GENETYKA

1. genom człowieka - kompletny zestaw informacji genetycznej człowieka; składa się z 2 odrębnych genomów — zlokalizowanego w jądrze komórkowym genomu jądrowego oraz genomu mitochondrialnego obecnego w — mitochondriach; genom jądrowy zawiera informację o ok. 20-25 tysięcy genów i ma w sumie wielkość ok. 3 mld par zasad w każdym pojedynczym zestawie; komórka somatyczna zawiera 46 chromosomów: 22 pary chromosomów autosomalnych (autosomy) i 1 parę chromosomów płci (płciowe chromosomy) a płciowa: 23 chromosomy — 22 chromosomy autosomalne i 1 chromosom płci. Sekwencjonowanie (DNA) genomu człowieka -ustalanie kolejności zasad; Ludzki genom, czyli komplet genów mieszczący się w 23 parach chromosomów; Genom - materiał genetyczny zawarty w podstawowym (monoploidalnym) zespole chromosomów. Termin mylony jest z genotypem, czyli całością informacji genetycznej zawartej w chromosomach organizmu.

Na genom człowieka składa się 3x10 do9 nukleotydów. W pełnej sekwencji nukleotydów ludzkiego DNA wyróżnia się sekwencje :

- unikalne - stanowią 10% genomu, tu znajduję się info o genach kodujących podstawowe funkcje org

- powtórzone - stanowią 10-20% genomu; nie koduja białek

- stanowiące 80% genomu o nieznanej funkcji

Sekwencje powtórzone → rozproszone → krótkie 130-300 nukleotydów

→ długie

→ tandemowe → minisatelity 10-100 nkl MLP

→ mikrosatelity 1-6, 2-6 nkl SLP

● Sekwencje tandemowe (satelitarne) to zblokowane seryjne powtórzenia krótkiej sekwencji nukleotydów

● Minisatelity - to bloki wielokrotnych, zblokowanych kopii w których powtarzający się motyw zawiera od

10-100 nukleotydów-nkl. W genomie człowieka znajduje się kilkatysięcy loci dla minisatalitów,

sondy Jeffreya - wykorzystywane w badaniu pokrewieństwa członków danej rodziny

jednostki rdzeniowe złożone z 7-100pz powtarzaja się pojedynczym locus 2-kilkaset razy

9-100pz w jednym locus od 10-100x?

● mikrosatelity - to sekwencje tandemowe w których podstawowy motyw zawiera od 1-6 nukleotydów i

powtarza się w pojedynczym locus 5-100x. mikrosatelity rozłożone są równomiernie co 6-10 kpz również w

obszarach zajmowanych przez geny. W genach najczęściej zlokalizowane są w sekwencjach flankujących i

intronach, chociaż spotykane są też w sekwencjach kodujących. Charakteryzują się niską częstością mutacji

w kom rozrodczych i somatycznych

1-7pz w jednym locus od 5-100x co 6-10 k.p.z.

* polimorfizm pojedynczych nukleotydów - SNP

* polimorfizm sekwencji minisatelitarnych określany jest skrótem - VNTR

* polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych - SSLP lub STRP

wysoka zmienność liczby powtarzających się motywów powoduje że mini i mikrosatelity sa wspaniałymi

markerami genetycznymi i wykorzystuje się je w analizie dziedziczenia badanych genow.

* Polimorfizm sekwencji nukleotydów we frag DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne opisywany

jest jako zmienność długości frag restrykcyjnych - RFLP. Analiza restrykcyjna (RFLP) umożliwia

identyfikację wszelkiego typu zmian w DNA zarówno mutacji punktowych, sekwencji powtórzonych jak

rearanżacji w obrębie genu. Badanie polimorfizmu długości frag restrykcyjnych wykonuje się metoda

hybrydyzacji co wymaga znacznej ilości 2-4µg nie zdegradowanych cząsteczek DNA. Uzyskanie ze śladów

biol niezbędnej ilości DNA do tych badań jest często nie możliwe

Jako kryterium odróżniające zmianę polimorficzną od mutacji przyjmuje się także częstośc jej wyst. Jeżeli w pop zmiana sekwencji nukleotydow wyst częściej niż 10% to uważa się ją za zmianę polimorficzną

Wybór loci polimorficznych odpowiednich do ekspertyzy genetycznej na potrzeby sadowe musi uwzględniać kryteria do których należą - stopień heterozygotyczności, częstość alleli, częstośc mutacji, możliwość fenotypowania i genotypowania, ryzyko błędu

2. genom -fałszywe - każda komórka posiada cały genom

3. genow - fałszywe - w każdej komórce ta sama ilość materiału

Wszystkie komórki organizmu człowieka, poza gametami, zawierają pełną informację

genetyczną w postaci DNA zlokalizowanego w jądrze komórkowym. Całość informacji genetycznej

zawartej w chromosomach jądra komórkowego określana jest genomem.

