Temat: Molekularne metody identyfikacji mikroorganizmów.

 

 

Wyróżniamy cztery metody identyfikacji mikroorganizmów:

 

• biochemiczną

• biofizyczną

• biologii molekularnej

• immunochemiczną

 

W naszej pracy zamierzamy przybliżyć molekularne metody identyfikacji mikroorganizmów.

 

Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii fragmentów kwasów nukleinowych :

 

Metody hybrydyzacyjne - polegają na zastosowaniu tzw. sond genetycznych.

• Sondy są to krótkie i jednoniciowe fragmenty DNA, które zawierają sekwencje unikalne dla danego organizmu

• Kwas nukleinowy, który pełni rolę sondy genetycznej jest znakowany:

1. radioaktywnym fosforem [32P] lub wodorem [3H]

2. barwnikiem fluorescencyjnym

3. enzymem

Najpopularniejsze systemy detekcji wykorzystują sondy DNA komplementarne do charakterystycznych dla identyfikowanego mikroorganizmu sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA).

Wykorzystanie rRNA zwiększa czułość oznaczenia, ponieważ występuje on w komórce bakteryjnej w dużej liczbie kopii ( od 1000 do 10000).

Inną zaletą tego rozwiązania jest dostępność informacji odnośnie sekwencji rRNA pochodzących od różnych często bardzo blisko genetycznie spokrewnionych mikroorganizmów, dzięki czemu możliwe jest otrzymywanie sond o bardzo wysokiej specyficzności.

 

Sposób postępowania:

• Bakteryjny DNA strawiono enzymami restrykcyjnymi

• Fragmenty rozdzielono w żelu agarowym metodą elektroforezy

• Fragmenty przeniesiono z żelu na błonę

• Nastąpiła denaturacja DNA

• Następnie błonę zanurzono w roztworze zawierającym jednoniciową znakowaną sondę DNA

• Odczytano wynik

 

                    Jeśli homologia kwasów nukleinowych wynosi powyżej 60%, to jest to dowód na przynależność organizmu do określonego gatunku, zaś stopień hybrydyzacji powyżej 20% wskazuje na zgodność identyfikowanego drobnoustroju z danym rodzajem, a hybrydyzacja od 1% do 5% może zachodzić między DNA lub RNA organizmów nie spokrewnionych.

 

FISH hybrydyzacja fluororescencyjna in situ

 

FISH (fluorescent in situ hybridization) jest techniką cytogenetyczną , która służy do wykrywania w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond DNA. Aby zanalizować badany materiał, konieczne jest użycie mikroskopii fluorescencyjnej

Sposób przygotowania komórek:

Aby odpowiednio przygotować komórki do badania należy usunąć cytoplazmę i utrwalić jądra komórkowe na szkiełku podstawowym. Fluorescencyjną sondę nanosi się na preparat i całość poddaje się krótkotrwałej denaturacji w podwyższonej temperaturze, a następnie kilkugodzinnej hybrydyzacji. Kolejnym etapem jest usunięcie nadmiaru niezhybrydyzowanej sondy przez kilkukrotne odpłukanie preparatu i uwidocznienie jąder komórkowych barwnikiem specyficznym dla DNA (przeważnie stosowany jest DAPI). Tak przygotowany preparat analizuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Popularnymi znacznikami fluorescencyjnymi, używanymi do znakowania sond są rodamina i fluoresceina, a także kumaryna.

Hybrydyzacja fluorescencyjna jest wykorzystywana do detekcji mikroorganizmów w materiale biologicznym.

Zalety:

• Technika uzupełniająca metody cytogenetyki klasycznej poprzez identyfikację addycji, insercji oraz chromosomów markerowych.

• Dzięki dużej rozdzielczości (< 3 Mpz, nawet do 0,5 kbz) umożliwia wykrycie submikroskopowych aberracji chromosomowych. Metoda z wyboru w diagnostyce mikrodelecji

• Umożliwia szybką analizę setek komórek (ważne w przypadku kariotypów mozaikowych)

• Umożliwia badanie aberracji chromosomowych w komórkach nie dzielących się

• Pozwala na szybkie uzyskanie wyniku ( do 24 godz.)

• Umożliwia badanie materiału archiwalnego (kostki parafinowe)

• Pozwala na badanie pojedynczej komórki (ważne w diagnostyce genetycznej preimplantacyjnej!)

Wady:

• Nie pozwala na analizę całego kariotypu

• Wysoki koszt odczynników, zwłaszcza sond molekularnych

Metody izolacji oparte o technikę PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika wynaleziona w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus. Za pracę w tej dziedzinie Kary Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla.

PCR jest stosowana praktycznie w każdej dziedzinie biologii molekularnej. Może być narzędziem w poszukiwaniu mutacji i zmienności genetycznej populacji, pozwala z niewiarygodną czułością wykazać obecność śladowej liczby komórek nowotworowych we krwi, prątków gruźlicy w plwocinie czy wirusa brodawczaka w wymazie z szyjki macicy. PCR zastępuje techniki hybrydyzacyjne w selekcji klonów z bibliotek genowych, umożliwia szybkie poszukiwanie nowych genów i ich lokalizację na chromosomach.

Technika PCR (Polymerase Chain Reaction) enzymatyczna amplifikacja (zwielokrotnienie) in vitro specyficznej sekwencji nukleotydów

• gen kodujący 16S rRNA mikroorganizmów prokariotycznych

• gen kodujący 18S rRNA mikroorganizmów eukariotycznych

 

Sposób postępowania:

• amplifikacja fragmentu DNA

Reakcja ta odzwierciedla naturalny proces replikacji i umożliwia w warunkach in vitro szybkie powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu reakcji odwrotnej transkrypcji).

Badana sekwencja DNA jest powielana przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów, z których każdy jest komplementarny do jednego końca sekwencji docelowej DNA.

Startery te są wydłużane w kierunku przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA, w cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:

• denaturacja dwuniciowej matrycy - 90-95°C,

• wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,

• synteza nici komplementarnej 68-72°C

Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cząsteczki DNA umieszczone w żelu migrują w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej elektrody, a ich szybkość zależy od wielkości cząsteczki - im mniejsze tym szybciej będą się przesuwały w żelu. Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkalujący DNA) są widoczne po naświetleniu światłem UV.

• sekwencjonowanie

Metoda polegająca na enzymatycznej replikacji jednoniciowej (denaturowanej) matrycy DNA, rozpoczynającej się od jednego startera, a kończącej wbudowaniem dideoksynukleotydu (zmodyfikowanego nukleotydu) do nowo powstałego łańcucha DNA.

• porównanie wyników z danymi zamieszczonymi w banku genów

 

5% różnica w sekwencji wystarczy dla wyodrębnienia gatunku.

 

 

Geny kodujące białka bakteryjne:

• białko szoku termicznego Hsp 70

• białko szoku termicznego Hsp 60

• syntaza asparaginylo-tRNA

• syntaza alanylo-tRNA

• dehydrogenaza glutaminianowa

• hydrolaza pirofosforanu

• podjednostka polimerazy RNA (RpoB)

• podjednostka polimerazy RNA (RpoC)

• czynniki elongacyjne: EF 1^/Tu, EF-Tu, Ef-G/2

• białka rybosomowe :L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12

• gyrazy

---