Przeciwciałami monoklonalnymi (mAb - ang. Monoclonal AntiBodies) nazywamy zbiór takich przeciwciał, które wykazują jednakową swoistość względem danego antygenu i ewentualnie takie samo lub podobne powinowactwo. Nazwa wywodzi się stąd, że wszystkie takie przeciwciała są otrzymywane z jednego klonu limfocytów B. Przeciwieństwem przeciwciał monoklonalnych są przeciwciała poliklonalne, czyli takie, które wiążą różne antygeny i względem tego samego antygenu wykazują różne powinowactwo. Analogicznie: surowica zawierająca przeciwciała monoklonalne to surowica monoklonalna, zaś surowica zawierająca przeciwciała poliklonalne to surowica poliklonalna.
Przeciwciała monoklonalne zostały otrzymane po raz pierwszy przez Cesara Milsteina oraz Georgesa Koehlera w 1975 roku. Są stosowane w diagnostyce w wielu metodach badawczych, próbuje się także stosować je w nowych metodach terapeutycznych, zwłaszcza dotyczących leczenia nowotworów.
Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych
Klasyczna metoda produkcji przeciwciał monoklonalnych opiera się na fuzji komórek szpiczakowych z limfocytami B o żądanej swoistości. Zamysł takiego postępowania polega na połączeniu komórki nowotworowej, obdarzonej "nieśmiertelnością" (czyli zdolnością do nieograniczonej liczby podziałów) i dostarczającej rybosomów, z komórką B o znanej swoistości. Limfocyty B pozyskuje się z krwi myszy, które wcześniej zaszczepiono antygenem, przeciwko któremu chce się otrzymać przeciwciała monoklonalne. Zakłada się przy tym, że komórka hybrydoma będzie wykazywać swoistość limfocytu B, a nie komórki szpiczakowej. Żeby jednak mieć pewność co do wyniku, stosuje się następujące kroki:
wybiera się tylko takie komórki szpiczaka, które produkują tylko łańcuch ciężki immunoglobulin lub nie produkują immunoglobulin w ogóle
komórki szpiczaka uszkadza się w ten sposób, żeby nie mogły produkować np. jakiegoś niezbędnego do życia enzymu. Fuzja dostarczy im tego enzymu, gdyż używane do niej limfocyty B będą go zawierać. Najczęściej stosuje się linie z uszkodzonym genem fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (HGPRT), która jest zaangażowana w syntezę puryn.
komórki hybrydoma hoduje się w selektywnym płynie hodowlanym, który nie zawiera substancji będącej produktem uszkodzonego enzymu. W ten sposób komórki szpiczaka, które nie uległy fuzji z limfocytem B z pewnością zginą. W przypadku zastosowania komórek HGPRT należy dodać do podłoża aminopterynę, która uniemożliwia zajście syntezy puryn alternatywną drogą metaboliczną.
płyn hodowlany nie może zawierać cytokin, które utrzymują przy życiu limfocyty B. Dzięki temu limfocyty B, które nie uległy fuzji, ulegną apoptozie.
po paru dniach hodowli komórki rozmieszcza się w osobnych naczyńkach tak, że przeciwciała w danym naczyńku będą pochodzić tylko i wyłącznie z jednego klonu komórek szpiczakowych, będą zatem przeciwciałami monoklonalnymi.
Przeciwciała monoklonalne - to homogeniczna populacja cząsteczek przeciwciał. Jeden klon przeciwciał monoklonalnych jest złożony z identycznych łańcuchów ciężkich i lekkich. Jest więc specyficzny względem tego samego epitopu i wiąże się do niego z takim samym powinowactwem (stała dysocjacji jest identyczna dla danego epitopu). Można powiedzieć, że przeciwciała monoklonalne mają identyczny izotyp, allotyp i idiotyp.
