogacania genotypów obecnie

stosowanych upo

ś

ledzonych genetycznie

szczepów produkcyjnych. Zasadniczym
działaniem stało si

ę

krzy

ż

owanie szczepów,

pochodz

ą

cych z ró

ż

nych linii mutacyjno-

selekcyjnych zwłaszcza wywodz

ą

cych si

ę

od ró

ż

nych przodków. Hybrydyzacja umo

ż

-

liwia popraw

ę

wielu wa

ż

nych cech stano-

wi

ą

cych obok wydajno

ś

ci produktu o

warto

ś

ci technologicznej szczepów przemy-

słowych. Dotyczy to mi

ę

dzy innymi przyswa-

janie wa

ż

nych substratów zmiany wymaga

ń

pokarmowych, tolerancji na zmian

ę

st

ęż

enia

ró

ż

nych składników podło

ż

a i warunki

natlenienia, tworzenia produktów ubocz-
nych, szybko

ś

ci wzrostu oraz takich cech

technologicznych jak pienienie si

ę

i wła

ś

ci-

wo

ś

ci filtracyjne hodowli.

Procesy paraseksualne u bakterii
Koniugacja – poł

ą

czenie si

ę

dwóch komórek

bakteryjnych po którym nast

ę

puje

jednostronne przekazanie du

ż

ych fragmen-

tów DNA z komórki dawcy (m

ę

skiej do

komórki biorcy (

ż

e

ń

skiej ).

Transdukcja – przekazanie materiału
genetycznego przez wirusy (bakteriofagi
przenosz

ą

fragmenty DNA z jednej komórki

do drugiej).
Transformacja – proces wnikania do komórki
biorcy fragmentów DNA bez kontaktu z
komórk

ą

dawcy i zast

ą

pienie przez ten

fragment DNA odpowiedniego fragmentu
genomu biorcy.
Koniugacja- poł

ą

czenie si

ę

dwóch komórek

bakteryjnych po którym nast

ę

puje jedno-

stronne przekazanie du

ż

ych fragmentów

DNA z komórki dawcy do komórki biorcy
przy czym dawc

ą

jest komórka m

ę

ska Hfr

za

ś

biorc

ą

komórka

ż

e

ń

ska F Proces ten

składa si

ę

z nast

ę

puj

ą

cych etapów :

-ł

ą

czenie si

ę

komórek o ró

ż

nych cechach

poprzez wytworzenie mostka
cytoplazmatycznego. Dla zaj

ś

cia tego etapu

konieczne jest wyst

ę

powanie w

ś

cianie

komórkowej komórki biorcy tzw substancji
komplementarnych, które pozwalaj

ą

zaak-

ceptowa

ć

partnera

-przej

ś

cie fragmentu DNA zawieraj

ą

cego

cech

ę

a+ z komórki dawcy do komórki

biorcy

-wł

ą

czenie cechy a+ do DNA komórki biorcy

przez zast

ą

pienie t

ą

cech

ą

odpowiedniego

fragmentu genomu biorcy
-powstanie rekombinatów genetycznych
posiadaj

ą

cych now

ą

cech

ę

Mechanizm wnikania i namna

ż

ania bakterio-

faga
A -adsorpcja wirusa na powierzchni komórki
bakteryjnej
B -wnikanie materiału genetycznego wirusa
do wn

ę

trza komórki bakteryjnej

C,D -otaczanie cz

ą

steczek wirusa w zaka-

ż

onej komórce

E -liza komórki bakteryjnej i wydalenie z niej
fagów
Proces lizogeniczny- materiał genetyczny
wbudowuje si

ę

w genom bakterii i pozostaje

w u

ś

pieniu.

Mechanizm transdukcji
-w momencie zetkni

ę

cia si

ę

wra

ż

liwej

komórki bakterii z fagiem nast

ę

puje adsorp-

cja wirusa na jej powierzchni w sposób
nieodwracalny (z udziałem czułki i płytki
faga)
-skurcz osłonki ogonka fagowego i przenik-
ni

ę

cie ogonka w gł

ą

b

ś

ciany a nast

ę

pnie

błony komórkowej bakterii
-wprowadzenie DNA do wn

ę

trza bakterii

kanalikiem rdzenia ogonka. Po przenikni

ę

ciu

fag przestawia metabolizm bakterii na
produkcj

ę

własnego DNA i własnego białka.