4. w genomie ludzkim - fragmenty kodujące-eksony-5%; fragmenty niekodujące-introny-95%

5. genetyka 13p……ter - chromosom 13 ramie krótkie…. Prążek terminalny

6. układ ABO, Rh

7. Locus (gen?) dla 19-B subs. grupowych ABO zawiera info dotyczące - transferazy D-galaktozy

8. dawca Rh+, biorca Rh-, odp. Miał „dd”

9. dawca Rh+, biorca Rh- genotypy?

10. uczulenie antygenu Rh nie może wystąpić w wyniku - kontaktu sex kobiety Rh- z mężczyzna Rh+?

11. serologia - konflikt serologiczny

12. jak powstają p/ciała α i β w układzie ABO - tworzą się naturalnie w rozwoju osobniczym

13. heterozygota

Heterozygota to organizm posiadający zróżnicowane allele tego samego genu (np. Aa), w tym samym locus na chromosomach homologicznych. Gamety osobnika heterozygotycznego mogą być różne, tzn. mogą zawierać zupełnie odmienny materiał genetyczny.

Określenie "heterozygota" implikuje, że dany gen może występować w co najmniej dwóch postaciach. Kombinacja Aa oznacza, że jeden allel genu ma charakter dominujący (A) nad drugim (a), to znaczy, że w fenotypie osobnika heterozygotycznego będzie on w jakiś sposób brał przewagę nad allelem recesywnym.

U ludzi niektóre choroby genetyczne są uwarunkowane obecnością allelu recesywnego, a zatem ujawniają się w osobnikach homozygotycznych, a nie ujawniają w heterozygotach. Niektóre choroby uwarunkowane są zaś obecnością allelu dominującego, więc ujawniają się u heterozygot i homozygot dominujących, zaś nie u homozygot recesywnych

14. primer - RNA starterowy (inaczej primer, starter) - polinukleotydowy fragment RNA powstający z udziałem enzymu o nazwie prymaza. Do RNA starterowego dobudowywane są, z zachowaniem zasady komplementarności, dezoksyrybonukleotydy. Odbywa się to przy udziale polimerazy DNA (różnej dla prokariontów i eukariontów). Synteza odbywa się zawsze w kierunku od końca 5' do końca 3' (polarność replikacji).W reakcji PCR jako startery wykorzystuje się krótkie (ok. 20 nukleotydów) jednoniciowe syntetyczne oligonukleotydy DNA.

15. techniki analizy DNA

► enzymy restrykcyjne - rozpoznaja i przecinają tylko określone sekwencje nkl w cząst DNA. Znanych jest ok. 200 różnych en restrykcyjnych. Rozpoznaja sekwencje 4, 5, 6 lub więcej nkl (sekwencje palindromiczne). Część en restrykcyjnych przecina DNA zostawiając lepkie końce a część tępe końce; zastosowanie :

- identyfikacja mutacji i markerów polimorficznych

- sporządzanie map fizycznych cząst DNA

- wyodrębnianie i klonowanie frag DNA (genów)

►klonowanie DNA - to wyodrębnienie i namnażanie frag kw nukleinowych za pomoca wektorów którymi z reguły są cząst plazmidów lub wirusów. Zwielokrotnienie kopii danego frag kw nukleinowego otrzymuje się w wyniku samopowielania cząst wektora wraz z włączonym w jego strukturę obcym frag kw. Nul

►hybrydyzacja - łączenie komplementarnych fragmentów DNA, umożliwia lokalizacje określonych sekwencji w długiej cząst DNA. W metodzie tej porównywane mogą być frag kw nul pochodzące zarówno z tego samego jak i z róznych organizmów

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych - zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów nukleinowych (DNA z DNA, RNA z RNA lub DNA z RNA). Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają rozdzieleniu (tzw. denaturacji) pod wpływem wysokiej temperatury lub substancji chemicznych, takich jak formamid lub mocznik. Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego, nici łączą się ponownie (renaturacja). Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji.

Zjawisko hybrydyzacji znalazło szereg użytecznych zastosowań w technikach biologii molekularnej. W szczególności, hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego (tzw. sondy molekularnej) używa się do detekcji homologicznych fragmentów podczas:

• poszukiwania nowych genów poprzez proces (klonowania genów), w przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.

• do oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną detekcję cząsteczek mRNA w technice northern.

• do globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema próbkami z wykorzystaniem macierzy genowych.

• do wizualizacji regionów ekspresji genu w organizmie w technice hybrydyzacji in situ.

• → do detekcji specyficznych fragmentów DNA w technice Southerna, np. w celu ustalenia ilości kopii danego genu w genomie, ustalenia wzoru polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP). Techniki RFLP używa się m.in. celu ustalenia ojcostwa.

W przeszłości prędkość hybrydyzacji DNA wyizolowanego z genomów dwóch różnych organizmów była używana jako miara pokrewieństwa ewolucyjnego. W ten sposób na przykład ustalono po raz pierwszy, że szympans jest najbliższym ewolucyjnie krewniakiem człowieka.

