1. Wyjasnij na czym polega fermentacja beztlenowa i tlenowa.

a)fermentacja beztlenowa (własciwa); proces biologiczny rozkładu substancji organicznych przeprowadzany przez drobnoustroje w warunkach beztlenowych . glikoliza+redukcja

Fermentacja alkoholowa: Sacharomyces cervisiae

Glukoza->C2H5OH+2CO2+21kcal (2ATP)

Fermentacja mlekowa: Streptococcus,Lactobacillus

Glukoza->2CH3CHOH-COOH +22kcal (2ATP)

b)Fermentacja tlenowa (niepełne utlenianie)

Fermentacja octowa: Clostridium eceticum, Acetobacter C2H5OH+02->CH3COOH +H2O+ 118kcal2. Opisz biotechnologiczne otrzymywanie dekstranu

Etap 1 Otrzymywanie surowego dekstranu Metoda I - fermentacja.1etap - hodowla Leconostoc mesenteroides w podłożu 10-20% sacharozy, ekstraktów z drożdży, zarodki zbożowe temp.23-25 °C, pH 5-6, 1-2 doby, namnażanie komórek, synteza enzymu - dekstranosacharozy

2 etap - wydzielony roztwór stosuje się w roztworze sacharozy ,wytrącanie metanolem, etanolem lub acetonem

Etap 2 Otrzymywanie dekstranu o pożądanej wielkości cząsteczek a)hydroliza kwasowa: roztwór wodny surowego dekstranu 5-8%, temperatura 80-100 °C, pH 2, czas odpowiednio dobranyb)hydroliza enzymatyczna: roztwór surowego dekstranu temp. 45-50 °C, pH 5-6, enzym dekstranaza(wytwarzana przez Penicilinum funiculosum, Penicilinum liliacinim, Aspergillus verti), czas 2 godziny

3. Wyjasnij pojecia - trofofaza i idiofaza na wybranym przykładzie.

TROFOFAZA= I FAZA= faza intensywnego wzrostu biomasy

IDIOFAZA=II FAZA= faza produkcji (tworzenia idiodlitu) zależnosć miedzy wzrostem masy z tworzeniem produktu:

4. Opisz otrzymywanie biokatalizatorow immobilizowanych.
1.adsorpcja na nosniku2.związanie z nośnikiem wiązaniami kowalencyjnymi 3.zamnkniecie enzymu na nośniku żelowym 4.mikrokapsułkowanie 5.sieciowanie cząsteczek enzymu

5. Podaj przykłady zastosowania biokatalizatorów immobilizowanych.

a)enzymy immobilizowane:acylaza-do produkcji penicylin i cefalosporyn półsyntetycznych|| L-aminocylaza-produkcja L-aminokwasów||Galaktozydaza-usuwanie laktozy z mleka|| Izomeraza glukozowa-produkcja fruktozyb) komórki immobilizowane:Gluconobacter-produkcja wit.C ||E.coli-produkcja kw. Asparaginowego|| Acetobacter -produkcja kw. Octowego

6. Opisz sposoby otrzymywania protoplastów bakteryjnych , grzybowych i roślinnych

PROTOPLAST-kom. pozbawiona ściany komórkowej , otoczona błoną plazmatyczną 1.rozpuszczenie ściany komórkowej:bakterie (G+) = lizozym ||(G-) = lizozym , EDTA , warunki jonowe ||grzyby = sok żołądkowy ślimaka ||rośliny = enzymy celulolityczne i pektynolityczne 2.oddzielenie przez wirowaniw i sączenie

7. Opisz otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych metodą hybrydoma.
Pobranie od myszy antygenu->limfocyty śledziony myszy produkują p/ciala(slaba zdolność namnażania)+kom. Szpiczakowee(rakow)dobre namnazanie->fuzja limfocytów z kom szpiczakowymi->hybrydy->hybrydy rozwijają się jako indywidualne kolonie->selekcja hybryd produkujących swoiste przeciwciała (klonowanie) wyselekcjonowane hybrydy namnażane w kulturze na duzą skale

8. Scharakteryzuj formy pełnych przeciwciał otrzymywanych metodami biotechnologicznymi.
Formy przeciwciał:przeciwciała rekina - charakterystyczne ||bispecyficzne ||trispecyficzne ||tetraspecyficzne