W rezultacie powstaj

ą

w komórce bakteryj-

nej dojrzałe fagi przy czym niektóre z nich
posiadaj

ą

fragmenty DNA bakterii zamiast

własnego DNA
-liza (rozpad) komórek bakteryjnych
-bakteriofag zawieraj

ą

cy DNA fagowo-

bakteryjne, zaka

ż

aj

ą

c kolejne komórki

bakteryjne b

ę

dzie wnosił do nich ten

kompleks DNA.
Etapy transformacji
-po wyizolowaniu fragmentów DNA (materiał
genetyczny mo

ż

e by

ć

pobrany z komórek

martwych gdy

ż

nie traci on swych zdolno

ś

ci

do przechowywania cech genetycznych
innych organizmów) z komórek dawcy
nast

ę

puje ich sorpcja na powierzchni

komórek biorcy
-transport zaadsorbowanej cz

ą

steczki DNA

przez

ś

cian

ę

komórkow

ą

i błon

ę

cytopla-

zmatyczn

ą

komórek biorcy

-wł

ą

czenie DNA dawcy do genomu biorcy

-procesy zewn

ę

trznego wyra

ż

ania nowej

cechy
WEKTORY
Wektory czyli przeno

ś

niki genów

Wprowadzenie po

żą

danego genu do

wybranego mikroorganizmów wymaga
wł

ą

czenia go do wi

ę

kszej cz

ą

stki DNA któr

ą

transformuje si

ę

komórk

ę

biorcy. W tym celu

stosuje si

ę

wektory

-plazmidowe
-fagowe
-kosmidowe (hybrydy składaj

ą

ce si

ę

DNA

plazmidowego i sekwencji cos faga lambda)
Struktura wektora musi by

ć

tak zaprogra-

mowana aby poza wprowadzeniem po

żą

da-

nego genu do komórki zapewni

ć

jego

-powielenie
-stabilno

ść

-dobr

ą

ekspresj

ę

klonowanej cechy

-łatw

ą

detekcj

ę

jego obecno

ś

ci

-ochron

ę

zrekombinowanego DNA i produk-

tu finalnego(białka) przed enzymatyczn

ą

degradacj

ą

-ewentualnie transport białka poza komórk

ę

PLAZMID
Plazmidy s

ą

dwuniciowymi kolistymi cz

ą

-

steczkami DNA naturalnie wyst

ę

puj

ą

cymi w

niektórych bakteriach. Ich wielko

ść

to od

kilku do kilkudziesi

ę

ciu tysi

ę

cy par nukleoty-

dów. Mog

ą

wyst

ę

powa

ć

w komórce bakte-

ryjnej w liczbie od kilku do kilkunastu kopii.
Plazmidy posiadaj

ą

własne regulatorowe

sekwencje nukleotydów ori(origin of replica-
tion) kontroluj

ą

ce ich automatyczn

ą

replika-

cj

ę

, która dzi

ę

ki temu mo

ż

e zachodzi

ć

niezale

ż

nie i z wi

ę

ksz

ą

cz

ę

stotliwo

ś

ci

ą

ni

ż

powielanie DNA genoforowego (czyli
replikuj

ą

niezale

ż

nie od głównego chromo-

somu bakteryjnego). Charakterystyka
wektorów plazmidowych. Pojemno

ść

wektorów plazmidowych ograniczona jest
sposobem wprowadzania zrekombinowa-
nych cz

ą

stek DNA do komórek gospodarza.

Przy klasycznej transformacji wielko

ść

wstawki nie powinna by

ć

wi

ę

ksza ni

ż

ok

10kb (10 tys par zasad). Warto zwróci

ć

jeszcze uwag

ę

na ilo

ść

kopii wektora w

komórce Istniej

ą

wektory

niskokopijne i wysokokopijne co uzale

ż

nione

jest od rodzaju ori.
Wprowadzenie plazmidów do komórek
biorcy. Wektory plazmidowe wprowadzane
s

ą

do komórek bakterii przy wykorzystaniu

zjawiska transformacji. W przypadku
stosowanej najcz

ęś

ciej bakterii E.Coli

wymaga to zwi

ę

kszenia przepuszczalno

ś

ci

błon komórkowych czyli ukompetentnienia.
W tym celu wystawia si

ę

komórki na wysok

ą

koncentracj

ę

pewnych dwuwarto

ś

ciowych

kationów w typowej procedurze komórki
traktuje si

ę

roztworem CaCl2. Zazwyczaj

jedna komórka na milion zostaje stransfor-
mowana i jedna cz

ą

steczka na tysi

ą

c

zrekombinowanych plazmidów transformuje
komórk

ę

bakteryjn

ą

. Markerem selekcyjnym

jest gen oporno

ś

ci na antybiotyk

Komórki które nie przyj

ę

ły plazmidu umiera-

j

ą

, natomiast te które go przyj

ę

ły

ż

yj

ą

i

mno

żą

si

ę

dalej. W plazmidach zawarte

mog

ą

by

ć

geny oporno

ś

ci na antybiotyki i

inne substancje toksyczne, co jest dla
bakterii bardzo korzystne poniewa

ż

umo

ż

li-

wia przetrwanie w niesprzyjaj

ą

cych warun-

kach. Plazmidowe geny odporno

ś

ci na

antybiotyki stanowi

ą

wa

ż

n

ą

cech

ę

selekcyj-

n

ą

wykorzystywan

ą

podczas klonowania i

namna

ż

ania szczepów ze zrekombinowa-

nym DNA
Metoda selekcji wykorzystuj

ą

ca obecno

ść

w

plazmidzie 2 genów oporno

ś

ci na dwa ró

ż

ne

antybiotyki:
Selekcja na podstawie barwy
Bardziej przemy

ś

lanym sposobem rozpo-

znania obecno

ś

ci rekombinowanych

plazmidów, mo

ż

liwym do przeprowadzenia

na jednej szalce jest ich przeszukiwanie na
podstawie białej lub niebieskiej barwy koloni
komórek. Metoda równie

ż

oparta jest na

inercyjnej inaktywacji genu i wykorzystuje
powstawanie niebieskiego barwnika jako
indykatora. System selekcji opiera si

ę

na

tzw te

ś

cie alfa-komplementacji.

