13.11.2012

Ćwiczenie 5/ Wykład

• surowica krwi jest złożonym płynem biologicznym, zawierającym 60-80g/L różnorodnych białek, których stężenie różni się nawet o 9 rzędów wielkości

• w prawidłowej surowicy występuje ok 10tys białek. Większość z nich występuje w małym stężeniu

• badamy je ponieważ są wartościowymi biomarkerami - substancje, których zmiany ilościowe lub jakościowe wskazują na obecność i naturę chorób

• zastosowanie specjalistycznych metod separacji białek, umożliwia poznanie 490 białek surowicy

• z nich około 150 odgrywa rolę w diagnostyce laboratoryjnej i w prowadzonych aktualnie badaniach naukowych

Rola białek osocza:

• dystrybucja płynów krew/ przestrzeń pozakomórkową

• hemostaza i koagulacja

• funkcje transportowe (nośniki hormonów, metabolitów, leków i innych)

• enzymy, regulatory

• białka układu odpornościowego

• składniki układu buforowego 18%

• hormony

• receptory

• materiał odżywczy i budulcowy

Stężenie białka całkowitego jest wypadkową.

Metabolizm białek

1. 75% wątroba (albumina)

2. Limfocyty w wyniku stymulacji Ag (Ig)

3. Tkanki, np.: jelita (lipoproteina, transferryna),

szpik kostny (transferryna),

gruczoły dokrewne (hormony)

synteza → obróbka potranslacyjna → przestrzen pozakomórkowa

proteoliza-glikozylacja

Czas T_1/2 białek osocza waha się:

• od kilku godzin dla białek układu krzepnięcia

• do 14 dni dla albumin

• 24 dni dla immunoglobulin.

Białka ulegają starzeniu, są wtedy wiązane przez mniej lub bardziej specyficzne receptory powierzchniowe komórkowe (LRP), pozbawione komponenty glikozydowej, zinternalizowane na drodze endocytozy i katabolizowane w lizosomach.

Degradacja białek odbywa się we wszystkich tkankach jest proporcjonalna do ich aktywności metabolicznej:

• wątroba - degradacja część glikoprotein

• skóra - albumin

• komórki śródbłonka naczyń -białka o dużej masie ( α₂makroglobulina)

• część białek osocza (ok. 5 g/dobę) przesącza się do przewodu pokarmowego, gdzie podlega strawieniu, aminokwasy są na powrót wchłaniane do krążenia wrotnego; takiej samej degradacji ulegają również endogenne białka soków trawiennych złuszczonego nabłonka przewodu pokarmowego

• drogą kłębków nerkowych - białka osocza przesączają się również do moczu pierwotnego. Gradient filtracyjny w kłębkach nerkowych dla białek osocza zależy to od masy cząsteczkowej. Dla albumin wynosi 1:1000. W ciągu doby do moczu pierwotnego przesącza się ok. 5 g albumin i wiele innych białkek drobnocząsteczkowych (α₁-antytrypsyna, α₁ kwaśna glikoproteina, wolne łańcuchy lekkie Ig, białko wiążące retinol, lizozym, β₂-mikroglobulina); większość zostaje resorbowana zwrotnie (99%) i rozkładana w komórkach kanalików nerkowych.

W efekcie - zdrowy człowiek z moczem wydala 20-80 mg białka/dobę. Nie więcej niż 30 mg albumin.

Struktury białek płynów ustrojowych

• białka proste (aminokwasy)

• białka złożone (enzymy, izoenzymy)

• glikoproteiny

• lipoproteiny

• metaloproteiny (ceruloplazmina, transferryna)

• hemoproteiny (hemoglobina, mioglobina, katalaza, POX)

• białkowe kompleksy: białko - mikrocząsteczka, białko-białko (Hb-Hp, Ag-Ab, E-I)

• polimery (krioglobuliny - polimery immunoglobulin, najczęściej IgG, które wytrącają się w niskiej temperaturze w przestrzeniach międzykomórkowych.

Wysokie MCHC przy zimnych aglutyninach !!

Jakie cechy fizyczne wykazują białka

• masa cząsteczkowa [kD] (pozwoli określić rodzaj białkomoczu)

• punkt izoelektryczny

• gęstość [g/cm3] (ultrawirowanie w lipoproteinach)

• aktywność biologiczna [U/l lub U/ml]

• stężenie [g/l, mol/l, mmol/l, %]

Czemu służy ocena białka całkowitego?