9. Podaj nazwy i cechy struktury rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych fragmentarycznych
Przeciwciała monoklonalne- rodzaje:mysie - 100% mysie, immunogenne dla ludzi, oznaczenie: momab ||chimeryczne - mysi region zmienny Fr, ludzkie domeny stałe Fc, w 25% mysie, oznaczenie: ximab ||przeciwciała humanizowane - ludzkie z wyjątkiem mysich regionow hiperzmiennych (CDR), ktore decydują o specyficzności antygenowej, oznaczenie: zumab

||przeciwciała ludzkie - całkowicie ludzkie

10. Opisz otrzymywanie somatostatyny techniką inżynierii genetycznej.

11. Opisz otrzymywanie somatotropiny metodą rDNA.

Somatotropina - 191 aminokwasow rhGh - 2 łańcuchy połączone dwoma mostkami disiarczkowymi->Synteza cDNA na matrycy mRNA somatotropiny izolowanego z przysadki ludzkiej->Połączenie cDNA somatotropiny z plazmidem->Transformacja komorek E. coli lub komorek ssakow (myszy - linia komorek C127)->Produkcja somatotropiny ||rhGh r - rekombinowany h - human - ludzki Gh - grow hormon - hormon wzrostu

12. Opisz otrzymywanie insuliny techniką inżynierii genetycznej w drodze „pojedynczej fermentacji”

13.Insulina -podwojna fermentacja

15. Opisz analogi insuliny o wydłużonym działaniu otrzymywane metodami rDNA:Lantus: zamiana w pozycji A21 kwasu asparaginowego na glicynę ||Lavemir: usunięto z pozycji B30 treoninę, a do lizyny w pozycji B29 dołączono kwas tłuszczowy

14. Opisz analogi insuliny o przyśpieszonym działaniu otrzymywane metodami rDNA

- Humalog: zamiana w pozycji B28 i B29 (prolina-lizyna na lizyna-prolina)

- Noworapid: zamiana w pozycji B28 proliny na kwas asparaginowy

Humalog jest to preparat zawierający insulinę lispro

Noworapid- zawiera insulinę aspart

Po wstrzyknięciu poziom insuliny w osoczu zmniejsza się wolniej niż jest to fizjologicznie konieczne, wskutek tego istnieje niebezpieczeństwo hiperinsulinomii. Wolniejsze zwiększenie stężenia wynika z czasu niezbędnego, aby nastapiła dysocjacja hekasmeru insuliny do farmakologicznie aktywnych dimerów i monomerów. By przyspieszyć ten proces, skonstruowano dużą liczbę mutein insuliny, które wciąż są aktywne biologiczne, ale wykazują szybszą dysocjację heksametrów w roztworze. Wśród tych szybko działających analogów insuliny są: INSULINA LISPRO - w której - analogicznie do występującego naturalnie analogu insuliny, insulinopodobnego czynnika wzrostu I (IGFI)- jest zmieniona kolejność reszt aminokwasowych B28 (łańcuch B, reszta28.) i B29 oraz INSULINA ASPART, która ma w pozycji 28 łańcucha B kwas asparaginowy zamiast proliny. Obie te zmiany doprowadziły do zmniejszenia samo asocjacji. Dlatego szybciej osiągają stęż. Skuteczne farmakologiczne, toteż mogą być wstrzykiwane bezpośrednio przed posiłkiem.

16. Opisz otrzymywanie szczepionek metodami inżynierii genetycznejSzczepionki :1.klasyczne - odzjadliwione wirusy lub bakterie posiadające właściwości antygenowe; powstawanie p-ciał||2.antygenowe produkowane metodą rDNA: a)izolacja/ chemiczna synteza DNA kodującego syntezę antygenowych peptydów otoczki wirusa lub bakterii b)łączenie DNA z plazmidami c)wprowadzanie plazmidów do E.coli d)wytwarzanie cząstek antygenów przez transformowanie komórki e)przygotowanie formy farmaceutycznej wytworzonych antygenów, np. szczepionka na WZW B 3. hybrydowe -gen antygenu wirusa chorobotwórczego + DNA wirusa bezpiecznego ► wirus bezpieczny z genem wirusa chorobotwórczego ; np. szczepionka na wściekliznę 4.szczepionka DNA - nagi DNA kodujący białka wirusa/bakterii może pobudzić układ odpornościowy do produkcji p-ciał ; stosowany w chorobach zakaźnych, nowotworach, alergiach, ch. Autoimmunologicznych, malarii, HIV - próby kliniczne

17. Opisz biotechnologiczne otrzymywanie interferonów

Interferony- grupa białek hamująca replikację wirusów i biorąca udział w regulacji odpowiedzi immunologicznej

Otrzymywanie:INTERFERON α a)Z leukocytów wyodrębnia się mRNA, na którym syntetyzuje się cDNA b)Połączenie cDNA z plazmidem

c)Transformacja komórek E.coli d)Produkcja interferonu w komórkach bakterii; produkt skłąda się z 165 aminokwasów

e)Oczyszczanie metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie z p-ciałem monoklonalnym specyficznym dla określonego interferonu INTERFERON β

a)Izolacja mRNA z ludzkich fibroblastów b)Synteza za pomocą odwrotnej transkrypcji Dalej j. w. INTERFERON γ Izolacja mRNA z limfocytów j.w.