Stosowane s

ą

plazmidy serii pUC. Polilinke-

ry w tego typu wektorach umiejscowione s

ą

w obr

ę

bie genu koduj

ą

cego N-ko

ń

cowy

peptyd

β

-galaktozydazy (białka enzyma-

tycznego który degraduje laktoz

ę

na glukoz

ę

i galaktoz

ę

).

Transformowane s

ą

bakterie które maj

ą

mutacje akurat we fragmencie genu koduj

ą

-

cym t

ą

cz

ęść

enzymu.

W takim szczepie aktywna

β

-galaktozydaza

powstaje dopiero po dostarczeniu prawidło-
wej cz

ęś

ci genu niesionej przez plazmidach

Kolonie zmutowanych komórek E.coli które
pobrały plazmid pUC i zostały wyhodowane
na specjalnej po

ż

ywce zawieraj

ą

cej chromo-

forowy substrat X-pal (5-bromo-4-chloro-3-
indolino-

β

-galaktozyd) maj

ą

barw

ę

niebie-

sk

ą

. Wynika to z obecno

ś

ci w tych komór-

kach aktywnej

β

-galaktozydazy.

Wł

ą

czenie w obr

ę

b polilinkera pUC dodat-

kowego fragmentu DNA (klonowanego
genu) powoduje inaktywacj

ę

genu loc Z i

zablokowanie syntezy N-ko

ń

cowej cz

ęś

ci

β

-galaktozydazy . Po transformacji komórek

E.coli takim plazmidem nie jest produkowa-
na

β

-galaktozydaza i hodowane kolonie

maj

ą

białe zabarwienie. Tak wi

ę

c mo

ż

na

łatwo wyró

ż

ni

ć

komórki zawieraj

ą

ce wektory

zrekombinowane.
WEKTORY FAGOWE
Klonowanie w wektorze pochodnym fa-
ga.Mo

ż

na wstawi

ć

20-25 tys par zasad.

Genom bakteriofaga

λ

jest dwuniciow

ą

cz

ą

steczk

ą

DNA o znanej sekwencji 49502

par zasad mieszcz

ą

c

ą

ok 40 genów.

W dojrzałych cz

ą

steczkach wirusowych DNA

ma form

ę

liniowej cz

ą

steczki zako

ń

czonej

12 nukleotydowymi jednoniciowymi „lepkimi
ko

ń

cami”nazywanymi sekwencjami cos.

Z DNA faga lambda mo

ż

na usun

ąć

odcinek

stanowi

ą

cy około 30% genomu pozostawia-

j

ą

c jego lewe i prawe ramie zawieraj

ą

ce

niezb

ę

dne geny w cyklu

ż

yciowym. Ponie-

wa

ż

do główki białkowej faga nie jest

pakowany DNA o długo

ś

ci ró

ż

ni

ą

cej si

ę

o

wi

ę

cej ni

ż

75-105% długo

ś

ci DNA faga

dzikiego. Mo

ż

na to zjawisko wykorzystywa

ć

do selekcji zrekombinowanych cz

ą

steczek

DNA, gdy

ż

tylko takie b

ę

d

ą

infekcyjne.

Podobnie jak w wektorach plazmidowych do
wektorów bakteriofagowych faga

λ

równie

ż

wstawiono odpowiednie polilinkery,geny
markerowe, silne promotory itp.
Czynno

ś

ci pakowania DNA do główek faga

mo

ż

na wykona

ć

in vitro.

Dzi

ę

ki 12 nukleotydowym, wzajemnie

komplementarnym jednoniciowym fragmen-

tom DNA na ko

ń

cach cz

ą

steczki DNA faga

tzw sekwencjom cos- mo

ż

liwe jest przybra-

nie przez DNA faga w komórce bakteryjnej
formy kulistej oraz zapakowanie go w
białkow

ą

główk

ę

. Maksymalna wielko

ść

DNA który mo

ż

e by

ć

sklonowany w wekto-

rach stosowanych w transformacji komórek
prokariotycznych.

Typ wektora

Dł.klonówDNA

PLAZMID

10 (kb)

BAKTERIOFAG

25 (kb)

KOSMID

45 (kb)

YAC

500 (kb)

YAC-sztuczne chromosomy dro

ż

d

ż

owe.