16. hybrydyzacja DNA - tworzenie dwuniciwych kompleksów między jednoniciowymi odcinkami komplementarnymi. Jedna nić pełni rolę sondy molekularnej; łączenie komplementarnych fragmentów DNA

Etapy hybrydyzacji

1. Elektroforeza w żelu.

2. Transfer na membranę nylonową (która pełni rolę "solid support").

3. Blokowanie miejsc niespecyficznie wiążących sondę.

4. Przygotowanie sondy.

5. Hybrydyzacja.

6. Odpłukanie niespecyficznie związanej sondy.

7. (7) Detekcja hybryd sondy z molekułą docelową.

17. 2 metody hybrydyzacji - znakowanie sondy w celu wykrycia badanych dwuniciowych kompleksów -

- izotopowa - towarzyszy jej autoradiografia jako metoda wykrywania sygnału

- chemiluminescencji -

18. w hybrydyzacji nie można pominąć prehybrydyzacji (komplementarna)

► powielanie fragmenty DNA - technika reakcji łańcuchowej polimerazy PCR, umozliwia ona w jednej reakcji enzymatycznej powielenie, zwielokrotnienie( amplifikację) w ciagu kilku godz określonego odc DNA w milionowych ilościach kopii

Warunki - znac sekwencje nkl obu konców, polimeraza DNA, , odczynniki, urządzenie do powielania

Startery (primery) to oligonukleotydy gdzie sekwencja jednego startera jest komplementarna do „początku”, a drugiego do „końca” powielanego fragmentu. Startery przyłączając się do komplementarnych odc nici DNA (do końców 3'OH) wyznaczają frag który ma być powielony. Od nich tez rozpoczyna się reakcja syntezy nowych nici dokonywana przez odpowiednia polimerazę DNA (w kierunku 5' do 3'). Powszechnie stosuje się polimerazy wyizolowane z bakterii termofilnych odpornych na wysokie temperatury.

1. etapy PCR

- denaturacja termiczna 92-96°, rozejście dwuniciowego DNA na jednoniciowe DNA(+) i DNA(-)

- przyłączenie starterów 40-60° (hybrydyzacja - łączenie komplementarnych frag)

- polimeryzacja 72° (synteza nowej nici pomiędzy primerami),

powtarzanie całego cyklu 20-30 razy (25-40x)

możliwe jest powielanie frag wielkości kilku tys pz

wysoka czułośc i specyficzność

19. rodzaje PCR - PCR - łańcuchowa reakcja polimeryzacji

LCR - łańcuchowa reakcja ligazy

20. PCR od końca 5'OH wiele starterów

21. reakcja PCR służy do otrzymywania dużej ilości materiału do badań z małej plamy krwi

► sekwencjonowanie DNA - najbardziej precyzyjna metodą poznania struktury DNA jest jego sekwencjonowanie. Umożliwia ono ustalenie rodzaju i kolejności nkl składających się na zapis informacji badanego frag DNA

Techniki a. metoda Sangera - enzymatyczna

b. metoda Maxama i Gilberta oparta na chemicznej denaturacji DNA

22. polimeraza DNA - hybrydyzacja do 5'OH obu końców, polimerazy DNA - w replikacji, enzymy powodujące polikondensację dezoksyrybonukleotydów na matrycy, która sa obie nici rodzicielskiego DNA. (3'OH-primery); Polimeraza DNA, główny enzym odpowiedzialny

za proces replikacji, może prowadzić syntezę nowej nici DNA tylko w jednym kierunku — od

końca 5' do końca 3'. Nic matrycowa (3' do 5'), nowo syntetyzowana nić 5' do 3'.

Polimeraza DNA - enzym katalizujący syntezę DNA w czasie replikacji lub naprawy DNA. Synteza ta polega na polimeryzacji deoksyrybonukleotydów przez wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych między nimi. Substratami do tej reakcji są nukleotydy trójfosforanowe, a jej produktem ubocznym jest pirofosforan, złożony z dwóch reszt fosforanowych.

Większość polimeraz DNA wymaga matrycy, w formie jednoniciowego DNA lub RNA, z krótkim obszarem dwuniciowym. Odcinek dwuniciowy powstaje przez przyłączenie się do jednoniciowej matrycy krótkiego komplementarnego do matrycy odcinka DNA lub RNA, zwanego primerem lub starterem (zwykle ma długość od kilku do ok. 20 nukleotydów).

Działanie typowej polimerazy DNA polega na

- wydłużaniu startera przez dobudowywanie nukleotydów komplementarnych do matrycy na końcu 3' startera, a następnie dobudowywaniu kolejnych nukleotydów.

-Wszystkie polimerazy DNA jako produktu dostarczają DNA,

- jako matrycę mogą wykorzystywać DNA lub RNA.

- Reakcja dobudowywania nukleotydów przez polimerazy DNA jest odwracalna i przy dużym nadmiarze pirofosforanu enzymy te mogłyby odrywać zamiast przyłączać deoksyrybonukleotydy.