Otrzymywanie przeciwciał monokłonalnych:
- immunizacja (poprzez podanie antygenu) zwierzęcia np.myszy
- izolacja produkujących przeciwciała komórek plazmatycznych ze śledziony
- fuzja komórek plazmatycznych z komórkami nowotworowymi szpiczaka; po fuzji otrzymuje się komórki hybrydowe, które tak jak szpiczak, są nieśmiertelne;
- selekcja klonów przeciwciał;
- hodowla wybranego klonu nieśmiertelnyhch komórek hybrydowych z którego otrzymuje się przeciwciała monoklonalne;
Wykorzystanie:
- jako standaryzowany odczynnik w badaniach naukowych i diagnostyce;
- terapeutyczne np.do immunosupresji poprzez blokowanie recepotrów na komórkach układu odporności
- w immunoobrazowaniu
Lizosom (lysosoma) - stanowią organelle komórkowe charakteryzujące się polimorfizmem, (występują wyłącznie w komórkach eukariotycznych) niewielkie (0,02-0,8 μm) struktury kuliste lub owalne, otoczone pojedynczą błoną. Zawierające enzymy rozkładające białka, kwasy nukleinowe, węglowodany i tłuszcze. Łącznie w lizosomach jest obecnych ok. 40 różnych hydrolaz. W lizosomie zachodzi nie tylko proces trawienia komórkowego wchłoniętych pokarmów, ale także rozkład niepotrzebnych już cząsteczek. Nazwę lizosom wprowadził Christian de Duve w roku 1955, wcześniej opisane były także przez Ilje Miecznikowa (1865)
Lizosomy są organellami biorącymi udział w procesie trawienia wewnątrzkomórkowego materiału egzogennego oraz endogennego. Substancje, które mają ulec strawieniu, docierają do lizosomu w pęcherzykach, w które zostają "ubrane" w trakcie pinocytozy i fagocytozy.
Błona lizosomów zawiera liczne monotopowe glikoproteidy (o długich łańcuchach i dużej ilości kwasów sialowych), liczne pompy protonowe oraz liczne białka przenośnikowe.
Wewnątrz lizosomu utrzymywane jest pH na poziomie ok. 5.
Rodzaje lizosomów:
trawienne - rozkład substancji,
magazynujące - magazynowanie substancji,
„grabarze” - rozkład obumarłych składników cytoplazmy (Pęcherzyki zawierające organelle przeznaczone do degradacji nazywa się pęcherzykami sekwestralnymi.).
W lizosomach rozkładane są na ogół białka długowieczne w odróżnieniu od proteosomów.
Enzymem markerowym (markerem) lizosomów jest kwaśna fosfataza.
Liposomy, pęcherzyki fosfolipidowe - struktury powstające samoistnie z fosfolipidów. Mają postać pęcherzyków (o wielkości 0,01-1 μm) wypełnionych wodą (lub wodnym roztworem), a otoczonych podwójną warstwą lipidową o grubości ok. 5 nm. Otoczka liposomów jest zbudowana analogicznie do błon biologicznych. Liposomy występują w organizmach żywych, np. we krwi oraz są produkowane przemysłowo.
Liposomy wytwarzane sztucznie znajdują zastosowanie głównie w przemyśle farmaceutycznym oraz kosmetycznym, a także w badaniach naukowych, jako model błony biologicznej. Wewnątrz liposomów można umieszczać roztwory lub zawiesiny wodne różnych substancji, w tym także leków i DNA. Cecha ta umożliwia stosowanie liposomów jako leków.
Modyfikowane liposomy, zawierające w otoczce białka, antygeny lub inne substancje biologiczne mogą służyć do projektowania leków działających wybiórczo na konkretną tkankę. Jeśli w błonie liposomów znajdują się określone białka, np. apolipoproteiny, dla których receptory znajdują się tylko na niektórych komórkach, wtedy liposomy wiążą się z tymi komórkami, błony fuzują (łączą się), a zawartość liposomów przedostaje się bezpośrednio do komórek, w ten sposób można leczyć wybiórczo, np. różnego rodzaju nowotwory (badania prowadzono na raku okrężnicy myszy [1]). Natomiast jeśli w liposomach znajdują się fragmenty DNA zawierające określony gen, wówczas za pomocą takiej samej metody można przenieść taki gen bezpośrednio do komórek w celach leczniczych.
Podział [
Liposomy możemy podzielić na liposomy sztuczne i liposomy naturalne.
liposomy sztuczne [
Liposomy sztuczne można podzielić pod względem rozmiaru, ilości warstw otoczki i sposobu wykonania. Wyróżnia się następujące grupy:
Liposomy z więcej niż jedną warstwą lipidową
Liposomy wielowarstwowe (ang.multillamellar vesicles) - MLV - Rozmiar: 0,4-10µm
Pęcherzyki oligolamelarne (ang.oligolamellar vesicles) - OLV - Rozmiar: 0,1-1µm
Liposomy jednowarstwowe (ang.unilamellar vesicles) - UV - Rozmiar: 0,01 - 1µm (Wszystkie zakresy wielkości)
Małe liposomy jednowarstwowe (ang.small (or sonicated) unilameller vesicles) - SUV - Rozmiar: 0,02 - 0,03µm
Duże liposomy jednowarstwowe (ang.large unilameller vesicles) - LUV - Rozmiar: 0,05 - 1µm
Olbrzymie jednowarstwowe liposomy (ang.giant unilamellar vesicles) - GUV - Rozmiar: > 1µm
Wielopęcherzykowe liposomy (ang.multivesicular vesicles) - MVV - Rozmiar: > 1µm
liposomy naturalne
W warunkach naturalnych, lipidy (cholesterol, triglicerydy i in.) transportowane są w środowisku wodnym organizmu, z krwią i płynem tkankowym w postaci cząsteczek lipoprotein. Mają one postać pęcherzyków lub dysków otoczonych podwójną lub pojedynczą warstwą lipidową błony, zbudowaną z fosfolipidów, które otacza łańcuch białka - apolipoproteiny.