WEKTORY EKSPRESYJNE
wektory te zawieraj

ą

odpowiednie sekwen-

cje promotorowe i regulatorowe, które w
komórce umo

ż

liwiaj

ą

skuteczn

ą

transkrypcje

przyległego do nich wprowadzonego do
wektora odcinka DNA. Wektory te kieruj

ą

syntez

ą

du

ż

ych ilo

ś

ci odpowiedniego mRNA

które w komórkach ulega translacji skon-
struowano ró

ż

nego rodzaju wektory ekspre-

syjne przeznaczone do stosowania w
ró

ż

nych komórkach gospodarzy: bakterii

dro

ż

d

ż

ach w komórkach owadzich i ssa-

czych Wektor ekspresyjny powinien
posiada

ć

:

-silny promotor warunkuj

ą

cy dobr

ą

ekspre-

sj

ę

klonowanego genu

-sekwencj

ę

liderowa wi

ą

zania mRNA z

rybosomem
-kodon inicjacji syntezy białka naturalnego
dla gospodarza w celu wytworzenia białka
hybrydowego co chroni je przed hydroliz

ą

przez enzymy proteolityczne gospodarza
-sekwencje sygnałowa dla białka które mog

ą

by

ć

transportowane poza komórk

ę

.

Wektory ekspresyjne tego typu wykorzysta-
no do:
-celów naukowych by otrzyma

ć

liczne białka

wa

ż

ne dla biologii komórki w ilo

ś

ciach

wystarczaj

ą

cych do przeprowadzenia

szczegółowych bada

ń

-celów przemysłowych szczególnie do
produkcji du

ż

ych ilo

ś

ci białek wa

ż

nych w

medycynie np. Produkcja czynnika VIII
krzepliwo

ś

ci krwi, insuliny, hormonu wzrostu

lub białek wirusowych -kapsydów słu

żą

cych

jako szczepionki
INSULINA
Insulina ludzka (HI-human insulin)
Produkowany w trzustce polipeptyd zbudo-
wany z 51 aminokwasów. Mimo

ż

e jej masa

cz

ą

steczkowa wynosi około 6000Da to

cz

ę

sto zaliczana jest do białek z uwagi na

łatwo

ść

z jak

ą

z cynkiem lub innymi jonami

krystalizuje w postaci dimerów lub heksame-
rów. Insulina wykazuje szerokie spektrum
aktywno

ś

ci biologicznej:

-obni

ż

a poziom glukozy we krwi

-wzmaga biosyntez

ę

aminokwasów, białek i

kwasów tłuszczowych
-wpływa na wnikanie glukozy do tkanek
tłuszczowych i mi

ęś

ni.

Niski poziom insuliny powoduje

ż

e niewyko-

rzystana glukoza gromadzi si

ę

w organizmie

i powoduje szereg dolegliwo

ś

ci (cukrzyca).

Nieleczona cukrzyca powoduje uszkodzenie
naczy

ń

krwiono

ś

nych, serca tkanki nerwo-

wej i nerek. W zaawansowanych postaciach
cukrzycy jedynym lekiem ratuj

ą

cy

ż

ycie jest

egzogenna insulina przyjmowana podskór-
nie lub do

ż

ylnie. Insulina została odkryta

przez Bantinga w 1921r (nagroda Nobla w
1923r) a jej struktura pierwszorz

ę

dowa

została ustalona przez Sangera w 1955
(nagroda Nobla w 1958r). Insulina ludzka
zbudowana jest z dwóch ła

ń

cuchów:

-ła

ń

cuch A zawiera 21 reszt aminokwasów

-ła

ń

cuch b zawiera 30 reszt aminokwaso-

wych
Oba ła

ń

cuchy poł

ą

czone s

ą

dwoma most-

kami siarczkowymi a w ła

ń

cuchu A znajduje

si

ę

jeszcze jeden mostek S-S.

Insulina zwierz

ę

ca – otrzymuje si

ę

z trzustek

wieprzowych lub wołowych Insulina

ś

wi

ń

ska

ró

ż

ni si

ę

od ludzkiej tylko jednym amino-

kwasem – w miejscu treoniny w pozycji B30
wyst

ę

puje alanina. Insulina bydl

ę

ca ma

równie

ż

alanin

ę

w pozycji B30a tak

ż

e

alanin

ę

w miejsce treoniny w pozycji A8 oraz

walin

ę

w miejscu izoleucyny w pozycji A10.