- odwrotne transkryptazy są przedstawicielami polimeraz DNA, które bardzo wydajnie "przepisują" RNA na DNA (w procesie nazywanym odwrotną transkrypcją, w wyniku czego powstaje cDNA). Wyjątkowo też, terminalna deoksyrybonukleotydylotransferaza nie wymaga żadnej matrycy, bo dobudowuje dowolne dostępne nukleotydy na końcu łańcucha DNA

23. n-4 - powtorny poślizg polimerazy DNA

polimorfizm DNA - polega na niezwykłej zmienności materiału genetycznego, który jest charakterystyczny dla danego osobnika i warunkuje powstanie całkowicie indywidualnych cech człowieka. Te indywidualna cech nazywamy - genetic FINGERPRINTS - genetyczne odciski palców

metoda DNA FINGERPRINTING - met hybrydyzacji - metoda oznaczania polimorfizmu frag restrykcyjnych RFLP w DNA człowieka. Met ta opiera się na wykryciu frag DNA przy użyciu ez restrykcyjnych i sond molekularnych

1. pobieramy krew, odwirowujemy leukocyty, rozbijamy je i odwirowujemy jadra kom

2. rozbijamy jądra kom i wydzielamy DNA; 5 ml krwi = 500µg DNA

3. tniemy DNA enzymami restrykcyjnymi na frag restrykcyjne (ok. 7µg DNA/1ml

4. rozdział elektroforetyczny frag restrykcyjnych na żelu agarozowym

5. przeniesienie określonych frakcji na nitrocelulozową błonę technika zwana blottingiem

6. przygotowanie sondy DNA znakowanej izotopem

7. wiazanie sondy z odpowiednimi sekwencjami na blonie nylonowej

8. wypłukanie nadmiaru sondy DNA

24. Polimorfizm genetyczny oznacza występowanie w populacji dwóch lub więcej form danego genu — alleli

25. polimorfizm DNA - jednoczesne występowanie w populacji genów o różnych formach allelicznych

26. do czego służy polimorfizm DNA

27. rodzaje polimorfizmu - a. długości fragmentów restrykcyjnych - RFLP; b. powtarzalności sekwencji w danym loci - VNTR

28. Na czym polega polimorfizm m DNA - jednoczesne występowanie w populacji genów o różnych formach allelicznych;

29. polimorfizm - różnice w sekwencjach powtarzalnych

30. Polimorfizm vNTR, STR - jednostki powtarzające się alfa-6-P-Z (2-6pz?1-6?), STR na okresowe amplifikacje, jednostka powtarzająca się 2-6 par zasad, STR na drodze amplifikacji

31. Długość sekwencji w polimorfizmie STR - 2-6 nukleotydów

32. badanie polimorfizmu mtDNA nie jest pomocne przy - określaniu pokrewieństwa między wnukami a pradziadkami

33. Wyznaczając polimorfizm mitochondrialnego DNA nie można - ustalić pokrewieństwa między ojcem a córką

34. do czego służy mtDNA - odróżnic można osobniki nie spokrewnione

35. Polimorfizm DNA typu RFLP, VNTR, STR - opiera się na różnej długości fragmentów restrykcyjnych

36. etapy badania polimorfizmu DNA - izolacja, restrykcja, elektroforeza, przeniesienie na nośnik (Southerna), hybrydyzacja, odczyt

37. Immobilizacja folii - mieszanie krzyżowe, frakcja reszt tymiowych DNA z grupami aminowymi folii (to chyba jeden z etapów RFLP)

38. immobilizacja Folii - mieszanie krzyżowe, frakcja reszt tyminowych DNA z grupami aminowymi folii

39. o czym świadczy HV1 HV2 - o pochodzeniu z tego samego gatunku (organizmu?)

40. gdzie najwięcej zmienne miejsce w DNA - HV1

41. szybkość przesuwania kawałków w elektroforezie - lżejsza szybciej, dłuższa wolniej

42. W elektroforezie sekwencje różniące się ilością powtórzeń z sekwencjami flankującymi migrują - dłuższa wolniej, krótsza szybciej

43. Alleliczne fragmenty DNA zawierające różną ilość sekwencji powtarzalnych i identyczne sekwencje flankujące wędrują w polu elektrycznym - większy fragment wolniej a mniejszy szybciej

44. w elektroforezie sekwencje różniące się ilościa powtórzeń z sekwencjami flankującymi migrują - dłuższa wolniej, krótsza szybciej

45. co jest badaniem specyficznym - a. amylaza w ślinie, b. fosfataza kwaśna w nasieniu, c.NACL we łzach (d)żadna odp

46. w śladach bada się STRP - włosy ślina, krew, nasienie, tkanki; RFLP- nie bo trzeba duzo materiału

47. slady biologiczne STR - najczulsza metoda

48. co jest charakterystyczne dla STR

49. włos bez cebulki - trzeba oznaczyc SNP, modna

50. beta 60 - eliminacja wszystkimi drogami, eliminacja z krwi?; współczynnik eliminacji β-60 oznacza eliminacje alkoholu z całego organizmu?

51. do badania sladów biologicznych służą techniki - STR?

52. heteroplazmina co to - różne ilości matrycowego DNA (mt?DNA) w komórkach, wiele loci z jednej komórki, (różne sekwencje mt DNA w kom og?)

53. heteroplazja? - nie można odróżnic komórek tego samego organizmu? Tkanki?