18. Omów problem glikozylacji w produkcji biofarmaceutyków w poszczególnych systemach ekspresyjnych

bakterie - białka nie są glikozylowane

grzyby - białka mogą być nadmiernie glikozylowane

rośliny - glikozylacja cukrami niewystępującymi u ssaków (fruktoza, ksyloza); immunogenne przy podaniu pozajelitowym, brak reakcji odpornosciowej po podaniu p.o.

owady - glikozylacja niekompletna lub znacznie odmienna niż u człowieka

ssaki - produkt często ale nie zawsze identyczny z naturalnym

19. opisz cechy erytropoetyn otrzymywanych metodami rDNA

Erytropoetyna (EPO) - czynnik hemopoetyczny.

Działanie: stymuluje i reguluje erytropoezę. Zastosowanie: leczenie anemii.

Gen EPO: 4 introny, 5 egzonów, w 7 chromosomie. Struktura: glikoproteina, 166 aminokwasów, masa cząsteczkowa 36kDa, 40% glikany: 3N-glikany i 1O-glikany.

Produkcja biotecznologiczna → gen EPO → komórki CHO → rhEPO N-glikan max 4 reszty kwasu sialowego

O-gilkan max 2 reszty kwasu sialowego

EPO (glikoproteina EPO) - posiada 3N-glikany i 1O-glikan

EPO II generacji (Arnasep, Darboprotein α) posiada dodatkowo 2N-glikany (raz w tygodniu zamiast trzy razy) - terapia anemii u leczonych chemioterapią.

20. Porównaj cechy rekombinowanych kwasów nukleinowych Macugen i Vitravene :Macugen- syntetyczny oligonukleotyd wiążący się z naczyniowym czynnikiem wzrostu śródbłonka

Vitravene- syntetyczny antysensowny oligonukleotyd RNA, sekwencja komplementarna do mRNA wirusa

21. Opisz rodzaje modyfikacji białek terapeutycznych mających na celu przedłużenie ich okresu półtrwania in-vivo:

a) PEG-ylcja: kowalencyjne przyłączenie glikoli polietylenowych.

-) PEGylowana L-asparaginaza - terapia ostrej białaczki limfoblastycznej -) PEG-Intron - terapia chronicznego WZW typu C

b) Fuzja białek: połączenie białka terapeutycznego z albuminą lub p/ciałami. -) INF-α-albumina : terapia ostrej białaczki

c) N-glikozylacja: dołączenie do białka terapeutycznego N-glikanu z kwasem sjalowym nadającym ładunek „-„ np. Erytropoetyna

22. Opisz otrzymywanie biofarmaceutyków w transgenicznych owadach:

*) Otrzymywanie szczepionki weterynaryjnej przeciwko gorączce świńskiej:

Kultura kom. owadów Spodoptera frugiperda w bioreaktorze 500 - 1000 l.-> Dodawanie rekombinowanego wirusa - bakulowirus->Oddzielenie kom. od płynu pozakomórkowego zawierającego produkt ->Dodanie środka inaktywującego wirusa - β-propiolakton->Dodatek środków pomocniczych ->Produkt handlowy *) Interferon w „Vibragen Omega”:

Hodowla owadów - jedwabnik - w gablotkach na pożywce przez 2 dni-> Inokulacja owadów rekombinowanym wirusem->

Hodowla inokulowanych owadów przez 5 dni ->Rozdrobnienie owadów->Ekstrakcja produktu i jego oczyszczanie, chromatografia powinowactwa ->Produkt handlowy

23. Opisz otrzymywanie biofarmaceutyków z transgenicznych ssakach: Produkcja biofarmaceutyków rozpoczyna się od wyizolowania określonych komórek z organizmu ssaka. Następnie otrzymuje się linię komórkową, czyli populację genetycznie identycznych komórek (klonów) pochodzących od jednej komórki rodzicielskiej. Dalej przeprowadza się modyfikacje genetyczne komórek ssaków: po uzyskaniu zrekombinowanego DNA (zawierającego interesujący nas gen) wprowadza się go do komórek gospodarza za pomocą wektora, którym często jest plazmid bakteryjny; konstrukt wektora z rekombinacyjnym DNA poddaje się amplifikacji przez wprowadzenie do szybko dzielących się bakterii (Escherichia coli), a następnie wprowadza się do genomu gospodarza. Kolejno następuje ekspresja wprowadzonego genu i tym samym powstaje produkt. Otrzymany produkt izoluje się, oczyszcza i otrzymuje się gotowy produkt.