Insulina krystaliczna – insulina oczyszczona
przez krystalizacj

ę

najcz

ęś

ciej kompleksu z

cynkiem (zawiera zanieczyszczenia –
proinsulin

ę

deaminoinsulin

ę

i inne produkty

rozkładu.
Insulina jednoskładnikowa – insulina dobrze
oczyszczona za pomoc

ą

s

ą

czenia moleku-

larnego, chromatografii cieczowej lub
ekstrakcji przeciwpr

ą

dowej (nazwa pochodzi

od faktu i

ż

na chromatografii HPLC jest tylko

jeden pik).
Do niedawna jedynym

ź

ródłem insuliny były

trzustki zwierz

ą

t rze

ź

nych głównie trzustki

wieprzowe i wołowe. Ze wzgl

ę

du na praco-

chłonn

ą

technologi

ę

jej wyodr

ę

bniania

wyst

ę

pował stały deficyt tego leku

Z 1kg trzustek wołowych otrzymuje si

ę

2000

IU insuliny (1mg insuliny odpowiada 24 IU)
przy czym jedna dawka lecznicza wynosi
kilkaset IU.
Mimo

ż

e cz

ą

steczki insuliny zwierz

ę

cej

ró

ż

ni

ą

si

ę

aminokwasami w niektórych

pozycjach to prawie wszystkie wykazuj

ą

podobn

ą

aktywno

ść

biologiczn

ą

i mog

ą

spełnia

ć

aktywn

ą

funkcj

ę

w organizmie

ludzkim. Czasami zdarza si

ę

i

ż

organizm

ludzki traktuje je jak obce białka- antygen,
co przy długotrwałym stosowaniu prowadzi
do szeregu reakcji alergicznych. Z tego
powodu zostały opracowane chemiczno-
biologiczne metody transformacji insuliny
zwierz

ę

cej w ludzk

ą

ale ze wzgl

ę

du na

koszty nie znalazły wi

ę

kszego zastosowa-

nia. Dopiero rozwój in

ż

ynierii genetycznej

stworzył realne podstawy produkcji. Synteza
insuliny w organizmie ludzkim rys.
Otrzymywanie insuliny metodami cDNA.
Otrzymywanie ludzkiej insuliny z wykorzy-
staniem zrekombinowanych bakterii E.coli.
Generalnie problem rozwi

ą

zano na dwa

sposoby:
-otrzymano metodami in

ż

ynierii genetycznej

oddzielnie oba ła

ń

cuchy A i B po czym

poł

ą

czono je na drodze chemicznej

-wytworzenie proinsuliny która była enzyma-
tycznie przekształcona w insulin

ę

(sposób

podobny do procesu zachodz

ą

cego natural-

nie w trzustce).
W procesie technologicznym opartym na
ł

ą

czeniu ła

ń

cuchów A i B

-opracowano procedury wprowadzania
genów do komórek bakterii, warunki hodowli
zrekombinowanych organizmów oraz
opracowano warunki izolacji i oczyszczania
peptydów A i B
-opracowano warunki ł

ą

czenia peptydów A i

B w natywn

ą

cz

ą

steczk

ę

insuliny (tworzenie

dwusiarczkowych mostków w

ś

ci

ś

le okre

ś

lo-

nych pozycjach). Produkcja ludzkiej insuliny
w komórkach E.coli.
Był to niezwykle trudny etap w opracowaniu
technologii. W wyniku niekontrolowanego
poł

ą

czenia mo

ż

e powsta

ć

bardzo wiele

izomerów w tym 3 monomery A monomer B,
57 dimerów A2 2 dimery B2 12 dimerów AB
(w tym jeden b

ę

d

ą

cy HI) a ponadto ponad

3000 trimerów i niezliczona liczba wy

ż

szych

izomerów. W praktyce w wyniku spontanicz-
nego tworzenia mostków disiarczkowych
otrzymano preparat o aktywno

ś

ci 1-2%

naturalnej insuliny. Taka wydajno

ść

była nie

do zaakceptowania w przemysłowym
procesie tworzenia leku. Opracowana
procedura polegała na wcze

ś

niejszym

przeprowadzeniu grup tiolowych w
tioestry siarczynowe, nast

ę

pnie reakcji

ł

ą

czenia ła

ń

cuchów A i B w stosunku

molowym 2:1 przeprowadzonej w obecno

ś

ci

chiralnego utleniacza zwanego odczynni-
kiem Clelada-DTTditiotretiol o wzorze
HSCH2CHOHCHOHCH2SH. Takie warunki
prowadziły do otrzymania
prawidłowej cz

ą

steczki insuliny z wydajno-

ś

ci

ą

50% liczon

ą

w stosunku do ła

ń

cucha B

Metody otrzymywania ludzkiej insuliny
-ekstrakcja z ludzkich trzustek
-chemiczna synteza via indywidualne
aminokwasy
-transformacja

ś

wi

ń

skiej insuliny semi-

synteza
-produkcja metodami in

ż

ynierii genetycznej

SEMI-SYNTEZA
-ekstrakcja insuliny

ś

wi

ń

skiej z zamro

ż

onych

tkanek
-oczyszczanie insuliny

ś

wi

ń

skiej

-biochemiczna transformacja (insulina

ś

wi

ń

ska ma alanin

ę

w B30 zamiast treoni-

ny). Transformacj

ę

wykonuje si

ę

wobec

trypsyny przy du

ż

ym nadmiarze treoniny

(najlepsze rezultaty daje ester t-butylowy)
-oczyszczanie ludzkiej insuliny aby ograni-
czy