54. Heteroplazmina - różna ilość matrycowego DNA w komórkach i wiele loci z jednej matrycy

55. obliczenie retrospektywne - A=epr?

56. w jaju znajduje się 1000x więcej DNA niż w plemniku

57. ile molekuł DNA w mitach -2

58. od czego nie zależy ilość mutacji w mtDNA - brak chromatyny

59. Długość cząsteczkowa mitochondrialnego DNA - 16500 par zasad

60. mtDNA w komórce człowieka - kilkaset do kilkutysięcy

61. DNA mitochondrialne od matki

62. gen amylogeniny

63. Czym różnią się geny amylogeniny - różna ilość sekwekwencji tandemowych X<Y delecja 6; różni się długością Y<X; delecja 6 nukleotydów z X;

64. Przy oznaczaniu mitDNA nie możemy określić pokrewieństwa pomiędzy - wnuczka-pradziadek

65. Alleliczne fragmenty DNA to - drabinka

66. Fenotyp Bombay - brak ekspresji genów A i B, brak ich aktywności, brak białka H (gr”0”)

67. multiplex PCR to duzo amplifikacji na 1 matrycy; to przyłączanie wielu starterów, reakcja amplifikacji białka fragmentami z wielu miejsc DNA matrycowego

68. Na czym polega metoda multiplex PCR - wiele loci z jednej matrycy; przylączanie wielu starterów, reakcja amplifikacji kilku fragmentów z wielu miejsc DNA matrycowego, diagn - dystrofia mięśniowa Duschenn'a

69. multiplex PCR - diag dystrofii mięśniowej Duchene'a

70. mangan aktywuje odwrotna transkryptazę

71. magnez aktywuje polimerazę

72. bufor do PCR - niezbędny Mg

73. PCR - powielanie danego fragmentu DNA

74. Co wchodzi w skład metody PCR - polimeraza termostabilna

75. co jest potrzebne do PCR - matryca, bufory, Mg, polimeraza DNA, mieszanka trójfosforanów….?

76. niezbędne składniki PCR - matryca; bufor Mg, startery 14, 25, enzymy - polimeraza, mieszanina nukleotydów , dNTP

77. co wchodzi w skaład metody PCR - polimeraza termostabilna, Mg2+

78. znaczniki izotopowe - DTP, ……

79. Etapy RFLP - izolacja DNA; restrykcja (enzym)(powyżej 6 mesięcy?); elektroforeza, denaturacja, technika southerna, immobilizacja, hybrydyzacja, autoradiografia

80. Chromatografia. Co świadczy jaka to substancja - RF stosunek drogi przebytej przez substancję do drogi fazy ruchomej (w TLC - chrom.cienkowarstwowej)

81. gen Ag-B?

82. co to VNTR

83. ?etapy VNTR (vNTR?)(namnażanie) a. (1) próbka krwi - ekstrakcja DNA chromosomowego z kom

b. restrykcja - cięcie DNA

c. rozdział elektroforetyczny na żelu agarozowym

d. przeniesienie rozdzielonych frakcji na odpowiedni filtr - nośnik Southerna

e. hybrydyzacja wyznakowanej izotopem sondy molekularnej

f. wypłukuje się filtr od nadmiaru sondy

g. (7) autoradiografia - na kliszy układ prążków charakterystyczny dla danej

osoby (fingerpin?)

84. Co to jest drabina alleli - marker wielkości

85. alleliczne fragmenty DNA to drabinka

86. wiązanie ddNTP - podczes transkrypcji powoduje zahamowanie i tworzy wiązanie dwuestrowe

87. Reakcje II rzędu - sprzęganie

88. Enzymy restrykcyjne tną - podwójną nić DNA

89. HLA - glikoproteina bioraca udział w prezentacji antygenu innym komórkom biorącym udział w odpowiedzi immunologicznej. Układ HLA jest najbardziej polimorficznym układem antygenowym człowieka. Istnienie wielu alleli związane jest z koniecznościa rozpoznawania wielkiej ilości antygenów. Kompleks genów ukł HLA umiejscowiony jest w 6 chromosomie

90. Ekspresja antygenu HLA - najsilniej wyrażona na błonach komórkowych

91. met HLA nie stosuje się do ozn. Śladów biolo

Metody i znaczenie identyfikacji polimorfizmu HLA :

- typowanie na poziomie białka - serologiczne wykorzystujące reakcje wiązania swoistych p/ciał z antygenami na powierzchni komórek, najczęściej limfocytów (swoistość antygenowa)

-. Typowanie komórkowe - identyfikacja cząsteczek MHC klasy II

- typowanie genetyczne - na poziomie DNA, typowanie HLA - wykorzystujące analizę polimorfizmu na poziomie DNA. Zalety : możliwość rozróżnienia praktycznie wszystkich alleli, znikomy odsetek błędów, łatwa standaryzacja, możliwość badania martwych komórek (np. z wysuszonej śliny)

Metody: a. metoda hybrydyzacyjna - dot blot i rewers dot blot

b. swoista w stosunku do sekwencji reakcja PCR (PCR-SSP)

c. typowanie oparte na sekwencjonowaniu DNA

Dot - blot - 1. namnożenie metoda PCR odpowiedniego fragmentu genu danej cząst. HLA