Linie komórkowe najczęściej wykorzystywane w biotechnologii:

•CHO - jajnik chomika chińskiego

•MDCK - nerka cocker spaniela|| Komórki ssacze są stosowane do znacznej części obecnie zaaprobowanych farmaceutyków i są preferowanym systemem do produkcji na dużą skalę modyfikowanych np. glikozylowanych białek terapeutycznych, szczególnie jeśli poprawna modyfikacja białka jest niezwykle istotna dla efektu terapeutycznego.

24. Opisz otrzymywanie biofarmaceutyków w transgenicznych zwierzętach gospodarczych

25. Opisz otrzymywanie korzeni Panax ginseng metodą biotechnologiczną na skalę przemysłową.

a)Z dzikiego żeńszenia otrzymuje się kalus b)indukcja korzeni przybyszowych na kalusie c)selekcja najlepszej linii kultury korzeni przybyszowych d)kultura w bioreaktorze (45 dni)e)zbiórf)suszenie

26. Omów biosyntezę szikoniny w kulturze in vitro:

*) Szikonina: czerwony barwnik, działa p/zapalnie i p/bakteryjnie, w kosmetyce - szminki.

*) Produkcja: kultura komórek Lithospermum erythrorhizon proces 2-etapowy: I- prod. biomasy (białe komórki)

II- prod. barwnika ( czerwone komórki) zawartość produktów wtórnych w: -) roślinie 1,5% sm

-) hodowli kom. 14% sm = 1,5 g/l

27. Opisz biotechnol. Otrzymywanie β-metylodigoksyny:

β-metylodigitoksyna ->β-metylodigoksyna

zawiesina komórek D. lanata,korzenie transformowane, kom. Immobilizowane, mikrosomy immobilizowane, enzymy im mobilizowane || Hydrochinon ->arbutyna kat.jw

28. Omów metody ekspresji obcych białek (biofarmaceutyków) w roślinach:Ukierunkowana ekspresja obcych genów w roślinach:

komórki: cytosol, reticulum endoplazmatyczne, błona komórkowa, chloroplast, apoplast

organy: cała roślina, bulwy, liście, liście - gutacja, korzenie, korzenie - ryzosekrecja

29. Opisz inżynierię metaboliczną na przykładzie otrzymywania artemizyny.
Inżynieria metabolizmu wtórnego - bioinżynieria metaboliczna.

Artemizyna - lek przeciw malarii z Artemisiaannua (Bylica roczna)

Bioinżynieria w Saccharomycescerevisiae

Wykorzystywane są odpowiednie geny z Artemisiaannua

Synteza FPP (difosforanufarnezylu) przez syntetazę FPP

Przekształcenie w amorfa-4,11-dien przez syntetazę amorfadienu Dalsze przekształcenie do kwasu artemizynowego przez CYP450 , robi się to w drozdzach,wykorzystując odpowiednie geny z artemisia annua Poza organizmem grzybów:

Półsyntetyczne utlenianie kwasu do artemizyny tlenem singletowym

30. Opisz otrzymywanie hirudyny metodą rDNA.

Hirudyna - najsilniejszy Srodek przeciwzakrzepowy

Pochodzenie: niskocząsteczkowy peptyd wydzielany naturalnie z gruczołow ślinowych pijawki

Struktura: 3 białka o symbolach HV-1, HV-2, HV-3, 65-66 aminokwasow, 3 mostki disiarczkowe, sulfonowana tyrozyna w pozycji 63 lub 64 Działanie: inhibitor trombiny Zastosowanie: Srodek przeciwzakrzepowy

Otrzymywanie genu - synteza chemiczna lub odwrotna transkrypcja a)Synteza cDNA hirudyny na matrycy mRNA lub chemicznie b)Połączenie DNA hirudyny z plazmidem c)transformacja komorek Saccharomyces cerevisiae d)Biosynteza hirudyny i wydzielanie do podłaża e)Chromatografia jonowymienna HPLC f)Dezsulfohirudyna g)Enzym sulfotransferaza tyrozyloproteinowa z pijawek lub cieląt h)hirudyna sulfonowana w pozycji 63

System rekombinowania hirudyny: Bakterie: E. coli, Streptomyces lividans ||Drożdże: Saccharomyces cerevisiae - zastosowanie lecznicze, Hansenula polymorpha i picchia pastoris - duża wydajność ||Grzyby: Acremonium, Chrysogenum

Komorki owadow i ssakow ||Rośliny: Brassica napus - rzepak, tytoń ||Otrzymywanie hirudyny w transgenicznym rzepaku

a)Konstrukcja chimerycznego genu deozyny b)Transformacja rzepaku c)Wzrost roślin i zbior nasion d)Ekstrakcja nasion wodą

e)Wydzielanie ciał olejowych f)Rozszczepienie enzymem proteolitycznym g)Wirowanie h)Wydzielanie hirudyny

---