ć

do minimum zawarto

ść

proinsuliny

-ostateczna foemulacja insuliny
Produkcja Novo Nordisk. Insulina jednoła

ń

-

cuchowa SCI (single-chain insulin).
Alternatywnym sposobem biosyntezy
ludzkiej insuliny z wykorzystaniem

rekombinowanego DNA jest technologia
oparta o wytwarzane przez dro

ż

d

ż

e peptydy

des (B30) tzw insuliny jednoła

ń

cuchowym i

jej transpeptydacja do insuliny ludzkiej. Do
komórek dro

ż

d

ż

y wprowadza si

ę

gen

prekursora insuliny czyli peptydu des(B30).
Taki peptyd był ju

ż

wcze

ś

niej znany ponie-

wa

ż

powstał z insuliny

ś

wi

ń

skiej pod

wpływem
trypsyny. Wykorzystano zatem wcze

ś

niejsze

do

ś

wiadczenia dotycz

ą

ce jego

transpeptydacji w obecno

ś

ci estru treoniny.

Najtrudniejszym etapem tego procesu jest
oczyszczanie produktu od zanieczyszcze

ń

biologicznych a w szczególno

ś

ci od obcych

białek.
Po dokonaniu poni

ż

ej wymienionych

procesów oczyszczania otrzymuje si

ę

insulin

ę

o czysto

ś

ci powy

ż

ej 99,5%

Masa

Etap procesu

Wyd.

25500 kg

fermentacja

-

14300kg

Uzyskanie

ciałek inkluzyj-

nych

90%

6250kg

Chemiczne

konwersje

(ci

ę

cie za

pomoc

ą

CNBr,

tworzenie

mostków di

siarczkowych)

procesy

oczyszczania

60%

3000kg

Enzymatyczne

konwersje

90%

15kg

Ko

ń

cowe

oczyszczanie,

jonowymienna

chromatografia

RPHPLC ,

filtracja

ż

elowa,

ultrawirowanie,

krystalizacja

60%

Diagnostyka fenyloketonurii
Fenyloketonuria- choroba polegaj

ą

ca na

zaburzeniu w przemianie aminokwasów
aromatycznych zwi

ą

zana z niedoborem

hydrolazy fenyloalaninowej (PAH). Gen PAH
wyst

ę

puje w jednej kopii i składa si

ę

z 13

egzonów (eksonów) o długo

ś

ci sumarycznej

2,3kpz i 12 intronów o długo

ś

ci 85kpz.

Fenyloketonuria to wynik zmiany jednego
aminokwasu argininy na tryptofan jako wynik
pojedynczej mutacji (->T w egzonie 12-tym).
Gen PAH ulega ekspresji w w

ą

trobie dlatego

nie mo

ż

na do wykrycia fenyloketonurii

zastosowa

ć

klasycznych metod diagnostyki

prenatalnej. Test wykonuje si

ę

po urodzeniu.

Terapia zachowawcza (dieta uboga w
aminokwasy aromatycze) wprowadzona
zaraz po urodzeniu pozwala na unikni

ę

cie

nieodwracalnych uszkodze

ń

tkanki mózgo-

wej wywołanej toksycznymi produktami
niewła

ś

ciwego metabolizmu fenyloalaniny.

W badaniach DNA członkowie rodzin
obci

ąż

onych fenyloketonuri

ą

znaleziono

polimorfizm restrykcyjny obszaru genu PAH
dla o

ś

miu enzymów restrykcyjnych m.in.

Msp I (u

ż

ycie tego enzymu do analizy

pozwala na postawienie diagnozy z
98,5%pewno

ś

ci

ą

)

SZCEPIONKI.