Ocena gospodarki białkowej, azotowej, wodno-elektrolitowej.

1. oznaczanie stężenia białka całkowitego, metodami chemicznymi (wykrywamy białko niezależnie od jego swoistej budowy.

2. Grupujemy białko całkowite na pewne frakcje, które to umożliwiają nam diagnozowanie kliniczne - metoda elektroforezy

I + II = proteinogram

Jedno z podstawowych badań oceniających stan zdrowia pacjenta

3. Oznaczanie stężenia poszczególnych białek do których oceny musimy odpowiednio dobrać metody (immunochemiczne)

Profile białkowe płynów ustrojowych

Rodzaj płynu

Białko całkowite

Albuminy

Immunoglobuliny

Białka należące do przestrzeni wewnątrznaczyniowej

Osocze

63-83 g/l

35-50 g/l (60% osocza)

7-15 g/l (15% osocza)

Surowica

60-80 g/l

35-50 g/l

7-15 g/l

Płyn ekskrecyjny pozanaczyniowy

Mocz

<200 mg/dobę

<30 mg/dobę

Płyn transcelularny

PMR

0,25-0,45 g/l

Ślina

2-4 g/l

Sok trzustkowy

1-3,8 g/l

Łzy

0,2-0,5 g/l

Wysięki

>30 g/l

Rozdział płynu m-r! (razem z surowicą). Stwardnienie rozsiane, stwardnienie rogów bocznych

Profile białkowe płynów ustrojowych

Zaburzenie w proporcji składu, jak i zmiany w stężeniach poszczególnych białek mogą informować o:

• nieprawidłowej funkcji narządów

• obecności procesów zapalnych

• patologiach układ immunologicznego

• chorobach nowotworowych

• chorobach mózgu czy opon m-r

Metody oznaczania białka całkowitego

Dobór metody powinien cechować się:

• szybkością

• stężeniem oczekiwanym w badanym materiale

• kosztem dokładnością

• precyzją

• ograniczenie czynników interferujących w oznaczeniu

Metody dobieramy do właściwości białek i ich stężenia w płynie biologicznym.

Zasada biuretowa

Zasada metody: winian sodowo-potasowy jest czynnikiem stabilizującym jony Ca w roztworze, które w środowisku zasadowym mogłyby się wytrącić z odczynnika w postaci wodorotlenku miedziowego.

Jony miedzanowe reagują w pH>7 z wiązaniami peptydowymi białek -CO-NH-, tworząc kompleks o zabarwieniu z ma przy ….

Postępowanie z materiałem badanym przed analizą

• krew pobierana rano, na czczo

• po wyrzepieniu i odwirowaniu surowicy oglądamy ją

• shemolizowane, żółtaczkowe, lipemiczne - wykonać próbę ślepą zmętnieniową

• dekstran, heparyna również reagują z odczynnikiem biuretowym (podanie 500 ml dekstranu podnosi stężenie białka o 8 g/l kolejnego dnia nie odnotowana wpływu na poziom białka całkowitego)

• hiperbilirubinemia podniesiona o 7 g/l wpływa znacząco na poziom białka.

Krzywa kalibracyjna

• wykonuje się przy każdej zmianie warunków pomiaru, np. zmiana lampy lub całego przyrządu pomiarowego, wykreślenie krzywej kalibracji ma na celu sprawdzenie prostoliniowości jej przebiegu

• wzorzec - przygotowana odpowiednio surowica, płyn mózgowo-rdzeniowy czy mocz, najczęściej liofilizowana wystandaryzowane przez laboratorium referencyjne z dołączoną metryczką, w której podana jest wartość rzeczywista danego składnika, najczęściej fiolka zawiera wysokie stężenie białka

• należy przygotować sobie roztwory zgodnie z regułą rozcieńczeń, krzywa kalibracyjna powinna składać się z minimum 3 punktów, najlepiej 5-6

• wzorzec powinien być jak najsilniejszy w składzie do materiału biologicznego

Metody oznaczania albumin:

• sucha chemia KODAK S

• metoda kolorymetryczna z zielenią bromokrezolową S

• moetoda kolorymetryczna z czerwienią bromokrezolową S

• metoda elektroforetyczna S

• immunofelometryczna Sp, mocz

• elektroimmunodyfuzji radialnej lub Laurella Sp, mocz

Metoda kolorymetryczna - może być w teście!!