2. naniesienie (blotting) otrzymanego produkty na błone nylonową (najcz. W formie kropli -

dot)

3. inkubacja błony w r-r sondy molekularnej. wiązanie sondy - hybrydyzacja, zachodzi tylko

przy obecności w badanym DNA sekwencji odpowiadającej danej sondzie. Jako sond

używa się znakowanych 1-niciowych frag DNA komplementarnych do regionów

charakterystycznych dla poszczególnych alleli lub grup alleli

wykorzystanie typowania HLA :

- transplantologia

- diag ZZSK

- ustalanie ojcostwa

- badanie pochodzenia plam krwi na obecnie wykorzystuje się metody oparte na analizie mini- i

dowodach rzeczowych mikrosatelitarnego DNA na

92. metoda dot - blot - polimorfizm sekwencji?; RTLPm?

93. dot-blot - rozpoznawanie mutacji punktowych w sekwencji SNP

94. Gen strukturalny A2 z locus AB0 stanowi informację dla transferazy N-acetylogalaktozaminy, B- dla D-galaktozaminy

95. locus dla B - transferaza D-galaktozy

96. Postępowanie przy badaniu polimorfizmu DNA typu STR - PCR-elektroforeza-hybrydyzacja

97. Metoda chromatografii gazowej - analiza jakościowa

98. met chromatografii gazowej, „head-space” można wykonać: substancje które w Parowniku kolbowym można przeprowadzić w stan lotny/ subst lotne gazowe, polega na wydzieleniu substancji o najmniejszym powinowactwie do fazy stacjonarnej

99. chromatografia - co świadczy jaka to substancja?

100. krzyżówka A1>A2, ponieważ A1 dominuje

101. alkohol w 25% wchłania się w żołądku

102. który izotop nie jest stosowany w medycynie - tal205

103. w mieszaninie PCR niezbędny Mg2+ i Mn2+

104. w metodzie chemiluminescencji nie można oznaczyć MLS

105. plemnik 100,a oocyt 1000x więcej ma mt Dna

106. mtDNA-co nie wpływa na częstość mutacji?odp. Z....chromatyn

107. markery polimorficzne - locus

- allele

- locus heterozygotyczne, homozygotyczne

- genotyp

- profil DNA

W intronach i egzonach mogą być markery

a. największ zmienność i tranzycji-HV1(najwięcej mutacji)

b. 36.p/ciała AB?-w rozwoju osobniczy

37.multiplex PCR-jedna matryca,dużo starterów

44. 1 cząsteczka mt DNA -składa sią z 2 molek.

-chromatog.gazowa(GC)

-chromatog.gazowa lub cieczowa ze spektometrią gazową(GCMS)

-chromatografia cieniowa wysokiej rozdzielczo_ci(HPLC)

-testy immunochemiczne lub spektofoto. UV

51.zdanie nieprawidłowe dotyczące SNP - odp. dziedziczenie wieloalleliczne

52.etapy VNTR:

izolacja, restrykcja, elektroforeza, przeniesienie na folię (santerblat), sonda,

autoradiografia

59.PCR-odp. Od 3' do 5'

65.ddNTP -zahamowanie tworzenia wiązania fosfodiestrowego

73.hot spot-odp.HV1

77.mtDNA-zmienność wewnątrzkomórkowa!!!!!

78.polimorfizm mtDNA nie jest spowodowany? - odp.

101.ślina-stwierdzenie amylazy

106.PCR,określenie płci-gen amylogeniny

Kolejnośc southern - blot

Kariotyp - metafaza podziału komórki; badamy na chromosomach z prążkami G - metafazy

12p1 - chromosom 12 ramię krótkie prążek 1

15qter - chromosom 15 ramię długie cześci terminalnej

6p 13qter - chromosom 6, prążek między 13 a terminalnym ramieniem długim ?

2p 27qter - 2 chromosom ramię długie,między 27 a prażkiem terminalnym ?

108. metody wykrywania śladów krwi

109. metody oznaczania przynależności gatunkowej plam krwi - badanie białka lub mt DNA

110. metody oznaczania przynależności grupowej plam krwi

111. jakie badania można wykonać oznaczając plamy nasienia

112. met oznaczania izoaglutyniny w suchej krwi ludzkiej

113. met oznaczania antygenów ukł ABO w suchej krwi ludzkiej

114. jakie markery genetyczne można oznaczyc w plamie krwi

115. ----------------II--------------------------------- w plamie śliny

116. jakich info może udzielić biegły na podstawie badań sladów biol

117. jak należy zabezpieczyć mat biol do badan hemo-genetycznych ze szczególnym uwzględnieniem podejrzenia czynu nierządnego

118. polimorfizm DNA używany do Bad identyfikacyjnych śladów biol

119. metody badania polimorfizmu DNA w śladach biol

120. met dot-blot oznaczania polimorfizmu DOalfa?