Mikroorganizm (drobnoustrój) - organizm
obserwowany dopiero pod mikroskopem.
Mikroorganizmami są bakterie, archeany, pierwotniaki i
niektóre grzyby.
Autotrof- organizm samodzielnie wytwarzający
związki organiczne. Dzielą się na barwne, zaw.
barwniki asymilacyjne, np. glony i bezbarwne-nie zaw.
barwników asymilac.- Zdolne do chemosyntezy dzięki
energii z red. prostych związków nieorganicznych.
Liofilizacja to suszenie sublimacyjne. Jest to jedna z
metod przechowywania drobnoustrojów, dzieli się na 2
etapy:
1) zamrożenia (1°C/min), miesz. to: suchy lód i
rozpuszczalnik, a następnie (drugi etap) sublimuje się
parę wodną pod cieśn. mniejszym od 1mmHg. Tak
przygotowany materiał przechowuje się w naczyniu pod
próżnią w lodówce w odpowiednio niskiej temp.
Koniugacja - jest to proces para seksualny u bakterii,
polegający naprze kazaniu mat. Genetycznego od dawcy
(kom męska), do biorcy (kom żeńska), poprzez
utworzenie mostka cytoplazmatycznego.
Ekspresja genu - proces, w którym informacja
genetyczna zawarta w genie zostaje odczytana i
przepisana na jego produkty, które są białkami lub
różnymi formami RNA.
Retrowirusy - rodzina wirusów, których materiał
genetyczny zawarty jest w RNA. Najdokładniej
poznanym retrowirusem jest wirus HIV.
Polimeraza DNA - enzym katalizujący syntezę DNA w
czasie replikacji lub naprawy DNA.
Transkrypcja w genetyce oznacza proces syntezy RNA
na matrycy DNA przez różne polimerazy RNA. Jest to,
zatem przepisywanie informacji zawartej w DNA na
RNA.
Bakteriofag-wirus atakujący bakterie, zbudowany z
otoczki białkowej, w której znajduje się materiał
genetyczny.
Klonowanie to proces tworzenia organizmów mających
taką samą informację genetyczną.
Gen-odcinek DNA nadający komórce zdolność do
tworzenia różnych form RNA, pośredniczy w
kodowaniu białek. Gen decyduje o przekazywaniu
poszczególnych dziedzicznych cech organizmu.
PCR-(Polymerase Chain Reaction) – łańcuchowa
reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów
DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na
sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania
próbki.
Komórka eukariotyczna - materiał genetyczny tej
komórki jest umieszczony w jądrze. Zawierające DNA z
histonami upakowane w chromosomy.
Podłoże wzbogacone-zawiera takie substancje, jak:
melasa: produkt uboczny przy produkcji cukru z
buraków cukrowych, zaw. ok. 50% cukru, a także sole
min. i witaminy. namok kukurydziany: jest źródłem
aminokwasów i peptydów. Zawiera od 45 do 55%
suchej masy, gł. związki azotowe.
serwatka: produkt uboczny z przerobu mleka na ser i
twaróg. Zawiera: wodę, tłuszcz, białko i laktozę (ok.
50%).
Sekwencja palindromowa - jest to sekwencja
rozpoznawana przez enzymy restrykcyjne.
Odczytywana z nici nonsensownej i sensownej jest taka
sama.
5' A A T T 3'
3' T T A A 5'
Kod genetyczny-to zasada, według której informacja
genetyczna, zawarta w DNA lub RNA, w komórkach
wszystkich organizmów może ulegać "tłumaczeniu" na
kolejność aminokwasów w białkach w procesie
translacji. Kod genetyczny jest: kodem trójkowym,
zdegenerowany, bezprzecinkowy, uniwersalny,
jednoznaczny, kodony nie zachodzą na siebie.
Fermentor-jest to urządzenie do przechowywania
drobnoustrojów.
Wirus krowianki-jest to wirus, który nie wywołuje u
człowieka żadnych reakcji, a dzięki temu może być
wykorzystywany w rekombinowanych szczepionkach.
Mutacja-jest to nagła zmiana materiału genetycznego.
Mutacja może być wywołana samorzutnie, lub przez
czynniki zewnętrzne.
Inżynieria genetyczna-ingerencja w materiał
genetyczny organizmów, w celu zmiany ich
właściwości dziedzicznych. Polega na wprowadzaniu do
komórek organizmu biorcy, określonego odcinka DNA
dawcy.
Biotechnologia jest interdyscyplinarną dziedziną
łączącą w sobie nauki techniczne i przyrodnicze,
obejmującą badanie, wytwarzanie i wykorzystanie
DNA/RNA, białek/enzymów, drobnoustrojów, kultur
komórkowych w procesach modyfikacji genetycznej,
biosyntezy, biotransformacji, bioutylizacji a także
wyodrębnianie i modyfikacje tak otrzymanych
bioproduktów.
Komórka prokariotyczna- komórka nie posiadająca
jądra komórkowego. Podstawowym materiałem
genetycznym jest nukleoid. Materiał genetyczny nie jest
oddzielony od reszty komórki żadną błoną.
Heterotrofy-organizmy cudzożywne, dla których
ź

ródłem energii wykorzystywanej do procesów

ż

yciowych jest pokarm w postaci gotowej materii

organicznej. Heterotrofy dzieli się na biofagi, oraz
saprobionty.
Podłoże minimalne-podłoże zawierające jedynie
związki niezbędne do wzrostu drobnoustrojów. Są
częściej stosowane w procesach badawczych niż
biotechnologicznych.
Genom-haploidalny zespół chromosomów jądra
komórkowego, zawierający określony zespół czynników
dziedzicznych (genów).
Bakulowirus- Stosowane jako broń w walce z
owadami, oraz jako wektory w inżynierii genetycznej.
Replikacja-jest to powielanie materiału genetycznego.
Enzym restrykcyjny-enzym z grupy endonukleaz
występujący w komórkach bakterii. Rozpoznaje
kreślone odcinki łańcucha DNA obcego dla komórki i
wycina je.
Ligaza-enzym restrykcyjny, łączący odcinki DNA.