Frakcjonowanie białek w surowicy

Hipoproteinemia - ↓ 60g/l - obrzęki

↑ 80g/l - ↑ lepkości osocza

Obniżenie stężenia białek w wyniku zahamowania ich syntezy, utraty białek lub rozcieńczenia krwi. Główną przyczyną hipoproteinemii jest ↓albumin w łożysku naczyniowym, a bardzo rzadko niedobór Ig.

Za krytyczny poziom stężenia białka całkowitego 45g/l i albumin < 20g/l. ↓ ciśnienia onkotycznego dochodzi do ucieczki wody i powstawania obrzęków.

Hipoproteinemia i hipoalbuminemia

1. stany głodzenia i niedożywienia

2. zespoły upośledzonego wchłaniania jelitowego

• choroby genetyczne (mukowiscydoza)

• choroby alergiczne i mm

• infekcje pasożytnicze

• zespoły poresekcyjne

• biegunki bakteryjne i innego pochodzenia

• zahamowanie syntezy białek w wątrobie

• uszkodzenie hepatocytów

• marskość wątroby

• nowotwory pierwotne i przerzuty do wątroby

• zespoły utraty białka

Zespoły nerkowe Zespoły żołądkowo-jelitowe

• kłębuszkowe zapalenie nerek - stany zapalne ślluzówki jelit, zwężenia,

• cukrzyca uchyłki

• zakrzepica żył nerkowych -nowotwory złośliwe

• toczeń rumieniowaty trzewny -niewydolność krążenia

Zespoły skórne Gromadzenie się płynów w jamach ciała

• rozległe oparzenia -przesięki/wysięki

• dermatoza, pęcherzyca, łuszczyca -obrzęki

-zapalenie płuc

Krwawienia krwotoki

Stany ciężkie: sepsa, urazy, choroby nowotworowe

5. przewodnienia

hipoproteinemia bez zmian stężenia albumin:

znaczącego stopnia niedobory immunologiczne


Hiperproteinemia >80g/l

prawdziwa jest zwykle wynikiem znacznie ↑ produkcji 1 lub wielu klas Ig. Hiperproteinemie z hiperalbuminemią mogą być wywołane odwodnieniem lub artefaktem (zbyt długa staza przed pobraniem krwi, pomiar po podaniu wlewu albumin przez ten sam wenflon)

hiperbilirubinemie z hipoalbuminemią mogą być wywołane:

• odwodnieniem

• artefaktem (zbyt długa staza przed pobraniem krwi, pomiar po podaniu wlewu albumin prszez ten sam wenflon)

Hiperproteinemia

1. immunoglobulinemie poliklonalne

1. Przewlekłe stany zapalne

• przewlekłe choroby wątroby (zapalenie, marskość, pierwotna marskość zółciowa)

• przewlekłe zapalenie oskrzeli

• przewlekłe zapalenie jelit (choroba Leśniowskiego- Crohna)

2. choroby autoimmunologiczne: RZS, toczeń trzewny układowy, guzkowe zapalenie okołotętnicze, zapalenia skórno-mm, sarkoidoza, choroby tarczycy

3. choroby infekcyjne spowodowane wirusami HIV, HBV, HCV, EBV i bakteriami (endocarditis, osteomyelitis, gruźlica)

4. guzy lite (nerki, jajnika, płuc, wątroby)

5. nowotwory hematologiczne (białaczki, chłoniaki) i niektóre niedokrwistości (talasemia sierpowatokrwinkowa)

2. Immunoglobulinemie monoklonalne

1. MGUS (gammopatia monoklonalna o nieustalonym znaczeniu)

2. dyskrazje plazmocytowe

• nienowotworowe (MGUS, BGUS, idiopatyczny bialkomocz, B-J)

• nowotworowe

3. limfoproliferacyjne B-komórkowe

• makroglobulinemia Waldenstrema (↑ IgM lub κ, λ )

• chłoniaki nieziarnicze

4. współistnienie z innymi chorobami podstawowymi

• guzy lite zwłaszcza w fazie metastatycznej

• choroby tkanki łącznej

• choroby skóry (pokrzywka z występowaniem Ab IgM)