121. technika AmpFLP oznaczania polimorfizmu STR

122. przedstaw zasady polimorfizmu w konflikcie matczyno płodowym

123. jakie Bad genetyczne wykonuje się w ekspertyzie genetycznej „spornego ojcostwa”

124. jakie dowody może pozwany o ojcostwo przedstawic w sądzie

125. scharakteryzuj polimorfizm DNA używany w badaniach genetycznych „spornego ojcostwa”

126. porównaj polimorfizm DNA z polimorfizmem klasycznych markerów krwi

127. dziedziczenie ukł ABO

128. dziedziczenie ukł RH

129. technika hybrydyzacji oznaczania polimorfizmu RFLP

130. składniki reakcji PCR i ich rola

131. rola analizy DNA w diagnostyce medycznej

132. co oznaczaja terminy - frag restrykcyjny; transkrypcja; gen alleliczny; zygota; antygen; inercja; PCR; enzym restrykcyjny; translacja; gen dominujący; fenotyp; duplikacja; egzon; intron; RFLP; gen recesywny; izoaglutynogen; hybrydyzacja; Tag polimeraza; gen wspoldominujący; delecja; VNTR; sonda molekularna; precypitacja; rehybrydyzacja

Bad kryminalistyczne sladów biologicznych

1. identyfikacja sladów biologicznych

• tkanki - krew naskórek, kości

• wydalin - mocz, kał

• wydzieliny - sperma, łzy, śliza, sluz z pochwy

• włosy paznokcie

2. pochodne gatunkowe sladu - badanie białka lub mt DNA, met immunoenzymatyczną

3. identyfikacja płci

4. stwierdzenie indywidualnych cech osobniczych pozwalających zidentyfikować daną osobę

najprostszy marker genetyczny - ukł ABO

133. etapy identyfikacji śladów biologicznych

a. izolacja DNA

b. amplifikacja

c. elektroforeza

d. przeniesienie na folię

e. hybrydyzacja

Ślady krwi

1. wykazanie obecności krwi w plamach

1. Próby wstępne - nieswoiste, nie majace znaczenia dowodowego :

• spryskanie wodą utlenioną - pienienie, wykazanie obecności Hg

• Spryskanie r-r benzydyny z H2O2 - zabarwienie ciemnoniebieskie. próba benzydynowa - czy w plamie jest krew, czuła i nieprecyzyjna

• Zjawisko luminescencji plam krwi pod wpływem hydrazydu kwasu triaminoftalowego

1. próby dowodowe - wykazanie w sposób pewny obecności krwi w badanym sladzie przez wykrycie Hg lub jej pochodnych

• metoda spektroskopowa lub spektrofotometryczna. Met spektroskopowa - najlepsza - stwierdzenie

widm pochłonnych Hg lub jej pochodnych, z reguły oznacza się hemochromogen, max

charakterystycznego dwupasmowego widma absorpcyjnego hemochromogenu przypada na 558nm oraz

528nm widzialnej części widma słonecznego. Analiza (metoda) widmowa - znajdujemy

hemochromogen, czuła i specyficzna. Fe2+

• mikrokrystaliczna

• porfirytowa - w starszych plamach krwi

2. wykazanie przynależności gatunkowej

odbywa się za pomocą surowic zawierających p/ciała swoiście precypitujące białko ludzkie; duza czułość metod

• odczyn precypitacji w żelu agarowym wg Ouchterlony'ego

• elektroimmunoprecypitacja - ustalenie przynależności gatunkowej krwi i białek

• odczyn wiazania p/ciał antyglobulinowych, czyli zmodyfikowany odczyn Coombsa

met te znajduja tez zastosowanie w ustalaniu przynależności gatunkowej innych płynów ustrojowych lub tkanek, nawet po wielu latach, jeżeli slad biol nai był poddany denaturującemu wpływowi wysokiej temperatury i wilgoci

3. ustalanie przynależności grupowej

do powszechnie stosowanych metod oznaczania antygenów czerwonokrwinkowych układu ABO należą

• metoda absorpcji - próba Holzera - posługujemy się próbkami śladu krwawego w stanie wysuszonym do którego dodajemy oddzielnie surowice wzorcowe anty-A, anty-B i anty-H. po inkubacji pobiera się z każdej probówki płyn, rozcieńcza, i dodaje homologicznych krwinek wzorcowych ( a, B lub 0 ). Stwierdzenie spadku miana aglutynacyjnego o 3 stopnie, czyli o 3 kolejne rozcieńczenia, traktuje się jako wynik pozytywny. Metoda ta wymaga sporej ilości subst śladowej - 2-10 mg suchej krwi.

metoda absorpcji Holzera do oznaczania antygenu w plamie

surowice powinno cechowac małe miano aglutynacyjne 1:16, 1:32

• metoda absorpcji - elucji - znacznie bardziej czulsza od Holzera. W metodzie tej wykorzystuje się wpływ określonej temperatury na przebieg reakcji łącznia sięantygenów i p/ciał