Wyróżnia się różne rodzaje lipoprotein:
VLDL (ang. very low density lipoprotein tj. lipoproteina o bardzo małej gęstości; < 1,006 g/ml)
LDL (ang. low density lipoprotein tj. lipoproteina o małej gęstości; do 1,063 g/ml), która powstaje z VLDL i której obecność w surowicy wiązana jest z podwyższonym ryzykiem miażdżycy
HDL (ang. high density lipoprotein tj. lipoproteina o wysokiej gęstości; do 1,21 g/ml)
oraz
IDL (ang. intermediate density lipoprotein tj. lipoproteina o pośredniej gęstości; do 1,019 g/ml)
Wytwarzanie
Do technik formowania liposomów należą:
Wstrząsanie - powoduje powstawanie wielowarstwowych liposomów (MVL), które można następnie rozbijać na mniejsze, różnymi metodami.
Sonikacja - jest to metoda prowadząca do powstania liposomów jednowarstwowych (jedna warstwa podwójnej błony lipidowej)
badania właściwości białek błonowych
modulowania procesów zachodzących w naturalnych błonach
wbudowywania nowych składników do błony komórkowej
wprowadzania do komórek substancji trudno rozpuszczalnych i łatwo utleniających się w wodzie
jako postać leku, do terapii celowanej
wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej
w przemyśle kosmetycznym, jako nośnik substancji hydrofilowych w tłustych kremach.
GENSULINA
Podstawą produkcji jest szczep Escherichia coli zawierający plazmid
z fragmentem DNA kodującym zmodyfikowany prekursor ludzkiej insuliny. Sekwencja DNA kodująca prekursor
jest dołączona do zmodyfikowanego fragmentu genu ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej Cu/Zn (SOD). Białko
fuzyjne - pre-mini-proinsulina - jest syntetyzowana w E.coli w procesie biosyntezy w postaci ciałek inkluzyjnych.
Po zakończeniu biosyntezy wydziela sięmasębakteryjną, komórki poddaje rozbiciu, a następnie izoluje sięciałka
inkluzyjne i poddaje je foldingowi. Konstrukcja białka fuzyjnego, po jego modyfikacji bezwodnikiem cytrakonowym,
umożliwia jego przekształcenie za pomocą trypsyny. Zmodyfikowany preparat oczyszcza sięza pomocą
chromatografii jonowymiennej. Oczyszczony peptyd poddaje sięobróbce w kwaśnym środowisku, powodującym
odłączenie sięmodyfikujących lizyny grup acylowych, pochodzących od bezwodnika cytrakonowego.
Po tym etapie stosuje się następne oczyszczanie przez chromatografię kolumnową. Preparat jest następnie poddawany
transformacji enzymatycznej, po czym powstaje rekombinowana insulina, identyczna z hormonem wytwarzanym
w ludzkiej trzustce. Preparat jest oczyszczany ostatecznie przez wytrącenie surowej insuliny i następnie
drogą preparatywnej chromatografii wysokociśnieniowej (HPLC). W końcu białko krystalizuje sięi suszy pod
próżnią w warunkach zapewniających apyrogenność i czystość mikrobiologiczną produktu. Otrzymana rekombinowana
insulina ludzka ma czystość rzędu 99%. Wytworzone formy farmaceutyczne insuliny w fiolkach i wkładach
do wstrzykiwaczy to: insulina szybkodziałająca - Gensulin R - w postaci roztworu, insulina o przedłużonym
działaniu - Gensulin N - w postaci zawiesiny kompleksu protaminowego, insulina NPH, izofanowa, mieszanki
roztworu i insuliny NPH - Gensulin M10, M20, M30, M40 i M50 - o pośrednim czasie działania. Otrzymane preparaty
rekombinowanej insuliny ludzkiej spełniają wymagania Farmakopei Europejskiej oraz zaostrzone wymagania
wewnętrzne. Porównawcze badania analityczne, stabilności oraz toksykologiczne, farmakologiczne i kliniczne
oraz opinie ekspertów, przygotowane dla celów rejestracji leku wykazują, że GENSULIN jest lekiem bezpiecznym
i równoważnym lekom dopuszczonym do stosowania. Polska insulina ludzka w pełni odpowiada dostępnym
na rynku preparatom insuliny ludzkiej renomowanych firm farmaceutycznych.