5. inne (eozynofilowe zapalenie powięzi, krioglobulinemia, MDS, nabyta choroba von Willebranda)

3. Odwodnienia

4. Artefakty

Diagnostyka procesu zapalnego

odpowiedź miejscowa → gorączka i wydzielanie kortyzolu

→ leukocytoza

Odpowiedź ogólna → odpowiedź immunologiczna LiT i B

→ produkcja BOF

Elektroforeza białek surowicy

Albumina albumina

α1-globulina α1-antytrypsyna, α1-kwaśna glikoproteina, α-lipoproteina (apoA, HDL)

α2-globuliny α2-makroglobulina, haptoglobina

β1-globuliny transferyna, β-lipoproteina (apoB, LDL)

β2-globuliny frakcja C3 dopełniacza, IgA, IgG, FBG (osocze), fibrynogen

γ-globuliny IgA, IgG, IgM, CRP

Niskie TP (białko całkowite) może wskazywać na:

• zaburzenia pracy wątroby

• nerek

• inne nieprawidłowości w których białko nie jest właściwie trawione lub wchłaniane

• leki (estrogeny, doustne środki antykoncepcyjne)

Wpółczynnik albuminowo-globulinowy nieco >1 bowiem ilość albuminy jest nieco większa od ilości globulin.

Niski:

• nadmierna produkcja globulin ( w szpiczaku mnogim, choroby autoimmunologiczne)

• niewystarczające wytwarzanie albuminy (marskość wątroby)

• lub selektywną utratę albuminy z krwioobiegu (w zespole nerczycowym)\

Wysoki:

• niewystarczające wytwarzanie Ig ( w pewnych niedoborach genetycznych lub niektórych rodzajach białaczek)

W celu ostatecznego rozpoznania należy wykona bardziej swoiste oznaczenia takie jak albuminy, enzymów wątrobowych oraz elektroforezę białek surowicy.

Albumina:

• negatywne BOF

• 35-50g/l, ok 60% białek surowicy

• syntezowana w wątrobie 15g/dobę i t1/2 = 14/21 dni

Proalbumina → albumina ~ 20 min

→ 6-AA peptyd

Dziedziczona bisalbuminemia- występowanie dwóch rodzajów albumin o nieznacznie różniącej się mobilności elektroforetycznej

dziedziczona analbuminemia - (brak albuminy) bardzo rzadko występuje zjawisko. Pacjentów cechuje niskie ciśnienie tętnicze oraz występowanie umiarkowanych obrzęków.

Rola albumin:

• utrzymanie ciśnienia koloidowo-osmotycznego\

• transport cząsteczek zjonizowanych + i -

• endogennych: bilirubina, WKT, T3, T4, wit A,D,K, Ca 2+, Cu 2+, Cl-

• egzogennych (leki - kwas acetylosalicylowy, barbiturany, moczopędne, antybiotyki, sulfonamidy)

• usuwanie wolnych rodników (antyoksydant- gr SH)

• rezerwa AA w okresie głodzenia

• składnik buforu białczanowego (stały kwas)

Albumina ↓

• choroby wątroby, marskość (zahamowanie syntezy w wątrobie)

• niedożywienie i głodzenie

• wzmożony rozpad białek: gorączka , nowotwory

α1-antytrypsyna (AAT)

• dodatnie BOF późne

• inhibitor proteaz (elastazy, trypsyny, trombiny, chymotrypsyny)

• neutralizuje enzymy proteolityczne uwalnianie podczas fagocytozy przez enzymy trzustkowe. Jest dimerem zbudowanym z podjednostki M i Z tworząc 3 warianty genetyczne

• fenotyp MM 95% populacji

• fenotyp MZ 2-3%

• fenotyp ZZ 1-2%

W stanach zapalnych jej stężenie ↑ między 2-4dniem (4x) i w tym czasie można obserwować ↑ frakcji α1-globulin.