- ukł ABO - 4°C - inkubacja sladu z poszczególnymi surowicami, absorpcja swoistych p/ciał. p/ciała niezwiązane wypłukane lodowatym r-r NaCl; temp 56°C zachodzi Lucja (odłączenie) p/ciał uprzednio związanych z antygenami i przechodza do r-r fizjologicznego. Obecnośc p/ciał w r-r stwierdza się za pomocą homologicznych krwinek czerwonych

stosowane surowice o duzym mianie aglutynacyjnym 1:128

Elucja - jest lepsza od absorpcji do ozn. AB0

• wykrywanie izaaglutynin (ciepłochwiejne) metoda Lattesa - przeprowadza się tylko w przypadku świeżych śladów krwi (do tygodnia). Badanie polega na obserwacji aglutynacji wzorcowych krwinek A i B wokół cząsteczek śladu krwi, w próbce krwi

4. oznaczanie poszczególnych cech grupowych

markery grupowe oznaczane w śladach krwi :

- ukł ABO - trwałość - ponad rok

- G1m - białko surowicy, duza stabilność, duzy polimorfizm, wymagana niewielka ilość mat, ponad rok

- PGM1 - 2-3 msc

- Km - ponad rok

- Gc - ponad 6 msc

- Hp - ustalenie typu za pomoca elektroforezy w żelu piliakrylamidowym daje się do 4 tygodni od

powstania plamy

- AK - ponad rok

- polimorfizmy białkowe

- polimorfizmy enzymatyczne

- MN

- Rh (ograniczające się do cechy D

- ADA - 2-12 tyg

- GLO - 2-12 tyg

- EsD - 2-10 tyg

Oznaczanie antygenów ukł ABO w wyschniętej krwi możliwe jest nawet przez wiele lat, natomiast po upływie kilku dni nie udaje się oznaczyć w sladach krwi innych antygenów czerwonokrwinkowych (MN, Rh) wskutek szybkiego ich rozkładu

5. oznaczanie innych cech krwi

• ustalenie płci

- świeże slady krwi ( do miesiąca od powstania plamy) roztarte na szkle + barwnik akrydynowy,

mikroskop fluorescencyjny - poszukujemy chromosomu Y (ciałko Y) w komórkach jądrowych krwi

-starsze ślady - materiał z podłoża wypłukujemy surowicą osobnika AB, stwierdzenie 10% jader kom z

ciałkami Y - krew pochodzi od mężczyzny (46XY)

• ustalanie wieku - ustalenie czy ślad krwi pochodzi od dziecka czy os dorosłej nie jest możliwe

- krew noworodka - odmienna szybkość wędrowania Hg płodowej HgF i Hg dorosłych

HgA w czasie elektroforezy; oznaczanie obecności alfa1-fetoproteiny met

Immunoelektroforetycznymi

• wykazanie obecności gonadotropiny kosmówkowej HCG w śladzie krwi może dowodzic że pochodzi on od kobiety ciężarnej

134. zabezpieczenie śladów krwi na śniegu - gaza?

Ślady nasienia

1. ocena zewnętrzna - nieregularny kształt, szarożółta barwa, częściowe usztywnienie tkaniny, fluoryzuja w świetle nadfioletowym (podobnie fluoryzuje wydzielina pochwy, mocz, śluz z nosa)

2. próby wstępne -

• próba na obecność kwaśnej fosfatazy - (najczulsza z Pr wstępnych) -spermina pozwala na wykrycie b.

małych ilości nasienia (0,1mm2 zaplamienia na tkaninie). specyficzna bo duże stężenie 500-1000 -

krotnie od stężenia w innych płynach ustrojowych i wydzielinach.

- W odróżnieniu od kw fosfatazy erytrocytów, fosfataza w nasieniu wykazuje zanik aktywności

pod wpływem kwasu winowego. Od fosfatazy obecnej w wydzielinie pochwy różni się inna

wędrówka w elektroforezie

- Aktywność fosfatazy nasienia wprowadzonej do pochwy może utrzymywać się od kilku godz do

kilku dni u kobiet żyjących, natomiast w pochwie zmarłej ofiary gwałtu - od 7 dni do 2 miesięcy

3. próby dowodowe

• wykazanie plemników w badanym śladzie, pełną wartość dowodowa ma stwierdzenie obecności całych plemników

- po odbytym stosunku pł w tresci z pochwy można wykazac obecność plemników żywych do 5 h,

plemników martwych do 24h, a z zwłokach - do 2 tygodni

• stwierdzenie obecności izoenzymu dehydrogenazy mleczajowej LDH-X swoistego dla plemników metoda elektroforezy

• met immunoprecypitacji stwierdza się przynależnośc gatunkową badanego sladu nasienia

IV ustalenie przynależności grupowej - w nasieniu oznaczamy cechy grupowe, ulatwiające identyfikację osobnika od którego pochodzi nasienie - cechy ukł ABO, G1m, Km, PGM1, AK, GLO. Do oznaczania cech grupowych A, B, H stosuje się met absorpcji.

135. w śladzie spermy badamy - kwaśna fosfatazę, swoiste białka

136. enzymy w plemnikach

137. Bad nasienie met Florenza - I w KI + plama = kryształy

138. krzyżówka na wykluczenie ojcostwa

---