Plazmid- dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA
naturalnie występująca w niektórych bakteriach.
Stosowana jako wektor w inżynierii genetycznej.
Rybosom- organelle służące do produkcji białek w
ramach translacji.
Transdukcja- Paraseksualna metoda rozmnażania
bakterii. Proces wprowadzenia nowego genu do
komórki przez wirusa.
cDNA- komplementarny DNA, cząsteczka DNA będąca
kopią sekwencji mRNA.
GMO(genetically modified organisms) - rośliny i
zwierzęta zawierające w swych komórkach włączony do
genomu gen obcego gatunku; uzyskiwane metodami
inżynierii genetycznej.
Skrining- kompleksowe postępowanie obejmujące
zespół zabiegów mających na celu: wykrycie i izolację
drobnoustrojów do badań, wstępną ocenę przydatności
do procesu.
Mutagenizacja- klasycznym sposobem wywoływania
zmian jest dokonywanie trwałych zmian genetycznych
poprzez proces mutagenizacji. Mutagenizacja
genetyczna może zwiększyć wydajność szczepu.
Antykodon-3 kolejne nukleotydy tRNA, stanowiące
jednostkę czynną w procesie syntezy białka w komórce.
Transformacja-pobranie przez organizmy jednokom.
genu z innego szczepu i włączenie go we własny
genom, co prowadzi do zmiany cech dziedzicznych.
Insulina-hormon peptydowy o działaniu
ogólnoustrojowym, odgrywający rolę głównie w
metabolizmie węglowodanów, lecz także białek i
tłuszczów.
Chromosomy-samoodtwarzające się, stałe składniki
jądra komórkowego, będące nosicielami genów.
Degeneracja kodu genetycznego-nadmiarowość kodu
genetycznego, przejawiająca się tym, że określony
aminokwas jest kodowany przez więcej niż jeden kodon
Fragmenty Okazaki- nowe krótkie odcinki DNA, które
polimeraza DNA III syntetyzuje na obu odcinkach w
procesie replikacji DNA.
Genom człowieka-kompletny zestaw informacji
genetycznej człowieka; składa się z 2 odrębnych
genomów.
Kodon- jednostka informacji genetycznej; 3 kolejne
nukleotydy w łańcuchu DNA lub mRNA, wyznaczające
rodzaj i miejsce 1 aminokwasu w łańcuchu polipeptydu
podczas biosyntezy białka w komórce.
Kodony synonimowe- kodony określające ten sam
aminokwas.
Kosmidy- sztucznie wytworzone wektory używane w
inżynierii genetycznej. Tworzy się je łącząc plazmidy z
sekwencją cos bakteriofaga lambda.
Klon- komórki będące swoimi wiernymi kopiami (o
jednakowym składzie genetycznym).
Lepkie końce- kohezyjne końce fragmentu DNA,
pociętego przez enzymy restrykcyjne w ten sposób, że
cięcia przesunięte są względem siebie o kilka
nukleotydów.
mRNA- cząsteczki informacyjne RNA powstające jako
kopie odcinków DNA podczas transkrypcji w
biosyntezie białka.
Nukleoid- obszar cytoplazmy komórek
prokariotycznych, w którym znajduje się kolista nić
DNA, nie oddzielonego żadną błoną od pozostałych
elementów tej komórki.
Nukleozydy-są zbudowane z zasady heterocyklicznej
(adenina,cytozyna,guanina,uracyl,tymina) i
odpowiedniego cukru deoksyrybozy lub rybozy w
zależności od tego w skład którego biopolimeru
wchodzą DNA czy RNA
Nukleotyd- połączenia rybozy lub deoksyrybozy,
zasady purynowej albo pirymidynowej i kwasu
fosforowego.
Nukleosom- podstawowa periodyczna podjednostka
organizacji eukariotycznej chromatyny. Tworzy ją
odcinek DNA o dł. ok. 200 par zasad oraz kompleks 8
cząsteczek zasadowych białek histonowych.
Nić opóźniona- nić DNA syntezowana w sposób
nieciągły przez odcinki Okazaki.
Odwrotna transkryptaza- proces syntezy
komplementarnej nici DNA na matrycy wirusowego
RNA, katalizowany przez enzym zw. odwrotną
transkryptazą.
Prymosom- grupa białek rozpoczynających replikację.
rRNA- rybosomowy RNA. Cząsteczki kwasu
rybonukleinowego wchodzące w skład rybosomów,
biorących udział w procesie biosyntezy polipeptydów.
Rekombinowany DNA- DNA zawierający
wprowadzone za pomocą wektorów dane sekwencje
zasad tworzące gen.
tRNA- transportujący RNA,pośredniczy w przyłączaniu
kolejnych aminokwasów w procesie biosyntezy białka.
Splicing- (z angielskiego oznacza składanie)-proces
modyfikacji nowo powstałej cząsteczki mRNA
polegający na wycięciu sekwencji RNA niekodujących
białka i połączeniu we właściwej kolejności sekwencji
kodujących.
Zasada heterocykliczna- związek organiczny
wchodzący w skład nukleozydu.