Brak w proteinogramie prążka odpowiadającego AAT może sugerować

• niedobór genetyczny

• zespoły utraty białek

• ciężkie niewydolności, które prowadzą do zahamowania produkcji AAT

Niedobór lub brak tego enzymu grozi:

• przedłużoną żółtaczką noworodków- powiększona wątroba z dużą zawartością nie uwolnionego AAT w hepatocytach może doprowadzić do marskości żółciowej zakończonej zgonem

• rozwój rozedmy płuc i rozstrzeni oskrzeli w wieku starszym - destrukcyjne działanie elastazy granulocytów na tkankę łączną płuc

Palenie

w płucach komórki fagocytujące dym papierosowy uwalniają równolegle WRT i wodę utlenioną, które unieczynniają AAT

↑ AAT ↓ AAT

• niedokrwistość z niedoboru Fe -marskość wątroby

• ciąża

• terapia estrogenami

• stany zapalne

α1-kwaśna glikoproteina

• BOF dodatnie późne

• ↑ około 5 dnia odczynu zapalego (2-3x)

• białko odpowiedzialne za wiązanie i transport progesteronu

↑ AAG ↓AAG

• przewlekłe stany zapalne -ciąża

(8x w chorobie Leśniowskiego-Crohna) -ciężkie uszkodzenia wątroby

• zawał -zespoły utraty białka

• choroba stawów -wyniszczenie, niedożywienie

• obecna w moczu w przypadku zespołów

nerczycowych

α2-makroglobulina (AMG)

• stanowi ok 1/3 białek frakcji α2

• inhibitor proteaz - wiąże nieodwracalnie chymotrypsynę, trombinę, plazminę, proteazy bakteryjne i wewnątrzkomórkowe. Kompleks taki w ciągu kilku minut jest usuwany z krążenia przez układ siateczkowo-śródbłonkowy

• dobry marker OZT - jeżeli w pierwszym oznaczeniu stężenie jego jest niskie i utrzymuje się to jest efektem jego aktywnej pracy. Jeżeli utrzymuje się na niskim poziomie stężenie zbyt długo, pogarsza to rokowanie ostrego zapalenia trzustki

• ma bardzo dużą m.cz. stąd nie przechodzi poza naczynia i nie filtruje się do moczu. Pojawienie się jej w moczu może świadczyć o przedostaniu się krwi pełnej do moczu i o mechanicznym uszkodzeniu miąższu nerki (różnicowanie hematurii kłębkowej i pozanerkowej np. kamicy nerkowej)

Haptoglobina (Hp)

• pozytywne BOF

• tetramer składający się z 2 rodzajów cząteczek- α i β występujących w 3 wariantach

Hp 1-1 β -α1- α1- β

Hp 1-2 β -α1- α2- β

Hp 2-2 β -α2- α2- β

Odpowiedzialna za:

• wiązanie nieodwracalne i transport Hb uwolnionej podczas hemolizy naczyniowej

• zabezpieczenie nerek przed uszkadzającym działaniem HGB buforowane 3g Hb

• masywna hemoliza kończy się zniknięciem Hp z krążenia i zespołem hemolityczno-moznicowym

• zabezpieczenie puli Fe w ustroju

• inhibitor proteaz serynowych i syntezy prostaglandyn w ostrych stanach zapalnych. Hp ↑w pierwszej dobie 5-6x, a po upływie 7-10 dni od uszkodzenia tkanek wraca do wartości prawidłowych

• aktywator angiogenezy

Transferyna (TRF)

• BOF

• syntezowana głównie w wątrobie i w układzie siateczkowo-śródbłonkowym, jądrach, jajnikach

• białka transportujące Fe3+ do szpiku kostnego wiąże 99% Fe surowicy krwi. W osoczu występuje w nadmiarze w stosunku do żelaza bo tylko 1/3 transferazy jest wysycona żelazem. Zapobiega to zatruciu żelazem zjonizowanym w przypadku nagłego pojawienia się go w dużej ilości w krwi

↑TRF ↓ TRF

• niedożywienie i głodzenie -ciąża

• przewlekłe uszkodzenia wątroby -terapia estrogenowa

• zespół nerczycowy -niedokrwistość z niedoboru Fe\

• enteropatie z niedoborem białka

• stany zapalne

• choroby nowotworowe

Ceruloplazmina CER

• odpowiedzialna za transport Cu2+

• pojedynczy łańcuch CER wiąże 6-7 atomów Cu 2+. Miedź do syntezy jest dostarczona do hepatocytów przez albuminę, gdzie jest włączana do CER. Genetycznie uwarunkowana wada tej czynności wątroby doprowadza do odkładania się Cu w różnych narządach, zwłaszcza w wątrobie i mózgu

• Katalizuje utlenianie Fe2+ do Fe3+ co pozwala na jego łączenie się z transferyną po wyjściu z wątroby

Białka układu dopełniacza

około 20 różnych białek, które wiążą się kaskadowo ze sobą tworząc kompleks atakujący błony komórkowe.

Immunoglobuliny

BOF

1) pozytywne α1-antytrypsyna CRP

α1-kwaśna glikoproteina SAA

α2-makroglobulina CER

haptoglobina białka dopełniacza

negatywne albumina prealbumina

transferyna białko wiążące retinol (RBP)

2. białka 1go rzutu- których stężenie ↑ już po 6h, a po 24h osiąga stężenie 100% wyższe niż wartość prawidłowa. Potem zaczyna ↓ po prawidłowo dobranym i podanym leku.

CRP, SAA

białka 2go rzutu- ich synteza rozpoczyna się po 24h od zadziałania bodźca. Maksymalne stężenie w 72h, potem zaczyna ↓

3. białka których stężenie ↑ 1000x SAA, CRP

białka, których stężenie ↑ 2-5x α1-antytrypsyna

α2-makroglobulina

fibrynogen

Hp

białka, których stężenie ↑ o 50% wartości wyjściowej - ceruloplazmina,

składniki dopełniacza

Właściwe przygotowanie pacjenta do rozdziału:

1. surowica- rozcieńczenie stosowanym buforem

• mocz, płyn m-r - historyczne zagęszczenie poprzez

• filtry Amicon w formie probóweczek uwzględniające średnicę białka, które chcemy zagęścić (płyn m-r)

• Aqvacid w woreczku dializującym zamykamy mocz. Wkładamy do zlewki i zasypujemy preparatem, który odwadnia mocz (historyczne)\

• przygotowanie aparatu do rozdziału (blackman, Cormay, Corning, Sebia)

• naniesienie surowic badanych na płytki wraz z kontrolą i wzorcami

• przeprowadzenie rozdziału elektroforetycznego (zachowanie odpowiednich warunków czasu rozdziału)

• utrwalenie (kwas, alkohol) oraz suszenie 25min

• barwienie (oraz fiksacja= przyklejenie białka do podłoża przez denaturację alkoholem

Automatyczny odczyt:

• obiektywny

• wyszukuje sam najjaśniejsze tła

• mierzy gęstości poszczególnych plam

• podłoże przesuwa się wobec źródła światła i tworzy krzywą będącą funkcją obrysowania

• sumuje strefy

Czynniki wpływające na poziom białka:

1. 
   Dotyczy pobieranego materiału i napływające wraz ze skierowaniem na badanie:

1. właściwa dokumentacja

2. Rodzaj

1. surowica/osocze

2. mocz - poranna porcja, zbiórka dobowa, zbiórka nocna, zbiórka kilkugodzinna

3. Dieta (wegetariańska - brak wpływa, obfity posiłek białkowy może spowodować wzrost stężenia białka całkowitego max o 10%)

4. Okres pobierania materiału - w okresie zimowym stężenie białka całkowitego spada o 10% w porównaniu do okresu letniego

5. Informacja o podejrzeniu danej choroby

2. Dotyczy przygotowania pacjenta

1. Okres 12 h bez posiłku (min 6-8 h) - zaburzenie ich rytmu dobowego, w ciągu dnia stężenie białka jest ok. 10% wyższe niż w nocy

2. Pozycja ciała

1. zmiana pozycji z leżącej na stojącej może po 30 minutach podnieść stężenie białka o ok. 10%

2. wysiłek fizyczny podnosi o 10%

3. pacjenci hospitalizowani mają stężenie o 5/10 g/l niższe

3. Dotyczy samego aktu pobierania

1. Najlepiej bez użycia stazy (zbyt długie zaciśnięcie stazy przy pobieraniu może po kilku minutach spowodować wzrost stężenia białka)

2. Szybkie oddzielenie surowicy od masy krwinkowej

3. Antykoagulant (heparyna ma zły wpływ na γ-globuliny)

4. Przechowywanie materiału

5. Inne

1. dostosowanie dobranej metody do oznaczania poszczególnych białek

2. aktualna i właściwa kalibracja

3. eliminowanie interferencji z powszechnie obecnych w materiale różnych związków chemicznych.

8

---